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关键词： 三阴性乳腺癌   HCF-1   CDC42   增殖   迁移  

摘要： 背景:乳腺癌(Breast cancer,BC)是一种高度异质性的疾病,患者的临床治疗和预后差异很大。三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌亚型中的一种,具有高度侵袭性和高早期复发率,总体预后非常差。因此,TNBC迫切需要新的治疗方法。宿主细胞因子1(Host cell factor 1,HCF-1)作为一种转录因子在癌症中发挥作用,但关于HCF-1在三阴性乳腺癌发生发展的具体机制尚不清楚。因此,阐明HCF-1调控TNBC的发生发展十分重要。细胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle 42,CDC42)是一种小GTP酶,近期研究发现,CDC42可能作为HCF-1的下游靶基因在癌症发生发展中发挥作用。然而,CDC42在TNBC中这种调控机制尚不明确。目的:探讨HCF-1基因对三阴乳腺癌细胞系增殖、迁移、凋亡的影响,并探究HCF-1是否通过靶向CDC42来影响三阴性乳腺癌的生物学功能。方法:通过生物信息学对HCF-1基因在乳腺癌和正常样本之间进行差异分析和生存分析。通过蛋白印迹(Western Blot)检测敲低HCF-1后三阴乳腺癌细胞中的HCF-1和CDC42的蛋白表达水平。使用CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测细胞增殖能力。使用流式细胞术检测细胞凋亡水平和周期差异。使用划痕实验和Transwell法检测细胞的划痕愈合能力以及迁移能力。结果:与正常乳腺组织相比,HCF-1在三阴性乳腺癌中显著上调,同时其高表达可能与患者预后不良相关。敲低HCF-1表达,可以显著抑制CDC42蛋白的表达情况。体外功能实验表明,敲低HCF-1表达可以显著抑制细胞的增殖能力、划痕愈合能力以及迁移能力;敲低HCF-1表达,细胞总凋亡率增加、细胞周期G1期比率增加。结论:本研究表明,在三阴乳腺癌两个细胞系(MDA-MB-231,MDA-MB-468)中,敲低HCF-1后,细胞的增殖能力、划痕愈合能力以及迁移能力显著被抑制,同时细胞总凋亡率增加、细胞周期G1期比率增加。我们的实验发现,HCF-1可能通过调控CDC42参与了三阴性乳腺癌的生物学功能。因此,本研究可能为三阴性乳腺癌寻找新的治疗靶点提供新的思路。

关键词： 热疗   实体瘤   系统性免疫炎症指数   预后  

摘要： 目的研究不同热疗条件对肺癌A549细胞、结肠癌HCT116细胞生物学行为的影响。探讨热疗对中晚期实体肿瘤患者炎性指标、凝血指标和预后营养指数(Prognostic Nutritional Index,PNI)的影响,并分析上述指标与患者预后的相关性。为中晚期恶性实体肿瘤综合治疗提供更多依据和选择。 方法1基础研究:根据不同热处理温度(40℃、41℃、42℃、43℃、44℃)和时长(同一温度加热时长分别为30min、60min、90min)进行细胞实验分组,对照组为37℃(培养箱培养对应时长)。通过CCK-8法、克隆实验、伤口愈合实验、Transwell实验检测热疗对A549、HCT116细胞增殖和迁移的影响;蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测不同实验组HSP70、p53、PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的表达水平。2临床研究:1)收集我院经治的74例中晚期实体肿瘤患者的临床资料,根据是否应用热疗分为热疗组和非热疗组,比较两组患者6个月无进展生存(Progression-Free-Survival,PFS)率、炎性指标[淋巴细胞计数(Total Lymphocyte Count,TLC)、血小板与淋巴细胞比值(Platelet to Lymphocyte Ratio,PLR)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(Neutrophil to Lymphocyte Ratio,NLR)、淋巴细胞与单核细胞计数比值(Lymphocyte to Monocyte Ratio,LMR)、系统免疫炎症指数(Systemic Immune-inflammation Index,SII)]、凝血指标[活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)、纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)、凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)、凝血酶时间(Thrombin Time,TT)、D-二聚体]及PNI的差异;2)根据患者治疗结束后6个月内疾病是否进展,将热疗组分为疾病进展组和疾病控制组,分析两组患者治疗前血液学炎性指标、凝血指标及PNI的差异,并对有意义的指标SII进行受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线分析,进一步采用Logistics回归分析SII与6个月PFS的关系。 结果1基础研究结果:除应用40℃热处理30 min的A549细胞实验组外,其余各实验组细胞存活率均显著低于对照组(P<0.05);两种细胞实验组的克隆形成率、迁移率显著低于对照组(P<0.05);两种细胞各实验组HSP70、p53、Bax的蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05),PCNA和Bcl-2的蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05),上述细胞相关蛋白的表达呈温度依赖性。2临床研究结果:1)热疗组6个月PFS率、TLC显著高于非热疗组,PLR、SII、APTT显著低于非热疗组,均具有统计学差异(P<0.05);余指标无统计学差异(P>0.05)。2)热疗治疗前疾病进展组SII值显著高于疾病控制组(P<0.05),余指标无统计学差异(P>0.05),ROC曲线分析显示SII对预后有一定预测价值。Logistics回归分析显示热疗前SII值每增加1,疾病进展发生率增加1.007倍。 结论1热疗的抗肿瘤作用机制可能与抑制A549、HCT116细胞的增殖和迁移,促进HSP70、p53和Bax的蛋白表达,降低PCNA和Bcl-2的蛋白表达有关。2热疗能够改善中晚期实体肿瘤患者预后相关血液学指标TLC、PLR、SII、APTT,提高6个月PFS率。SII对热疗治疗中晚期实体肿瘤患者的预后具有一定的预测功能,出现明显升高时,提示疾病进展风险可能性大,预后较差。 图 13 幅;表 9 个;参 153 篇。

