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关键词： 肝癌   PD-1/PD-L1   CRISPR/Cas9系统   细胞增殖  

摘要： 背景肝癌作为全球最常见和致死率较高的恶性肿瘤之一,目前仍以手术等传统治疗方式为主。近年来,随着免疫治疗的迅猛发展,使得肿瘤治疗模式发生了巨大变化,特别是免疫检查点已成为治疗晚期癌症最具有潜力的途径之一。程序性细胞死亡蛋白1(Programmed death-1,PD-1)是研究最多的免疫检查点,其通过影响T细胞活性,发挥免疫逃逸机制。以往的研究证实,PD-1在免疫细胞高表达,与其主要配体程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)结合,诱导肝癌细胞免疫逃逸,进而导致肿瘤转移和复发。但在近期的研究中证实,肝癌细胞内源性PD-1呈过表达,对于探讨该部分PD-1在肝癌细胞中的生物学影响具有重要意义。目的利用CRISPR/Cas9系统敲除人源肝癌细胞HepG2的PD-1基因,构建PD-1基因敲除的HepG2细胞系,探讨肝癌细胞内源性PD-1对HepG2细胞生物学功能的影响。方法1.通过生物信息学、蛋白印迹法检测PD-1在肝癌细胞中的表达;利用酶切、连接等方法构建具有PD-1基因双sgRNA的CRISPR/Cas9系统敲除质粒。2.通过细胞转染、抗性筛选及有限稀释法获得HepG2-PD-1-KO细胞系,采用PCR半定量和蛋白印迹法分别检测PD-1的mRNA、蛋白表达水平。3.通过CCK8法检测HepG2-PD-1-KO细胞系增殖能力,克隆形成实验评估细胞克隆形成能力,细胞划痕检测细胞迁移能力,Transwell实验评估细胞侵袭能力,流式细胞检测术检测细胞凋亡水平。4.通过裸鼠皮下移植瘤实验,检测HepG2-PD-1-KO细胞系在体内成瘤能力和增殖情况。结果1.肝癌细胞的PD-1表达水平较肝脏正常细胞有明显升高(P<0.05),成功构建了PD-1基因敲除的双sgRNA重组质粒。2.将构建成功的敲除质粒转染肝癌细胞HepG2,通过抗性筛选、有限稀释法获得单克细胞隆株,经基因测序证实了PD-1基因成功敲除;PD-1基因的mRNA、蛋白表达水平明显降低(P<0.05),最终获得HepG2-PD-1-KO细胞系。***8实验、克隆形成实验证实HepG2-PD-1-KO细胞系的增殖能力较野生型细胞减弱(P<0.05),细胞划痕、Transwell实验结果表明HepG2-PD-1-KO细胞的迁移、侵袭能力降低(P<0.05),流式细胞术检测结果表明两组细胞的凋亡水平无明显差异(P>0.05)。4.在裸鼠成瘤实验中,HepG2-PD-1-KO细胞系的肿瘤体积较HepG2-WT细胞明显减小(P<0.05),肿瘤增殖在体内受到抑制。结论通过CRISPR/Cas9系统获得了HepG2-PD-1-KO稳定细胞系。PD-1基因敲除可以显著抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,肝癌细胞内源性PD-1基因缺失可有效抑制HepG2肿瘤细胞的体内外生长。

