关键词：
颗粒细胞
N-乙酰半胱氨酸
氧化应激
绵羊
摘要：
卵泡颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）是卵泡的主要功能细胞,GCs的增殖和凋亡与卵泡发育和成熟密切相关。N-乙酰半胱氨酸（N-acetly-L-cysteine,NAC）在降低机体细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,维持细胞功能和细胞形态等方面发挥重要作用。NAC作为一种抗氧化剂已广泛应用。本研究在甘肃省武胜驿镇屠宰场采集2岁左右健康母绵羊正常发育的卵巢。待屠宰后立即取出两侧卵巢,37℃保存,4 h内送回实验室。采用卵泡液抽吸法分离GCs,免疫荧光技术进行GCs鉴定。探究最适GCs体外培养条件。通过添加不同浓度NAC（50、100、500、1000μmol/L）,分析其对GCs增殖、凋亡、ROS水平、激素分泌及相关基因和蛋白表达水平的影响。使用PI3K/AKT抑制剂LY294002处理,探明NAC对绵羊GCs增殖、类固醇激素分泌的分子机制。利用H2O2对GCs进行处理构建氧化应激模型,通过NAC对模型进行预处理,研究NAC是否可以抑制模型细胞的凋亡。针对细胞抗氧化能力与NRF2及PI3K/AKT信号通路进行研究,探明NAC是否通过NRF2和PI3K/AKT信号通路来缓解H2O2诱导的氧化应激损伤。研究结果如下:1.免疫荧光鉴定结果表明体外培养绵羊GCs纯度达到99.2%;培养基加入15%血清时,细胞增殖效果显著高于其他浓度组（P<0.05）,DMEM/F12组细胞的增殖效果优于DMEM组（P<0.05）。2.不同浓度NAC组GCs的增殖能力均高于对照组（P<0.05）。体外培养GCs48 h时,100μmol/L NAC能极显著提高GCs的增殖能力（P<0.01）。q RT-PCR和WB结果表明,100μmol/L NAC组的CCND1、CDK4和Bcl-2的表达水平显著上调（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平显著上调（P<0.05）,而Bax基因和蛋白的表达水平显著下调（P<0.05）。100μmol/L NAC显著降低GCs活性氧含量（P<0.05）。q RT-PCR结果表明,100μmol/L NAC组SOD1和CAT表达水平极显著上调（P<0.01）。ELISA和q RT-PCR结果显示,100μmol/L NAC组的P4、E2分泌量显著升高（P<0.01）,P4和E2相关合成基因3β-HSD和CYP19A1的表达水平显著上调（P<0.05）。用NAC预处理后,再添加PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002,抑制剂LY294002显著降低GCs的增殖能力（P<0.01）,抑制GCs分泌E2、P4（P<0.05）;用NAC处理GCs,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著上调（P<0.05）;用NAC预处理后,LY294002能够显著下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达（P<0.05）。3.200μmol/L H2O2,作用GCs12h,成功构建氧化损伤模型。H2O2组ROS、MDA含量显著增加（P<0.05）,GSH含量及SOD活性显著降低（P<0.05）,CAT和SOD1表达水平显著下调（P<0.05）;GCs增殖活力显著降低（P<0.01）,PCNA和Bcl-2的表达水平显著下调（P<0.05）,Bcl-2的蛋白水平显著下调（P<0.01）,而Bax基因和蛋白的表达水平显著上调（P<0.05）;E2、P4分泌量显著降低（P<0.05）,炎症因子IL-18、IL-1b的含量显著升高（P<0.05）;NRF2和HO-1基因和蛋白表达水平显著下调（P<0.05）;p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达水平显著下调（P<0.05）。用NAC预处理后,再添加H2O2处理,ROS、MDA含量显著降低（P<0.05）,GSH含量及SOD活性显著升高（P<0.05）,CAT和SOD1表达水平显著上调（P<0.05）;GCs增殖活力显著升高（P<0.01）,PCNA和Bcl-2的表达水平显著上调（P<0.05）,Bcl-2的蛋白水平显著上调（P<0.01）,Bax基因和蛋白的表达水平显著下调（P<0.05）;E2、P4分泌量显著上升（P<0.05）,炎症因子IL-18、IL-1b的含量显著降低（P<0.05）;NRF2和HO-1的基因和蛋白表达水平显著上调（P<0.05）;p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表达水平显著上调（P<0.05）。综上所述,绵羊GCs体外培养最佳条件为含有15%血清的DMEM/F-12培养基、培养温度为37℃;NAC激活PI3K/AKT信号通路促进体外培养的绵羊GCs增殖,E2和P4分泌。NAC通过NRF2及PI3K/AKT信号通路来缓解H2O2诱导的氧化应激损伤。
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