关键词： 宫颈癌   过氧化还原酶2   人乳头瘤病毒16型E6蛋白   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：　　探讨过氧化还原酶2（Peroxiredoxin2，PRDX2）、人乳头瘤病毒16（Human Papillomavirus16，HPV16）E6蛋白在宫颈病变组织中的表达，分析两者之间的相关性;研究PRDX2对宫颈Siha细胞的功能影响，验证PRDX2通过氧化应激ROS途径影响宫颈癌细胞的生物学行为及分析HPV16E6与PRDX2之间关系。　　方法：　　（1）收集资料，统计2021年10月至2022年10月南通大学附属建湖县人民医院行宫颈筛查患者HPV阳性感染情况及亚型分布，选择HPV感染最多的亚型患者进行下一步研究。　　（2）从HPV感染最多亚型患者中选取宫颈癌及宫颈上皮内肿瘤（高级别）组织的病例各30例，另取同期正常宫颈30例患者资料作为对照组，统计患者的一般资料，并运用免疫组织化学技术验证PRDX2、HPV16E6在宫颈病变组织中的表达水平。　　（3）体外实验选取宫颈Siha细胞，使用siRNA技术干扰Siha细胞中PRDX2及HPV16E6表达，RT-qPCR技术分析筛选PRDX2siRNA、HPV16E6siRNA最佳干扰序列。　　（4）转染过表达质粒和siRNA序列，建立实验分组Blank组、Siha+OE-NC组、Siha+OE-PRDX2组、Siha+siRNA NC组、Siha+siRNA PRDX2组，运用RT-qPCR检测各组PRDX2的mRNA表达情况并进行分析，检测各组细胞增殖、侵袭和迁移能力，DCFH-DA探针检测各组细胞ROS水平，进一步探讨PRDX2对宫颈癌细胞的功能影响研究，深入分析PRDX2诱发宫颈癌的机制。　　（5）转染过表达质粒和siRNA序列，建立实验分组Blank组、Siha+OE-NC组、Siha+OE-HPV16E6组、Siha+siRNA NC组、Siha+siRNA-HPV16E6组，运用RT-qPCR、Westernblot检测PRDX2、HPV16E6的mRNA及蛋白的表达情况并进行分析，验证两者之间的相关性。　　结果：　　（1）2021年10月至2022年10月参与宫颈筛查患者总人数3383人，其中HPV阳性人数575人，HPV阳性感染率16.99%，HPV16亚型占比最高，筛选出114例HPV16亚型阳性患者，按照其病理结果各自挑选出每组30例患者，分为正常宫颈组、宫颈上皮内肿瘤（高级别）组、宫颈癌组。　　（2）统计三组别患者基本临床资料统计，发现三组的年龄分布存在统计学差异（P＜0.001），免疫组织化学验证发现高级别和宫颈癌组中PRDX2和HPV16E6蛋白表达水平显著高于正常宫颈组（P＜0.05）。　　（3）对PRDX2或HPV16E6进行转染，PRDX2或HPV16E6敲降后mRNA或蛋白表达水平明显下调，选择敲降效果最好的干扰序列进行后续建议。　　（4）相比Blank组，转染NC对PRDX2的mRNA表达水平无显著影响（P＞0.05），转染过表达PRDX2质粒会显著增加细胞内PRDX2的mRNA表达水平（P＜0.05），转染siRNA-PRDX2会显著降低细胞内PRDX2的mRNA表达水平（P＜0.05）。　　（5）相比Blank组，转染NC不影响细胞生长速率，转染过表达PRDX2质粒会显著促进细胞增殖，敲降PRDX2会显著抑制细胞增殖，且这种差异变化随着培养时间延长而越显著（P＜0.05）。　　（6）相比Blank组，转染NC对细胞迁移能力无显著影响（P＞0.05），转染过表达PRDX2质粒会显著显著促进细胞迁移，敲降PRDX2显著抑制细胞迁移（P＜0.05）。　　（7）相比Blank组，转染NC对细胞侵袭能力无显著影响（P＞0.05），转染过表达PRDX2质粒显著促进细胞侵袭，敲降PRDX2显著抑制细胞侵袭（P＜0.05）。　　（8）相比Blank组，转染NC对细胞内ROS水平无显著影响（P＞0.05），转染过表达PRDX2质粒会显著降低细胞内ROS水平，敲降PRDX2会显著增加细胞内ROS水平（P＜0.05）。　　（9）相比Blank组，转染NC不影响Siha细胞HPV16E6、PRDX2表达水平（P＞0.05），转染过表达HPV16E6质粒后会显著增加Siha细胞HPV16E6和PRDX2表达水平（P＜0.05），转染siRNA-HPV16E6显著降低Siha细胞HPV16E6和PRDX2表达水平（P＜0.05）。　　结论：　　（1）PRDX2及HPV16E6蛋白与宫颈癌的发生及病情进展有密切关系，且PRDX2在肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭过程中起到促进作用。　　（2）PRDX2可通过氧化应激ROS途径影响宫颈癌细胞的生物学行为，HPV16E6蛋白与PRDX2之间呈正相关，两者在宫颈癌发展中起到协同作用。