关键词： 遗传性牙釉质发育不全   FAM83H   成釉细胞   细胞外基质  

摘要： 遗传性牙釉质发育不全(amelogenesis imperfecta,AI)是一组以牙釉质发育缺陷为特征的具有临床异质性的遗传性疾病。目前已发现多种基因突变可导致AI,其中序列相似家族83H基因(family with sequence similarity 83 member H,FAM83H)突变引起AI的比例最高。FAM83H基因鉴定的36个致病性突变均发生在第5外显子,导致蛋白质翻译过早终止。尽管目前研究证明了FAM83H与AI之间的相关性,但其基因突变对成釉细胞的影响及其导致AI的致病机制尚不清楚。 本研究通过免疫组织化学染色定位了FAM83H蛋白在大鼠下颌切牙不同时期成釉细胞的表达。通过si RNA转染技术构建了Fam83h敲低的成釉细胞系HAT-7细胞并进行转录组测序,初步探究Fam83h对成釉细胞基因表达的影响。对转录组测序结果进行基础生信分析后,通过细胞粘附试剂盒、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应及蛋白质印迹法检测Fam83h对成釉细胞粘附能力、整合素及细胞外基质表达的影响。 研究结果发现SD大鼠下颌切牙可以观察到FAM83H蛋白表达于各个时期的成釉细胞,并且在前分泌期及分泌期的表达增强。转录组测序结果表明,Fam83h基因敲低后,HAT-7细胞中共检测到573个基因差异表达。GO和KEGG富集分析结果显示Fam83h可以影响成釉细胞胶原蛋白的合成以及影响细胞粘着斑通路,进行细胞粘附试剂盒、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应及蛋白质印迹法实验结果表明Fam83h可影响成釉细胞粘附能力及整合素基因的表达,也可影响釉质基质蛋白、釉质蛋白酶、胶原蛋白等细胞外基质的合成,从而引起AI的发生。 综上,FAM83H蛋白强表达于前分泌期和分泌期的成釉细胞,可能通过调控成釉细胞细胞外基质蛋白的合成及粘附能力影响牙釉质的形成。

关键词： 肝细胞癌   环状RNA   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：1.检测环状RNA（circular RNA，circRNA）hsa_circ_0016863在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血浆、组织及细胞株中的表达，探讨血浆hsa_circ_0016863在HCC临床诊疗中的价值;2.探讨hsa_circ_0016863对HCC细胞生物学行为的影响;3.分析hsa_circ_0016863促进HCC进展的机制。　　方法：1.基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中筛选差异表达的circRNA;2.建立实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测hsa_circ_0016863表达量的方法并进行性能评价;***测序、琼脂糖凝胶电泳、Rnase R酶消化实验、放线菌素D实验来验证hsa_circ_0016863的环状结构及其稳定性;4.通过临床病理参数相关性分析、术前术后血浆hsa_circ_0016863表达变化以及绘制生存曲线探讨血浆hsa_circ_0016863对HCC的临床诊疗价值;***-PCR检测hsa_circ_0016863在HCC组织和细胞株中的相对表达及亚细胞定位;6.分别构建hsa_circ_0016863的干扰载体和过表达载体，并通过qRT-PCR验证其转染效率;***-8、克隆形成、Transwell、细胞周期及细胞凋亡实验检测hsa_circ_0016863对HCC细胞增殖、迁移、侵袭、周期及凋亡的影响;8.通过circinteractome和starbase数据库预测hsa_circ_0016863下游的miRNA，通过miRDB、mirDIP、ENCORI、TarBase数据库预测miRNA的靶mRNA，并绘制circRNA-miRNA-mRNA网络图;9.通过Sangerbox3.0对靶mRNA进行GO富集分析和KEGG分析;10.结合TCGA、ENCORI和miRDB数据库，进一步分析hsa_circ_0016863与靶miRNA、miRNA与靶mRNA的相关性。　　结果：1.从GEO数据库中筛选出在HCC中高表达的hsa_circ_0016863;***-PCR检测hsa_circ_0016863的熔解曲线单峰特异，琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序证实其引物设计正确;放线菌素D和Rnase R酶消化实验证实hsa_circ_0016863具有稳定的环状结构;***患者血浆中hsa_circ_0016863表达升高，与肿瘤直径（P=0.013）、分化程度（P=0.012）和TNM分期（P=0.003）相关。动态监测发现术后HCC患者血浆hsa_circ_0016863含量明显下降，而且血浆hsa_circ_0016863表达高的患者生存时间越短;***_circ_0016863在HCC患者癌组织及HCC细胞株中高表达;5.构建hsa_circ_0016863的干扰载体（sh-circ），转染HCCLM3细胞后，hsa_circ_0016863表达下降;构建hsa_circ_0016863过表达载体（ov），转染SMMC-7721细胞后，hsa_circ_0016863表达升高;6.转染sh-circ后的HCCLM3细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力下降，细胞凋亡能力增强，细胞周期阻滞在G0/G1期;转染ov后的SMMC-7721细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力增强，细胞凋亡能力减弱，细胞周期进展加速;7.核质分离实验显示hsa_circ_0016863主要定位于细胞质，提示hsa_circ_0016863可能作为竞争性内源RNA（ceRNA）;8.构建以hsa_circ_0016863为中心的circRNA-miRNA-mRNA调控网络;***富集分析和KEGG分析表明，hsa_circ_0016863的下游mRNA基因主要富集在“p53信号通路”上;10.通过相关性分析，初步确定了hsa_circ_0016863可通过调节hsa-miR-576-5p介导的CDK6促进HCC发生发展。　　结论：HCC初诊患者血浆hsa_circ_0016863表达显著升高，与不良预后相关，提示其可能是一个潜在的HCC临床生物标志物;hsa_circ_0016863在HCC组织和细胞株中高表达，与HCC细胞增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡有关;hsa_circ_0016863/hsa-miR-576-5p/CDK6轴可能通过p53信号通路调控HCC的进展。

