关键词：
复发性流产
IL-37
滋养细胞侵袭迁移
巨噬细胞极化
摘要：
研究背景及目的:复发性流产(Recurrent miscarriage,RM)是指在妊娠20周前,与同一配偶连续发生2次及2次以上自然流产的异常妊娠,常见于妊娠早期。除发病原因明确外,依然有约60%～70%的不明原因流产,被称之为不明原因复发性流产(Unexplained recurrent miscarriage,URM)。由于病因不明,无法选用针对性强的特异性治疗,成为了临床复发性流产的诊治难点。因此,对复发性流产的病因及机制研究意义重大。母体和胎儿的相互作用对于维持母胎免疫耐受至关重要,母胎界面的细胞类型主要有滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞。蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞来自于母体,而滋养细胞则来自于胎盘。在母胎界面中,孕早期蜕膜巨噬细胞占蜕膜总白细胞的20%～30%,是蜕膜免疫细胞中的一个重要组成部分,可参与胚胎植入、胎盘发育等生理过程,以维持妊娠的顺利进行。白细胞介素-37(Interleukin 37,IL-37)是IL-1家族的一员,作为炎症和免疫反应的天然抑制剂发挥作用。它的结构与IL-1家族的其他成员相似,由十二个β管状结构组成。IL-37的分子量约为17～25 k Da,被广泛地表达于人体各种组织,例如肺、胸腺、骨髓、胎盘以及子宫组织等。最近的研究表明,IL-37可影响多种肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。由于人类胎盘的侵袭过程和滋养层细胞的行为与恶性肿瘤细胞相似。同时,IL-37与免疫炎症性疾病的发生和发展密切相关。因此,我们推测:母胎界面表达的细胞因子IL-37是否也参与调控滋养细胞功能以及母胎免疫耐受的形成。本研究将探讨IL-37在母胎界面的表达模式及生物学意义。方法:(1)临床样本实验:收集RM患者和正常对照组妊娠早期的绒毛和蜕膜组织,通过q RT-PCR实验、免疫印迹实验(Western blot,WB)、免疫组织化学技术(IHC)以及免疫荧光技术(IF)对IL-37及其受体SIGIRR在早孕期绒毛组织以及蜕膜组织中的表达及定位进行检测。此外,通过免疫荧光(IF)技术检测正常妊娠女性和RM患者蜕膜组织中巨噬细胞表达模式,并观察其与蜕膜绒毛外滋养细胞(Extravillous trophoblast,EVT)的关系。(2)体外实验:运用IL-37重组蛋白处理HTR8/SVneo滋养细胞,并运用划痕实验和Transwell实验对滋养细胞的迁移能力和侵袭能力进行检测。WB实验检测滋养细胞凋亡相关蛋白以及EMT相关标志物的表达水平。Ed U实验检测IL-37对滋养细胞增殖能力的影响。绒毛外植体实验进一步检测IL-37对滋养细胞功能的影响。此外,体外建立M1巨噬细胞模型,通过观察细胞形态以及q RT-PCR实验验证IL-37是否可以抑制M1巨噬细胞极化以及炎症效应。运用生物信息学方法分析RNA-seq的测序数据,寻找M1巨噬细胞极化过程中可能涉及的信号通路,并加以验证。同时,运用IL-37重组蛋白处理M1巨噬细胞,WB检测相关信号通路的改变。(3)体内实验:建立正常妊娠小鼠模型和复发性流产小鼠模型,收集外周血以及蜕膜组织,原代分离获取免疫细胞,运用流式细胞术分析正常妊娠小鼠和复发性流产小鼠外周血以及蜕膜组织中CD86+巨噬细胞(M1型)及CD206+巨噬细胞(M2型)的比例。将流产小鼠分为两组,一组给予10 m L/kg无菌PBS腹腔注射处理,另一组以同样的方式给予10μg/kg IL-37重组蛋白处理。孕13.5天时,分别观察两组小鼠的胚胎吸收率,并收集两组小鼠的外周血以及蜕膜组织提取免疫细胞,利用流式细胞术分析两组小鼠M1及M2巨噬细胞的比例。结果:(1)与对照组相比,IL-37的分子及蛋白表达水平在RM组绒毛组织中均降低。且IL-37主要定位于合体滋养层细胞(Syncytiotrophoblast,STB)和细胞滋养层细胞(Cytotrophoblast,CTB)。在体外实验时,IL-37增强了HTR8/SVneo滋养细胞的侵袭和迁移能力,并促进绒毛外植体向外生长,但对HTR8/SVneo滋养细胞的增殖和凋亡没有影响。此外,IL-37可调节HTR8/SVneo滋养细胞的上皮-间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)过程。(2)与正常妊娠组相比,RM患者蜕膜组织中巨噬细胞增多,且在巨噬细胞周围有EVT细胞的富集。此外,IL-37在HLA-G阳性的EVT细胞亦有表达。M0巨噬细胞经LPS诱导处理后,细胞呈M1巨噬细胞形态特征,M1巨噬细胞标志物i NOS和巨噬细胞M1极化后释放的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平显著上调。运用IL-37重组蛋白进行干预后,细胞形态呈M0样的圆形,M1巨噬细胞标志物i NOS和巨噬细胞M1极化后释放的促炎细胞
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