关键词： SMAD3   结直肠癌   上皮间质转化   肿瘤转移  

摘要： 【目的】SMAD3蛋白是SMADs蛋白家族的成员之一,已被证实在部分人体实体肿瘤在的发生及进展中发挥抑癌或促癌的作用。而在结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)中,有关SMAD3的研究却非常有限,因此本实验拟在体外探究SMAD3在CRC细胞中的表达及生长转移的作用,初步探索其作用的基本机制。【方法】通过使用慢病毒系统感染人结直肠癌细胞株,我们建立了一个稳定高表达和敲低SMAD3的CRC细胞系。我们通过使用qRT-PCR和Western Blot来验证这个方法的效率。检测SMAD3对CRC细胞的以下生物学功能的影响:采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)生长实验、划痕实验、Transwell侵袭、迁移实验、细胞克隆形成实验观察SMAD3在CRC细胞中的作用。之后,对SMAD3在CRC侵袭迁移中的潜在作用机制进行探讨,应用Western Blot检测SMAD3对稳定构建高低表达的CRC细胞株EMT相关蛋白标志物表达改变的影响。【结果】成功构建了SMAD3稳定高表达的细胞模型(RKO-SMAD3、Lo Vo-SMAD3及其对照RKO-Control、Lo Vo-Control),SMAD3稳定敲低的细胞模型(SW0480-sh SMAD3、DLD1-sh SMAD3其对照SW480-sh Control、DLD1-sh Control)。经过Western blot和qRT-PCR实验,我们发现各细胞模型组中对照组SMAD3的表达水平和高/低表达组效率都有显著的差异;经过CCK8、Transwell迁移和侵袭实验以及平板克隆实验的证实,在SMAD3稳定敲低组,细胞的增殖、迁移和侵袭能力以及克隆形成能力均有显著提升;相比之下,当SMAD3基因高表达时,结果却完全不同。提示SMAD3基因表达与细胞增殖、细胞迁移和侵袭能力、克隆形成能力负相关。经过检测,当SMAD3表达水平降低时,结直肠癌细胞中EMT相关因子E-Cadherin的表达也会相应减少,而Snail、N-Cadherin和Vimentin蛋白的表达则会升高,而当SMAD3表达水平升高时,这种变化则会出现相反的结果,这表明SMAD3可促进结直肠癌细胞的EMT进程。【结论】SMAD3在结直肠癌中发挥着重要作用,它可以促进癌细胞的生长和转移,并且可以激活癌细胞的EMT过程,从而增强癌细胞的侵袭和迁移能力。