关键词： 大鼠   牙周膜   牙槽窝   间充质干细胞   P75神经营养因子受体   生物学特性  

摘要： 目的:提取大鼠牙槽窝干细胞(dental socket derived stem cells,DSCs)和大鼠牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),在体外探讨PDLSCs和DSCs的部分生物学特性的差异,以选择更优的种子细胞,为牙发育与牙周缺损再生修复打下基础。方法:(1)建立大鼠拔牙后的牙槽窝模型,苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察拔牙术后即刻与拔牙后第1、3、7天的牙槽窝组织形态,并用免疫组织化学法,检测在牙槽窝内P75神经营养因子受体(P75 Neurotrophin receptor,P75NTR)的表达与分布情况。(2)细胞的制取:观察大鼠牙槽窝的愈合组织(Extraction socket-derived early healing tissue,ESEHT)的形成情况,结合HE染色与免疫组织化学染色结果,选择最佳时间点的ESEHT,提取大鼠DSCs;另拔除大鼠切牙分离出PDLSCs,流式细胞仪鉴定PDLSCs与DSCs的表型。(3)增殖、克隆形成与多向分化能力:用CCK-8法和克隆形成检测对比PDLSCs与DSCs的差异;PDLSCs与DSCs进行成脂与成骨诱导,分别用油红O染色,与ALP及茜素红染色,并用RT-PCR及Western blot检测PDLSCs与DSCs成骨相关基因及蛋白表达情况,比较成骨分化能力的差异。结果:(1)建模后的大鼠拔牙创口愈合良好,逐渐形成一定形状的ESEHT,尤其在第3天时最为明显;HE染色结果中,拔牙术后3天的牙槽窝内,观察到大量的纤维结缔组织增生,而拔牙术后第1天的牙槽窝内未见结缔组织,拔牙术后第7天则骨组织愈合明显,骨小梁数量明显增多,较多骨髓腔形成。(2)免疫组化结果显示,拔牙术后即刻和第1天时,牙槽窝内壁的骨髓孔边缘,可见P75NTR的表达;而第3天,阳性表达区域出现在牙槽窝中心的纤维结缔组织周围,而牙槽窝内壁亦可见少量着色;拔牙术后7天,P75NTR表达于骨小梁边缘的纤维结缔组织。(3)培养出来的PDLSCs与DSCs形态较为类似,细胞呈长梭形和多角形,均高表达间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)相关表型。CCK-8法检测DSCs的增殖活力较PDLSCs强(p<0.05),且克隆形成率更高(p<0.001)。(4)PDLSCs与DSCs经油红O染色后,显示两种细胞都可形成脂滴,二者都显示出成脂分化的潜能。而ALP及茜素红染色后,DSCs的染色最深,且钙化结节形成更多,RT-PCR及Western blot检测成骨诱导7天后,DSCs的ALP、RUNX2的表达较PDLSCs高(P<0.05),结果都表明DSCs成骨分化能力较PDLSCs强。结论:大鼠拔牙后的牙槽窝内可以提取分离出DSCs,其可以在体外稳定的扩增,增殖和克隆形成能力均较PDLSCs高,DSCs有多向分化潜能,且成骨分化潜能比PDLSCs强。