关键词： 食管鳞癌   泛素特异性肽酶5   促癌作用   细胞生物学   放射敏感性  

摘要： 目的：泛素特异性肽酶5（ubiquitin specific peptidase 5，USP5）已被证实在多种恶性肿瘤中作为促癌因子发挥重要作用，但在食管鳞癌中尚未见有关于USP5的报道。本研究旨在探讨食管鳞癌中USP5表达与患者预后的相关性，并进一步探讨USP5在食管鳞癌细胞生物学行为及放射敏感性中的作用。　　方法：在公共数据库中分析USP5 mRNA在食管鳞癌中的表达水平，通过实时荧光定量 PCR及免疫组化验证食管鳞癌中的USP5水平。根据对USP5表达水平的组织芯片评分将食管鳞癌患者分为高低两组，统计分析其表达情况与临床病理特征的关系，通过临床生存分析和多因素回归模型研究USP5对食管鳞癌患者的预后价值。利用慢病毒构建稳定表达 USP5 敲低和过表达的细胞株（Eca-109/Lv-USP5,TE-1/Sh-USP5），分别用CCK-8试剂盒、克隆形成实验检测各组肿瘤细胞的增殖能力。Transwell实验检测细胞的迁移能力。在细胞暴露于6 Gy辐照后，利用克隆形成实验、Western Blot法来探究USP5对肿瘤细胞放射敏感性的影响。应用Western Blot法检测USP5对WNT信号通路的影响。　　结果：（1）生信分析、实时荧光定量PCR和免疫组化结果显示在食管鳞癌组织中USP5表达水平高于正常食管组织。　　（2）USP5表达与食管鳞癌患者pT分期（p＜0.001）、pN分期（p＜0.001）、TNM 分期（p＜0.001）显著相关。USP5 高表达组的食管鳞癌患者有着更短的OS与DFS。USP5是食管鳞癌患者的独立预后因素。　　（3）体外细胞功能实验显示高水平的USP5对肿瘤细胞的增殖和迁移能力有促进作用。　　（4）在6 Gy照射后，克隆形成实验中USP5低表达组的存活曲线显著下移，并且其γ-H2AX水平增加，说明降低USP5水平能提高食管鳞癌细胞的放射敏感性。　　（5）过表达USP5会上调β-catenin、C-myc、Cyclin-D1、Snail2、Twist的蛋白水平。　　结论：USP5在食管鳞癌组织中高表达，并且与患者更短的OS与DFS相关。USP5 能作为食管鳞癌患者生存的独立预后因素。USP5 可以提高食管鳞癌细胞增殖和迁移的能力，并且下调细胞的放射敏感性。此外，USP5 可能通过激活WNT信号通路对食管鳞癌细胞系的生物学行为和放射敏感性产生影响。

关键词： 声动力疗法   卵巢癌   声诺维   活性氧   凋亡  

摘要： 卵巢癌（Ovarian cancer）是世界上第三大最常见也是最致命的妇科恶性肿瘤,由于其早期阶段无明显症状,大多数患者在被诊断时就处于晚期。药物耐受性、全身毒性以及肿瘤复发导致晚期卵巢癌患者的死亡率高达70%,总体5年生存率仅为48.8%。因此,探索新的卵巢癌治疗策略势在必行。声动力疗法（Sonodynamic Therapy,SDT）是一种以超声为基础,由光动力治疗（Photodynamic Therapy,PDT）发展而来的治疗方式,近年来得到越来越广泛的应用。与PDT类似,SDT目前较为认可治疗原理也是通过产生大量活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）激活相应癌细胞死亡通路杀死肿瘤。但与PDT不同的是,SDT依赖超声强大的穿透力（>10cm）和声敏剂的肿瘤特异性积累,是卵巢癌等深部肿瘤合适的替代疗法。本研究采用低强度超声治疗仪联合声诺维（Sono Vue,注射用六氟化硫微泡）产生大量活性氧,诱导卵巢癌细胞（卵巢癌SKOV3）发生细胞凋亡,并进一步探讨声动力疗法的抗肿瘤机制。首先采用CCK-8法筛选出卵巢癌SKOV3细胞的最适超声强度,最适辐照时间以及最佳药物浓度,通过Calcein（绿色,活细胞）/PI（红色,死细胞）双染检测细胞死亡情况;再利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况。确定声诺维的最佳药物浓度是12.5μg/ml,最适超声强度是0.75W/cm,最佳辐照时间为30s,在声诺维浓度是12.5μg/ml,声强为0.75W/cm辐照30s,可显著诱导人卵巢癌SKOV3细胞产生大量活性氧,诱导细胞发生发生凋亡。在研究SDT抗肿瘤机制方面,采用CCK-8法检测细胞活力,划痕实验及Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力;通过DCFH-DA探针检测细胞内ROS产生情况,Fluo-4AM探针检测细胞内钙离子含量以及Western Blot检测细胞凋亡的相关蛋白表达;通过透射电镜观察治疗后卵巢癌SKOV3细胞的超微结构改变。最后利用RNA测序（RNA sequencing,RNA-Seq）检测转录组的差异表达,然后利用GO和KEGG通路富集和分析与凋亡相关的靶基因和通路,在卵巢癌SKOV3细胞队列中寻找差异表达基因的表达。研究发现声动力疗法能够产生ROS,诱导卵巢癌SKOV3细胞内钙离子超载,进而发生钙超载诱导的细胞凋亡。如上所述,本研究证实声动力疗法能够诱导卵巢癌SKOV3细胞发生凋亡,有效抑制增殖迁移,抑制肿瘤生长,认为其主要的机制是声动力疗法联合声诺维产生大量ROS,诱导癌细胞发生钙离子相关凋亡途径,从而发挥抗肿瘤效应。

关键词： 胰腺癌   EMP1   生物信息学   增殖   侵袭   迁移   PI3K-AKT  

摘要： 目的:探索EMP1在胰腺癌细胞中的生物学作用及促癌机制。阐明EMP1在人胰腺癌细胞中的差异表达及其对胰腺癌As PC-1、Bx PC-3细胞生物学行为的影响及其下游分子机制,为胰腺癌患者在预后评估和分子靶向治疗方面提供理论依据。方法:首先在TCGA、GTEx数据库中分析EMP1在胰腺癌组织中的表达情况及其与临床预后的关系,通过EMP1共表达基因的GEO分析和KEGG通路富集分析,探索EMP1可能参与调控的胰腺癌进展信号通路。其次培养胰腺癌细胞系,通过RT-PCR、WB检测EMP1 m RNA及蛋白水平的表达差异。构建慢病毒载体,分别转染胰腺癌As PC-1、Bx PC-3细胞系获得敲低实验组(EMP1-sh1、EMP1-sh2、EMP1-sh3),转染空白载体病毒获得阴性对照组(Negative control)。采用CCK8、克隆形成、划痕、Transwell实验检测下调EMP1对胰腺癌细胞生物学行为的影响,WB检测下调EMP1对胰腺癌细胞增殖、凋亡及下游相关分子信号通路蛋白的影响。结果:1.与正常胰腺组织和细胞相比,EMP1在癌组织和细胞中高表达,对胰腺癌患者有临床诊断意义。EMP1高表达是胰腺癌患者预后的一个独立危险因素,与预后不良密切相关,是潜在的一个预后生物标志物。GEO结果显示,EMP1涉及多个生物过程和分子功能。KEGG通路富集结果显示EMP1通过PI3K-AKT等多种信号通路影响胰腺癌的进展。2.与正常胰腺上皮细胞相比,EMP1 m RNA和蛋白在胰腺癌细胞系中高表达(P<0.05)。下调EMP1的表达可显著抑制As PC-1、Bx PC-3细胞的增殖、侵袭及迁移能力(P<0.05)。***富集分析显示,大部分基因富集在PI3K-AKT通路中。在胰腺癌细胞系中下调EMP1显著降低了P-PI3K、P-AKT蛋白表达。与Negative control组相比,敲低EMP1癌细胞凋亡蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,Bcl-2/Bax比值降低。结论:胰腺癌组织细胞中EMP1的高表达对胰腺癌的诊断和预后有一定的价值,EMP1的高表达与患者预后不良有关。其机制可能是EMP1通过PI3K-AKT途径促进癌细胞的增殖、侵袭、迁移,并抑制癌细胞的凋亡。因此,EMP1在胰腺癌中对肿瘤生长起到支持作用,可能成为胰腺癌诊断、治疗及预后的潜在靶点。