关键词： 非小细胞肺癌   长链非编码RNA   细胞增殖   细胞迁移   细胞凋亡  

摘要： 目的:非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要类型,占所有肺癌的近80%。其发生和发展的分子机制尚未完全阐明。随着全基因组和转录组测序技术的发展,长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lncRNAs)的生物学功能逐渐受到关注。已发现多种lncRNA在肿瘤组织中的表达出现异常,并通过调节细胞增殖、凋亡和转移等过程,影响各种肿瘤包括肺癌的发生发展。但迄今为止,仍有大量已发现的lncRNA未能确定其生物学功能。本研究通过数据库筛选,找出肺癌中未研究过的差异表达的lncRNA,筛选得到两个lncRNA作为研究对象,采用细胞增殖、细胞迁移、逆转录PCR和蛋白印迹等技术研究它们对体外培养的肺癌细胞生物学功能的影响,探究它们在NSCLC发生发展中的可能作用,为进一步了解肿瘤相关lncRNA功能以及可能的新治疗靶点筛选,提供理论和实验基础。 方法: 1.在数据库LncRNADisease中筛选出肺癌中没有研究过的lncRNA,通过文献检索查找候选基因的引物,采用BLAST和普通PCR检验这些引物的特异性。利用实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,RT-qPCR)方法,筛选出与正常细胞对比存在表达差异的lncRNA; 2.采用RT-qPCR方法,检测lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1在NSCLC癌组织和癌旁组织中的表达; 3.采用慢病毒感染方法,在NSCLC细胞(A549、H1299)中构建lnc-SAMD5-1的过表达模型。采用质粒转染方法,在A549和H1299细胞中构建RBM5-AS1的过表达模型; 4.采用CCK-8、EdU染色和克隆形成实验,分析lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1过表达对NSCLC细胞(A549、H1299)增殖的影响; 5.通过Transwell实验和细胞划痕愈合实验,观察lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1过表达对NSCLC细胞(A549、H1299)迁移的影响; 6.采用RT-qPCR方法,检测lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1过表达对NSCLC细胞(A549、H1299)周期和凋亡相关基因mRNA的影响; 7.采用Western Blot定量分析lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1过表达对NSCLC细胞(A549、H1299)增殖、周期和迁移相关蛋白质的影响。 结果: 1.在LncRNADisease数据库中筛选出821个NSCLC中未研究过的lncRNAs,进一步通过文献分析、引物设计和验证、细胞系表达量检测等,筛选出两个靶标lncRNA(lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1)进入下一步研究; 2.与NSCLC癌旁组织相比,lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1在癌组织中低表达; 3.与人支气管上皮细胞BEAS-2B比较,lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1在肺癌细胞系A549、H1299、H1975、H292和PC-9中均显著低表达; 4.在NSCLC细胞(A549、H1299)中成功构建lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1的过表达模型; ***-SAMD5-1过表达可显著抑制NSCLC细胞(A549、H1299)的增殖和迁移;在mRNA水平上,可下调细胞周期素、抗凋亡基因等,上调促细胞凋亡基因等的表达;蛋白质水平上,可抑制细胞周期蛋白的表达,抑制N-钙粘素并促进E-钙粘素的表达; ***5-AS1过表达可以显著抑制NSCLC细胞(A549、H1299)的增殖和迁移;在mRNA水平上,可下调细胞周期素、抗凋亡基因等,上调细胞周期调节蛋白、促凋亡基因等的表达;蛋白质水平上,可抑制细胞周期素依赖蛋白激酶、波形蛋白等的表达。 结论: *** lnc-SAMD5-1和RBM5-AS1在肺癌细胞系(A549、H1299、H1975、H292、PC-9)和NSCLC癌组织中均低表达; ***-SAMD5-1和RBM5-AS1过表达均可以显著抑制NSCLC细胞(A549、H1299)的增殖和迁移; ***-SAMD5-1和RBM5-AS1过表达可以抑制细胞周期素、周期素依赖蛋白激酶、抗凋亡基因mRNA和蛋白质的表达,上调周期素调节蛋白、促凋亡等相关基因mRNA和蛋白质的表达。

关键词： 卵巢癌   PXN   细胞自噬   信号通路   生物信息分析  

摘要： 目的: 卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤首位,探求卵巢癌的发生发展机制,寻求新的治疗靶点引起了广泛关注。本研究将基于卵巢癌细胞株A2780及SKOV3,探索自噬相关基因PXN(Paxillin)对卵巢癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响,并研究其潜在的分子机制。 方法: (1)通过limma差异表达分析及Kaplan-Meier生存分析挖掘在卵巢癌中高表达且与患者不良预后相关的自噬相关基因,并通过GO/KEGG功能富集分析预测基因参与的生物学过程与信号通路,Western blot及RT-qPCR验证PXN基因在卵巢癌细胞中的表达。 (2)利用PXN过表达慢病毒感染A2780细胞、PXN敲减慢病毒感染SKOV3细胞后,通过CCK-8实验、细胞划痕实验和Transwell迁移侵袭实验探讨PXN过表达及敲减对卵巢癌细胞生长增殖、迁移和侵袭能力的影响。 (3)利用透射电镜拍摄自噬小体;Western blot检测卵巢癌细胞中自噬标志蛋白LC3、自噬底物蛋白SQSTM1/p62、PI3K/Akt/m TOR通路蛋白以及p110β/Vps34/Beclin1通路蛋白的表达情况;细胞间接免疫荧光进一步检测LC3蛋白及SQSTM1/p62蛋白表达情况并对其进行定位。以初步探究PXN影响卵巢癌细胞生物学功能的分子机制。 结果: (1)共筛选到724个自噬相关基因在卵巢癌组织中高表达,其中,PEX3、PXN和RB1基因的高表达与卵巢癌患者不良预后相关(P均<0.05)。在卵巢癌组织及卵巢癌细胞中,PXN基因的表达量明显高于PEX3和RB1基因。PXN的功能和调控的信号通路与细胞自噬、泛素化和溶酶体等相关,且可能与MAPK、Ras、PI3K/Akt、Wnt和m TOR等多条信号通路有关。 (2)RT-qPCR及Western blot结果表明PXN mRNA及paxillin蛋白在NIH:OVCAR-3、ES-2、SKOV3和A2780细胞中均有表达,其中在SKOV3细胞中相对表达量最高,在A2780细胞中最低。 (3)荧光显微镜、Western blot结合RT-qPCR结果显示在A2780细胞中成功过表达PXN基因,在SKOV3细胞中成功敲减PXN基因。细胞功能学实验表明PXN过表达组相对于空白对照组和阴性对照组细胞增殖数目更多,划痕愈合面积更大,穿过小室膜的细胞数目更多。PXN敲减组得到了相反的结果。 (4)透射电镜观察到各组卵巢癌细胞中均有自噬小体,Western blot及细胞免疫荧光结果表明PXN过表达组相对于空白对照组和阴性对照组SQSTM1/p62蛋白的相对表达量增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低,p-Akt蛋白、p-m TOR蛋白、PI3K(p110β)蛋白及Beclin1蛋白的相对表达量降低。PXN敲减组得到了相反的结果。 结论: (1)PXN在卵巢癌中高表达,且与患者不良预后相关。 (2)PXN基因能够调控卵巢癌细胞的生物学行为:PXN的过表达能够促进卵巢癌细胞的生长增殖、迁移和侵袭,PXN表达水平的降低能够抑制卵巢癌细胞的生长增殖、迁移和侵袭。 (3)PXN基因能够抑制卵巢癌A2780细胞及SKOV3细胞中PI3K/Akt/m TOR通路的激活。 (4)PXN基因可能通过调控p110β/Vps34/Beclin1通路抑制细胞自噬参与卵巢癌细胞的恶性生物学行为。

关键词： 卤虫   孤雌生殖   减数分裂   比较转录组   RNA干涉  

摘要： 孤雌生殖(即通过未受精卵繁殖)是广泛存在于动植物中的一种特殊生殖方式。虽然两性生殖可以在重组中获得适应环境的能力,但孤雌生殖物种却可以在环境条件适宜时迅速扩增种群数量并节约大量能量。目前关于孤雌生殖已有的研究大多关注的是生殖方式,并且只是停留在细胞学水平的研究,对于孤雌生殖的发生机制却知之甚少。虽然大部分的研究认为孤雌物种来源于两性系,但关于其具体发生机制的研究却仍然较少。卤虫(Artemia)作为水产养殖的最佳开口饵料,既有两性种,也有专性的孤雌生殖种,且两者独立存在,这一特点使卤虫这一小型甲壳动物成为研究孤雌与两性间进化机制的理想模型。 在本研究中,首先通过展片技术对两性卤虫与孤雌卤虫开展了染色体形态学分析,发现两者在卵子发生中期存在显著差异,前者停滞在减数分裂Ⅰ中期等待受精信号激活,而后者无需受精因此是连续的。此外,相较于两性卤虫二价体交叉的随机定位,孤雌卤虫的交叉严格定位在远端,同源染色体的这种排列方式推测可能显著降低了同源重组的发生。其次,利用免疫荧光技术比较了两种不同生殖方式卤虫的减数分裂过程,结果表明,相比于遵循经典减数分裂的两性卤虫,孤雌卤虫的减数分裂Ⅰ是不完整的,且随后不发生减数分裂Ⅱ,减数分裂Ⅰ后期分开的同源染色体又重新移回赤道板,最后姐妹染色单体分离,只发生一次类似有丝分裂的均等分裂,从而维持了倍性的稳定。 在上述研究的基础上,针对卵子发生中期的未受精两性卤虫与孤雌卤虫进行了种间比较转录组测序,利用种间互相BLASTP筛选了同源基因并进行了差异分析,通过KEGG富集以及手动识别对于两性中上调的基因进行了进一步筛选,获得了减数分裂相关的差异表达基因。其中分别针对在同源重组中发挥核心作用的减数分裂重组酶Dmc1与DNA修复蛋白Rad51、减数分裂特异性的姐妹染色单体间的黏连蛋白Rec8以及减数分裂关键调节因子Mos开展了进一步研究。 通过qRT-PCR分别确认了Dmc1、Rad51、Rec8和Mos在两性卤虫中的上调表达。对其在卵子发生过程中的表达分析结果表明,Dmc1、Rad51和Rec8均在卵子发生早期达到峰值,而Mos在胚胎发育早期达到峰值。为进一步探究Dmc1、Rad51、Rec8和Mos在卤虫孤雌生殖发生中的作用,我们利用RNA干涉技术分别在两性卤虫未受精雌虫中干涉这四个基因。结果发现在两性卤虫中敲低Dmc1后会导致同源染色体不发生联会配对,产生单价体,与同时期孤雌卤虫染色体形态相似,而敲低Rad51后染色体形态没有观察到显著性变化,敲低Rec8后会导致两性卤虫未受精卵出现孤雌激活,但发育到16-32细胞期出现停滞,敲低Mos后也能引发两性卤虫未受精卵出现孤雌激活,但却能发育至晚期停滞。上述结果表明,Dmc1、Rec8和Mos功能的缺陷可能在卤虫从两性到孤雌生殖方式的转换中发挥重要作用。 综上所述,本研究揭示了卤虫的孤雌生殖方式,并且Dmc1、Rec8和Mos三个在两性卤虫中上调表达的减数分裂相关基因功能的缺陷在卤虫孤雌生殖的发生中发挥重要作用,为深入探究卤虫孤雌生殖的发生机制提供分子证据。

关键词： ZWINT   增殖   转移   凋亡   EMT  

摘要： 目的:肝细胞癌（HCC）是病死率高、预后差的恶性肿瘤。本研究旨在通过数据库探究ZWINT在HCC中的表达水平,并通过一系列实验探究ZWINT对肝癌细胞各种生物学表型的影响,并初探其潜在的作用机制。方法:1.通过公共数据库查询ZWINT与HCC的关系;利用TIMER数据库和GEPIA数据库探讨ZWINT在HCC病人癌与癌旁组织中的表达情况;使用UALCAN数据库探究在HCC病人中,ZWINT与临床病理特征的关系;KM Plotter数据库分析了ZWINT与总体生存时间（OS）和无复发生存时间（DFS）之间的关系;TIMER数据库分析ZWINT的表达与免疫细胞浸润的相关性;Linked Omics数据库对ZWINT进行基因富集分析从而识别其功能及相关信号通路。2.随后在肝癌细胞系和正常肝细胞中验证ZWINT的表达,选取ZWINT相对高表达的肝癌细胞SUN-449,利用si-RNA进行敲减,分为对照组（Control）、阴性对照组（Si-NC）、ZWINT敲低组（Si-ZWINT）;选择肝癌细胞中ZWINT表达相对较低的Huh-7,利用慢病毒进行过表达稳转株构建,分组为空载对照组（Vector）和过表达组（Oe-ZWINT）。Western Blot验证转染效率,在此基础上进行后续实验。用CCK-8实验、EDU实验分别检测各组肝癌细胞的增殖情况;用划痕实验、Transwell实验来探究各组肝癌细胞的转移情况;用流式细胞技术检测各组肝癌细胞的细胞周期和凋亡水平;用WB分析在改变ZWINT的表达量后,EMT过程中相关蛋白标志物的表达情况。3进行裸鼠皮下成瘤实验,在体内探究ZWINT对HCC增殖的影响。结果:1.公共数据库显示ZWINT在HCC中高表达;ZWINT在P53突变亚组分型中具有统计学意义;ZWINT高表达的病人具有较差的术后OS与DFS;ZWINT在HCC中与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞的浸润程度相关;基因富集分析结果显示ZWINT在DNA复制、细胞分裂和细胞周期检查点等生物过程和信号通路中高度富集。2.体外实验中:CCK-8实验和EDU实验显示,Si-ZWINT组的增殖能力相较于Control组和Si-NC组减弱,而相对于Vector组,Oe-ZWINT组增殖能力有所提升（P<0.05）;划痕实验和Transwell实验表明,Si-ZWINT组的转移能力明显弱于Control组和Si-NC组,而相对于Vector组,Oe-ZWINT组的细胞转移能力增强（P<0.05）;通过流式细胞实验发现,Si-ZWINT组细胞凋亡率明显高于Control组和Si-NC组,而且被阻滞在G1期的细胞比例增加,而相对于Vector组,Oe-ZWINT组细胞凋亡率较低,而且细胞周期在G1期阻滞减少（P<0.05）;WB结果表明,与Control和Si-NC组相比较,Si-ZWINT组E-cadherin表达量较高,而Vimentin和N-cadherin的表达量较低,相对于Vector组,Oe-ZWINT组E-cadherin的表达量较低,而Vimentin和N-cadherin的表达量较高（P<0.05）。3.裸鼠实验表明:与对照组比较,敲低组裸鼠瘤体的生长速度明显减慢（P<0.05）,瘤体质量也明显较轻（P<0.05）,提示敲低组移植瘤生长明显受到抑制。结论:***基因在HCC病人中为高表达,且与病人预后不良相关;***能够促进肝癌细胞增殖和转移并抑制细胞凋亡,且ZWINT可能通过促进肝癌细胞上皮间质转化而促进其进展;***可以促进肝癌细胞在裸鼠体内生长。

关键词： 瘢痕疙瘩   成纤维细胞   甲基莲心碱、凋亡、线粒体膜电位、线粒体凋亡途径  

摘要： 目的:探讨甲基莲心碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移/侵袭能力、凋亡的影响及作用机制初步探索验证。方法:(1)采用CCK8法检测不同浓度的甲基莲心碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响,同时确定实验浓度及作用时间。(2)划痕实验、Trans-well小室法、流式细胞术分别检测各实验组细胞在甲基莲心碱干预后迁移、侵袭能力和凋亡的变化;(3)JC-1荧光探针法检测各实验组细胞线粒体膜电位变化;(4)RT-q PCR检测各实验组线粒体凋亡途径标志因子Bcl-2、Bax、Cyt-C、P53m RNA的表达;(5)Western-blot检测各组线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-2、Bax、Cyt-C、P53的表达。结果:(1)经CCK-8法检测确定甲基莲心碱呈浓度和时间依赖性抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,确定实验浓度为3.2μmmol/L和6.4μmmol/L(P<0.001),确定作用时间为24小时(P<0.0001);(2)与对照组相比,实验组细胞随甲基莲心碱浓度的增加细胞增殖能力显著下降(P<0.001);侵袭/迁移能力明显降低((P<0.001);细胞凋亡比例明显增加(P<0.001);(3)与对照组相比,实验组细胞线粒体膜电位水平随甲基莲心碱浓度的增加而降低;(4)与对照组相比,实验组中Bcl-2的表达显著低于对照组,且甲基莲心碱浓度越高Bcl-2表达越低;Bax、Cyt-C、P53的表达实验组显著高于对照组,与甲基莲心碱的浓度呈正相关(P<0.05);(5)与对照组相比,实验组中Bcl-2蛋白的表达明显低于对照组,Bax、Cyt-C、P53蛋白的表达明显高于对照组,且随甲基莲心碱浓度增加而增加。结论:1.甲基莲心碱能呈时间和浓度依赖性的抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并能促进细胞凋亡。2.甲基莲心碱抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学行为促进凋亡的部分机制是通过过表达促凋亡因子P53、Bax、Cyt-C和抑制抑凋亡因子Bcl-2的表达,增强人瘢痕疙瘩成纤维细胞线粒体凋亡途径。