关键词： 子痫前期   胎盘   水肿   炎性因子   脐带间充质干细胞   增殖分化  

摘要： 目的:子痫前期（Preeclampsia,PE）是一种以胎盘血流灌注不足引起缺血缺氧为重要发病基础的常见妊娠并发症。本实验通过对比观察PE及正常产妇胎盘组织中炎性因子（IL-2/4/6/10/17、TNF-α、INF-γ）水平及脐带间充质干细胞生物学特性的变化,探讨子痫前期宫内炎性微环境对子代脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）的生物学特性的影响,为临床改善子痫前期母胎健康提供参考。方法:1.试验分组及组织预处理:收集山西省妇幼保健院2021年10月至2022年10月生产的孕妇10例,分为PE组5例和健康对照组5例。三组孕妇均在剖宫产手术后立即采集脐带和胎盘组织,脐带进行UC-MSCs提取培养,胎盘组织冻存;***-MSCs的分离和培养:两组脐带组织均在采集后短时间内低温运送到实验室,在超净工作台下剔除脐带的被膜和血管后,将内部的华通氏胶组织分离出来,剪碎至1mm3以下,采用组织贴壁法进行原代培养,细胞爬出至融合度达80%后消化传代,部分冻存,部分传代至P3代用于后续实验;***-MSCs的形态学:用倒置显微镜观察两组UC-MSCs的形态特征并拍照记录;***-MSCs的增殖能力:采用细胞计数法比较两组UC-MSCs增殖能力。用24孔板进行细胞增殖培养,种板48h后次日开始每天取三个孔进行细胞计数并取平均值,连续7天记录并绘制生长曲线;***-MSCs的迁移能力:采用细胞划线法比较两组UC-MSCs的迁移能力,并在不同时间点进行（0,6,12,24h）拍照记录,Image J软件进行分析比较;***-MSCs的分化能力:两组细胞进行成骨成脂诱导,21天后茜素红染色测定成骨情况,油红O染色测定成脂情况。用IPP图文软件分析其积光分光密度值（Integrated optical density,IOD）;7.胎盘组织含水量的比较:通过干重法测定胎盘组织的含水量,以此指标衡量两组胎盘组织的水肿情况;8.胎盘组织炎性因子的表达水平:采用双抗体夹心法磁性微球流式免疫荧光技术检测胎盘组织中炎性因子的表达。磁珠表面包被IL-2/4/6/10/17、TNF-α、INF-γ捕获抗体,分别与样本中的相应因子特异性结合后再结合藻红蛋白标记的检测抗体,每种微球藻红蛋白通道的荧光强度与样本中对应抗原含量水平相关。通过流式细胞仪测定荧光强度,参照标准曲线,计算样本中相应因子的含量水平。结果:1.两组脐带组织肉眼观察和UC-MSCs镜下观察肉眼观察:正常组的脐带组织形状如绳索、表面光滑透明,切面少见华通氏胶组织水肿、血管扩张和血管内淤血现象;PE组的脐带组织形状多如扭曲绳索,切面见脐带组织明显水肿,华通氏胶呈透明、拉丝状态,血管明显扩张,常见较大淤血块。UC-MSCs镜下观察:正常组UC-MSCs在组织贴壁5-7天后相继爬出,细胞呈细长的小梭形,相互平行或漩涡状排列,细胞密度增加时细胞形态变细长,传代后的细胞以均一的长梭形细胞为主,呈漩涡状排列;PE组UC-MSCs在组织贴壁8-10天后缓慢爬出,细胞多相互分离并呈现分散分布,细胞形态呈多角形,胞体较大,增殖缓慢,传代后细胞胞体变大呈扁平状,排列较为紊乱,呈现老化状态,且细胞密度增长较为缓慢。2.两组UC-MSCs的增殖能力比较连续7天采用细胞计数法检测两组UC-MSCs的增殖能力。结果显示,正常组和PE组UC-MSCs生长曲线走势大致相同,均经过了潜伏期、指数生长期、停滞期,但PE组较正常组UC-MSCs整体增殖缓慢且提前进入停滞期。3.两组UC-MSCs的迁移能力比较倒置显微镜拍照并用Image J软件测量细胞划痕的面积发现,PE组UC-MSCs的迁移能力明显弱于正常组。4.两组UC-MSCs的分化能力比较两组UC-MSCs经成骨成脂诱导,均能观察到有矿化结节和脂滴形成,说明两组的UC-MSCs均具备成骨成脂分化能力;经IOD值测定,PE组成骨分化程度（2224.54±62.29）低于正常组成骨分化程度（5087.52±95.00）,PE组成脂（8631.60±102.58）分化程度低于正常组成脂分化程度（13030.58±727.60）,成骨成脂分化程度差异具有显著性（P<0.001）。5.两组胎盘组织含水量比较PE组胎盘组织的含水量（0.8540±0.019）明显高于正常组（0.8424±0.006）,差异具有显著性（P<0.001）,说明PE组胎盘组织存在水肿现象。6.两组胎盘组织炎性因子表达水平比较经流式测定两组胎盘组织炎性因子的含量水平发现,IL-2的含量PE组为1.65±0.13 pg/g,正常组为1.53±0.14 pg/g;IL-4的含量PE组为2.52±0.19 pg/g,正常组为2.49±0.51 p

关键词： 胃癌   5’-tiRNAGly基因   基因表达   OGDHL基因   细胞生物学   Warburg效应   代谢重编程  

摘要： 目的：检测5’-tiRNAGly在胃癌患者血清中的相对表达水平，探究其作为胃癌诊断和预后标志物的潜能;从体外和体内探究5’-tiRNAGly对胃癌生物学进程的影响;探究5’-tiRNAGly和OGDHL的结合及调控关系，研究其对胃癌细胞生物学功能的影响，深入探究5’-tiRNAGly靶向OGDHL增强胃癌Warburg效应调控胃癌代谢重编程的机制。　　方法：高通量测序筛选胃癌组织中差异表达的tsRNAs;RT-qPCR检测5’-tiRNAGly在胃癌血清、组织和细胞中的表达水平;通过ROC曲线分析5’-tiRNAGly在胃癌患者血清中的诊断效能;卡方检验、Kaplan-Meier生存分析用于研究胃癌血清中5’-tiRNAGly的表达水平与临床病理参数的相关性及其预后价值;CCK-8、克隆形成、EdU、Transwell实验、流式细胞术和裸鼠成瘤实验检测5’-tiRNAGly对胃癌生物学进程的影响;核浆分离实验和荧光原位杂交实验用于检测5’-tiRNAGly的亚细胞定位;双荧光素酶报告基因实验用于验证5’-tiRNAGly与OGDHL的结合关系;LC-MS/MS质谱检测胃癌细胞的能量代谢产物;功能回复实验验证5’-tiRNAGly靶向OGDHL调控胃癌细胞Warburg效应和生物学功能;Western blot实验验证5’-tiRNAGly靶向OGDHL激活糖酵解关键酶和PI3K/Akt/mTOR信号通路。　　结果：高通量测序和RT-qPCR检测发现5’-tiRNAGly的表达水平在胃癌组织中显著升高。与健康体检者和胃炎患者相比，胃癌患者血清中5’-tiRNAGly的表达水平显著升高。生存曲线显示高5’-tiRNAGly表达水平的患者总体生存率较低。ROC曲线显示5’-tiRNAGly在血清中的表达水平可以区分胃癌患者与健康体检者和胃炎患者，具有较好的诊断效能，且在与临床常用肿瘤标志物联合后诊断效能进一步提高。临床病理资料相关性分析显示5’-tiRNAGly的表达水平与T分期、淋巴结转移、TNM分期和神经/脉管侵犯相关。　　体外细胞功能实验发现5’-tiRNAGly可以增强胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而对胃癌细胞的凋亡起抑制作用。体内裸鼠成瘤实验发现抑制5’-tiRNAGly可以抑制肿瘤组织的生长。KEGG富集分析显示5’-tiRNAGly的靶基因在代谢通路中富集。检测胃癌细胞的葡萄糖摄取量和乳酸生成量发现5’-tiRNAGly可以增强胃癌细胞的Warburg效应。生物信息学分析预测了5’-tiRNAGly的靶基因OGDHL。双荧光素酶实验验证了5’-tiRNAGly与OGDHL的结合关系。α酮戊二酸脱氢酶活性检测发现OGDHL与α酮戊二酸脱氢酶活性的活性呈正相关。LC-MS/MS质谱分析结果显示抑制5’-tiRNAGly或过表达OGDHL后α酮戊二酸含量减少，三羧酸循环增强。功能回复实验发现，OGDHL可以有效回复5’-tiRNAGly对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和Warburg效应的作用。此外，5’-tiRNAGly可以上调糖酵解关键酶的蛋白表达并激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，这种效果可以被OGDHL所挽回。　　结论：5’-tiRNAGly在胃癌组织和血清中表达上调，具有成为胃癌诊断和预后生物标志物的潜能;5’-tiRNAGly在体内外均可以促进胃癌的生物学进程;5’-tiRNAGly通过靶向OGDHL降低了OGDHC的活性，抑制三羧酸循环，同时上调了糖酵解关键酶的表达并激活PI3K/Akt/mTOR通路，共同增强了胃癌细胞的Warburg效应，促进了胃癌的恶性进展。

关键词： GSDMD   RECQL4   肝癌生物学行为  

摘要： 目的:肝癌因早期诊断效率不足和进展迅速而常致预后不良,传统的治疗方式依赖于手术切除和放化疗,但多数患者面临着治疗后复发以及远处转移的风险,积极探索其致病机制以寻找适宜的肿瘤治疗新方式已迫在眉睫。目前,越来越多的研究表明肿瘤进展与免疫微环境的炎性改变相关。细胞焦亡(Pyroptosis)是一种与凋亡有区别的程序性细胞死亡方式,其特征在于膜孔道形成以及含有IL-1β和IL-18的促炎细胞内容物的成熟和释放。作为免疫调控的重要组成部分,其发生在不同程度上通过调控抗肿瘤免疫效力以影响肿瘤的进展。在焦亡中,Gasdermin D(GSDMD)是调控焦亡发生的关键效应蛋白,caspase-1的活化会对GSDMD进行切割以产生GSDMD-N端,GSDMD-N端与细胞膜结合后会在膜上产生膜孔道并促进细胞膨胀破裂以释放大量细胞内容物,并诱导IL-1β和IL-18等炎症因子活化,最后引起严重的细胞炎症反应。然而,目前的研究集中于GSDMD-N介导的细胞焦亡对肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)重塑及肿瘤进展的影响而忽略了GSDMD对肿瘤增殖迁移的作用。此外,线粒体作为代谢活动中心,为肿瘤发展提供营养和能量,而GSDMD是否能通过影响线粒体功能进而调控肿瘤进展尚不得知。因此,我们旨在探讨GSDMD本身对肿瘤进展的影响,并通过实验分析GSDMD以何种方式参与调控肝癌进展,以期为针对GSDMD的肿瘤靶向治疗提供参考。方法:将泛癌转录组数据进行清洗和标准化处理,分析GSDMD在泛癌中的差异表达以及预后相关情况,比较GSDMD在不同肿瘤中的表达水平与基因组不稳定性、DNA修复、癌症干性、RNA表观遗传修饰、免疫浸润和药物敏感性之间的关联以及统计学意义。将肝癌预后相关基因与线粒体功能相关基因取交集并分析它们与GSDMD的相关性,选择与GSDMD最具相关性的基因进行后续实验,分别敲低GSDMD与线粒体相关基因以观测其对肝癌增殖、迁移与侵袭的影响,并用Western Blotting验证与GSDMD最具相关性的肝癌预后相关线粒体基因之间的关系。结果:生物信息学分析提示GSDMD在肝细胞癌(Liver hepatocellular carcinoma,LIHC)、多发性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)等肿瘤中存在具有明显统计学意义的差异表达(P<0.05),GSDMD的表达提示肝细胞癌等肿瘤的预后不良,这可能是因为GSDMD的表达通过影响肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)、purity(染色体不稳定性的标志)、DNA错配修复、RNA表观遗传学修饰(m1A、m5C、m6A)、免疫浸润、趋化因子等因素参与肿瘤进展。相较于正常肝细胞,GSDMD在肝癌细胞中高表达并且GSDMD在肝癌细胞中被敲低后会抑制肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭。RECQL4是线粒体相关基因,其表达能维持线粒体功能完整并促进肝癌的增殖、迁移与侵袭,且GSDMD可能和RECQL4共同促进肝癌进展。结论:GSDMD与RECQL4共同促进肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭。