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关键词： 细胞生物学   脂质转移蛋白   脂质稳态   囊泡运输  

摘要： 脂质作为生物膜的重要组成部分，参与多种细胞生物学过程。脂质主要在内质网（ER）中合成，而后经囊泡运输或非囊泡运输途径运输到各类膜性细胞器以维持它们的脂质稳态和功能特异性。氧化固醇结合蛋白（OSBP）及其相关蛋白（ORPs）是一类保守的脂质转移蛋白（LTP）家族，在非囊泡脂质运输、脂类代谢以及信号转导等过程中发挥着重要作用。ORP10是OSBP/ORPs家族的蛋白成员之一，主要定位于ER和反式高尔基体管网状结构（TGN）膜接触位点（MCSs）。之前有研究表明ORP10参与磷脂酰丝氨酸（PS）的转运，但对其功能尚未深入研究。本论文探究了 ORP10的亚细胞定位、脂转运模式和生物学功能。主要研究内容如下:　　***10以ORP9依赖的形式定位在ER-TGN MCSs　　本节我们首先利用免疫沉淀（IP）和质谱分析鉴定了与ORP10有结合的蛋白，发现同家族的ORP9与ORP10存在相互作用。外源性以及内源性免疫共沉淀（Co-IP）结果确定了二者的相互作用。此外，GST pull-down实验结果表明，只有在ORP9存在的情况下，ORP10才能间接结合ER膜蛋白VAPA。接下来，我们探究了 ORP9对ORP10定位的影响。我们发现在野生型细胞中，ORP10与ER和TGN部分共定位，ORP10的PH结构域并不影响其定位。然而，在ORP9敲除（KO）细胞中，ORP10在ER的定位明显降低，而在TGN的定位无明显变化。但是，截断突变体ORP10△PH呈胞质弥散分布，不再定位在ER-TGN MCSs。这些结果表明ORP10以ORP9依赖的形式定位于ER-TGN MCSs。　　***9和ORP10通过CC结构域形成异源二聚体　　在明确了 ORP9对ORP10的影响之后，我们继续探究了二者的结合模式。有研究报道OSBP/ORPs家族创始成员OSBP能通过卷曲螺旋（CC）结构域形成同源二聚体。因此，我们推测ORP9和ORP10也可能通过类似的方式结合。为了验证这一猜想，我们利用AlphaFold和PSIPRED对OSBP、ORP9和ORP10进行了蛋白三级结构预测和二级结构分析，发现ORP9和ORP10也含有结构保守的CC结构域。此外，结合GST pull-down实验和细胞实验，我们发现ORP9和ORP10也是通过CC结构域相互作用。但是，与OSBP不同的是，ORP9和ORP10仅存在异源相互作用。　　***9和ORP10通过PH结构域结合PI4P特异性靶向TGN　　接下来，我们探究了 ORP9和ORP10的脂质结合特异性。我们原核表达纯化了ORP9和ORP10的PH结构域，利用脂质结合实验和脂质体共浮选实验，确定了 ORP9和ORP10的PH结构域均特异性地结合磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）。亚细胞定位实验也表明，不管是ORP9还是ORP10的PH结构域都与细胞内PI4P共定位。使用PI4KⅢβ激酶抑制剂IN-9处理细胞后，ORP9和ORP10的PH结构域的定位发生明显变化，说明二者的定位受PI4P水平的影响。此外，与对照组相比，在IN-9处理后，ORP10与晚期内体（LE）的标志物Rab7A的共定位明显增多。这表明IN-9处理后，TGN的PI4P水平降低，导致ORP10从含有低水平PI4P的TGN转移到PI4P相对较多的LE上。这些数据表明，ORP9和ORP10的PH结构域与PI4P的相互作用对ORP9和ORP10的亚细胞定位至关重要。　　***9和ORP10转运PI4P调控囊泡释放和分泌　　最后，我们探究了 ORP9和ORP10对TGN功能的影响。我们发现，单独敲除ORP9或ORP10亦或二者同时敲除导致了 TGN上PI4P的积累。基于ORP9和ORP10对TGN上PI4P的影响，我们利用体外重组实验探究了 ORP9和ORP10的PI4P转移活性，发现二者均能够高效介导PI4P的转运。由于OSBP/ORPs家族成员具有双向脂质转运能力，我们进一步探究了 ORP9和ORP10的反向转运脂质。利用PS转运实验和胆固醇转运实验，我们发现ORP9和ORP10均能够快速转运PS,而且PI4P的存在显著提高了 PS的转运速率。然而，二者则不具有胆固醇能力。因此，我们得出结论，ORP9和ORP10的反向转运脂质分子是PS而非胆固醇。近年来的研究表明，TGN中富含的PI4P在囊泡生物发生和运输过程中发挥着关键作用。基于此，我们探究了ORP9和ORP10对囊泡生物发生和运输的调控作用。利用VSV-G分泌实验，我们发现ORP9和ORP10双敲除促进了 VSV-G囊泡的形成及其向质膜（PM）的运输。　　总之，我们的研究揭示了 ORP9和ORP10在细胞器互作中的生物学功能和作用机制。ORP10以ORP9依赖的模式定位在ER-TGN MCSs。二者以二

关键词： 糖原合成激酶3   神经干细胞   神经发生   神经元分化  

摘要： 研究背景阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)的特点是大脑皮层、海马和其他皮层下结构的神经变性,额、颞叶皮质细胞大量死亡,最终导致记忆及认知功能障碍。因此,深入探究延缓神经元死亡或增加神经发生的分子机制将为AD的防治提供新的策略。本课题组之前的研究发现,在Aβ激活小胶质细胞所致炎性环境下,去乙酸化酶SIRT3能诱导神经干细胞分化为神经元,在该过程中糖原合成激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)蛋白表达下调,p-GSK3β表达增加,提示GSK3可能参与调控AD中的神经发生。GSK3是参与多种细胞过程的丝/苏氨酸激酶,具有两种亚型,即GSK3α和GSK3β,二者在许多生物过程中发挥不同但又重叠的功能。目前大多研究强调GSK3β在细胞功能和疾病中的作用,而低估GSK3α的功能。研究目的探讨GSK3同工酶可能参与介导AD神经发生的过程,调控神经干细胞的生物学功能,以期阐明GSK3同工酶调控AD神经发生的不同作用,同时为GSK3α在神经发生中的功能提供实验依据。研究方法构建Transwell系统将神经干细胞C17.2和小胶质细胞BV.2进行共培养,对共培养模型中的C17.2细胞进行GSK3α/β过表达及其基因沉默上调或下调GSK3α/β的表达,采用CCK8、EdU、Western blot及免疫荧光技术等探究GSK3α/β对NSC增殖、分化、凋亡三方面的影响。研究结果1、GSK3α和GSK3β抑制共培养模型中NSC的增殖和凋亡CCK8、EdU及流式细胞术结果表明相比于空白对照,Aβ激活小胶质细胞的微环境会导致NSC增殖下降,并促进其凋亡;与共培养模型组相比,过表达GSK3α/β能进一步抑制共培养模型中NSC增殖,促进NSC凋亡;而抑制GSK3α/β则可促进共培养模型中NSC的增殖,抑制其凋亡。其中,相比于GSK3β,GSK3α对共培养模型中NSC增殖及凋亡的作用更加显著。2、GSK3α和GSK3β抑制共培养模型中NSC的分化免疫荧光染色和Western blot结果表明相比于空白对照,Aβ激活小胶质细胞的微环境会抑制NSC向神经细胞分化,且促进其分化为胶质细胞;与共培养模型组相比,过表达GSK3α/β抑制共培养模型中NSC向神经元分化,而胶质细胞分化不受影响。沉默GSK3α/β促进共培养模型中NSC向神经元分化,并抑制其向胶质细胞分化。其中,与GSK3α比较,GSK3β调控NSC分化的作用更显著。研究结论综上所述,在Aβ激活小胶质细胞所致炎性环境中,GSK3同工酶的过表达会抑制NSC增殖,并且促进NSC的凋亡。其中,相比于GSK3β,GSK3α在NSC增殖和凋亡方面的调控作用更加显著;在NSC分化方面,沉默GSK3α/β促进共培养模型中NSC向神经元分化,同时抑制其向胶质细胞分化。其中,GSK3β在调控NSC分化的过程中占优势作用。本课题初步探究GSK3α和GSK3β差异调节AD中NSC的发育过程,对未来开发更多选择性针对于GSK3同工酶的特异性药物提供实验及理论支持。

关键词： 医学细胞生物学   教学内容   教学改革  

摘要： 随着医学的进步和发展，其专业化程度也逐步提升。原有存在的一些传统的教学模式存在一定的弊端，不能适应现代医学发展的步伐，在“新医科”以及信息化的时代背景之下，提升医学相关专业的教学质量尤为重要。本文将从教学内容的优化、教学方法和教学手段的改革、改革成效三方面展开探讨，针对医学细胞生物学的教学设计及改革进行分析论述。

关键词： 复发性流产   IL-37   滋养细胞侵袭迁移   巨噬细胞极化  

摘要： 研究背景及目的:复发性流产(Recurrent miscarriage,RM)是指在妊娠20周前,与同一配偶连续发生2次及2次以上自然流产的异常妊娠,常见于妊娠早期。除发病原因明确外,依然有约60%～70%的不明原因流产,被称之为不明原因复发性流产(Unexplained recurrent miscarriage,URM)。由于病因不明,无法选用针对性强的特异性治疗,成为了临床复发性流产的诊治难点。因此,对复发性流产的病因及机制研究意义重大。母体和胎儿的相互作用对于维持母胎免疫耐受至关重要,母胎界面的细胞类型主要有滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞。蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞来自于母体,而滋养细胞则来自于胎盘。在母胎界面中,孕早期蜕膜巨噬细胞占蜕膜总白细胞的20%～30%,是蜕膜免疫细胞中的一个重要组成部分,可参与胚胎植入、胎盘发育等生理过程,以维持妊娠的顺利进行。白细胞介素-37(Interleukin 37,IL-37)是IL-1家族的一员,作为炎症和免疫反应的天然抑制剂发挥作用。它的结构与IL-1家族的其他成员相似,由十二个β管状结构组成。IL-37的分子量约为17～25 k Da,被广泛地表达于人体各种组织,例如肺、胸腺、骨髓、胎盘以及子宫组织等。最近的研究表明,IL-37可影响多种肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。由于人类胎盘的侵袭过程和滋养层细胞的行为与恶性肿瘤细胞相似。同时,IL-37与免疫炎症性疾病的发生和发展密切相关。因此,我们推测:母胎界面表达的细胞因子IL-37是否也参与调控滋养细胞功能以及母胎免疫耐受的形成。本研究将探讨IL-37在母胎界面的表达模式及生物学意义。方法:(1)临床样本实验:收集RM患者和正常对照组妊娠早期的绒毛和蜕膜组织,通过q RT-PCR实验、免疫印迹实验(Western blot,WB)、免疫组织化学技术(IHC)以及免疫荧光技术(IF)对IL-37及其受体SIGIRR在早孕期绒毛组织以及蜕膜组织中的表达及定位进行检测。此外,通过免疫荧光(IF)技术检测正常妊娠女性和RM患者蜕膜组织中巨噬细胞表达模式,并观察其与蜕膜绒毛外滋养细胞(Extravillous trophoblast,EVT)的关系。(2)体外实验:运用IL-37重组蛋白处理HTR8/SVneo滋养细胞,并运用划痕实验和Transwell实验对滋养细胞的迁移能力和侵袭能力进行检测。WB实验检测滋养细胞凋亡相关蛋白以及EMT相关标志物的表达水平。Ed U实验检测IL-37对滋养细胞增殖能力的影响。绒毛外植体实验进一步检测IL-37对滋养细胞功能的影响。此外,体外建立M1巨噬细胞模型,通过观察细胞形态以及q RT-PCR实验验证IL-37是否可以抑制M1巨噬细胞极化以及炎症效应。运用生物信息学方法分析RNA-seq的测序数据,寻找M1巨噬细胞极化过程中可能涉及的信号通路,并加以验证。同时,运用IL-37重组蛋白处理M1巨噬细胞,WB检测相关信号通路的改变。(3)体内实验:建立正常妊娠小鼠模型和复发性流产小鼠模型,收集外周血以及蜕膜组织,原代分离获取免疫细胞,运用流式细胞术分析正常妊娠小鼠和复发性流产小鼠外周血以及蜕膜组织中CD86+巨噬细胞(M1型)及CD206+巨噬细胞(M2型)的比例。将流产小鼠分为两组,一组给予10 m L/kg无菌PBS腹腔注射处理,另一组以同样的方式给予10μg/kg IL-37重组蛋白处理。孕13.5天时,分别观察两组小鼠的胚胎吸收率,并收集两组小鼠的外周血以及蜕膜组织提取免疫细胞,利用流式细胞术分析两组小鼠M1及M2巨噬细胞的比例。结果:(1)与对照组相比,IL-37的分子及蛋白表达水平在RM组绒毛组织中均降低。且IL-37主要定位于合体滋养层细胞(Syncytiotrophoblast,STB)和细胞滋养层细胞(Cytotrophoblast,CTB)。在体外实验时,IL-37增强了HTR8/SVneo滋养细胞的侵袭和迁移能力,并促进绒毛外植体向外生长,但对HTR8/SVneo滋养细胞的增殖和凋亡没有影响。此外,IL-37可调节HTR8/SVneo滋养细胞的上皮-间质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)过程。(2)与正常妊娠组相比,RM患者蜕膜组织中巨噬细胞增多,且在巨噬细胞周围有EVT细胞的富集。此外,IL-37在HLA-G阳性的EVT细胞亦有表达。M0巨噬细胞经LPS诱导处理后,细胞呈M1巨噬细胞形态特征,M1巨噬细胞标志物i NOS和巨噬细胞M1极化后释放的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平显著上调。运用IL-37重组蛋白进行干预后,细胞形态呈M0样的圆形,M1巨噬细胞标志物i NOS和巨噬细胞M1极化后释放的促炎细胞

关键词： 丝氨酸棕榈酰转移酶的长链碱性亚基1   宣威肺癌   氧化磷酸化   鞘脂   细胞侵袭  

摘要： 【目的】本研究旨在探讨SPTLC1在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中的表达,研究其对肺腺癌细胞生物学功能的影响,预测其在肺腺癌中发挥生物学功能的可能机制。【方法】1.在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中SPTLC1蛋白表达情况的检测方法本研究收集经手术切除的宣威非吸烟女性肺腺癌患者肿瘤组织和配对癌旁组织105对,并利用免疫组化技术检测SPTLC1蛋白的表达水平,比较两组间蛋白表达差异。***1基因对肺腺癌细胞生物学功能调控的研究2.1工具细胞株的筛选以永生化人支气管上皮细胞株Beas-2b为对照,采用Western Blot技术检测人肺腺癌细胞系A549、H838、H1734、H1299、H1975、XWLC-05、HCC827中SPTLC1蛋白的表达水平,根据SPTLC1蛋白的相对表达量选取相对表达量最高的细胞株以及相对表达量最低的细胞株作为工具细胞。2.2工具细胞株的构建利用CRISPR/Cas9技术构建SPTLC1基因敲除细胞株,并通过慢病毒转染构建SPTLC1稳定过表达细胞株。2.3 SPTLC1基因敲除及过表达对肺腺癌细胞生物学功能的影响研究采用CCK-8实验、Transwell侵袭实验、划痕实验、流式细胞学技术在细胞水平研究SPTLC1对肺腺癌细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力、细胞生长周期及凋亡的影响。3.预测SPTLC1基因对肺腺癌生物学功能调控的可能分子机制对SPTLC1过表达单克隆细胞采用转录组测序的方法,筛选差异表达基因进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析,预测SPTLC1发挥生物学功能的可能机制。【结果】1.在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中SPTLC1蛋白的表达水平SPTLC1在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中的阳性率表达率为94.29%(99/105),在配对癌旁组织中的阳性率为24.76%(26/105),SPTLC1基因在宣威非吸烟女性肺腺癌组织中的阳性率表达率显著高于配对癌旁组织,差异具有显著性(P<0.01)。***1基因对肺腺癌细胞生物学功能的调控情况2.1工具细胞株的筛选肺腺癌细胞株A549、H838、H1734、H1299、H1975、HCC827中SPTLC1蛋白的表达水平均高于Beas-2b。其中A549的相对表达量最高,XWLC-05中SPTLC1蛋白的表达水平低于Beas-2b,因此选择A549细胞和XWLC-05细胞作为工具细胞进行后续实验。2.2成功构建SPTLC1基因敲除及过表达细胞株成功构建3条不同的SPTLC1基因敲除质粒,CRISPR-Cas9敲除载体及STPLC1过表达载体均通过慢病毒成功转染A549细胞和XWLC-05细胞,Weastern blot检测SPTLC1蛋白水平的表达,A549细胞敲除组SPTLC1蛋白表达水平低于对照组,XWLC-05细胞过表达组SPTLC1蛋白表达水平高于对照组,SPTLC1基因敲除及过表达细胞株构建成功。2.3 SPTLC1基因敲除及过表达对肺腺癌细胞生物学功能的影响(1)SPTLC1敲除组细胞较对照组细胞的增殖能力增强,差异具有统计学意义(P<0.05);SPTLC1过表达组细胞的增殖能力较对照组细胞无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)SPTLC1敲除组细胞较对照组细胞的侵袭能力增强,差异具有统计学意义(P<0.05);SPTLC1过表达组细胞较对照组细胞的侵袭能力降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)SPTLC1敲除组细胞较对照组细胞的迁移能力增强,差异具有统计学意义(P<0.05);SPTLC1过表达组细胞较对照组细胞的迁移能力无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(4)SPTLC1敲除组较对照组细胞其G0/G1期比例比例明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),S期比例明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),G2/M期比例无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结合CCK-8实验结果,SPTLC1基因敲除后可以促进A549细胞进入S期,进而促进细胞增殖;SPTLC1过表达组较对照组细胞其G0/G1期比例无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),S期无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),G2/M期比例无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结合CCK-8实验结果,SPTLC1基因过表达后对XWLC-05细胞的生长周期无明显影响。(5)SPTLC1敲除组细胞较对照组细胞其总体凋亡比例无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);SPTLC1过表达组细胞较对照组细胞其总体凋亡比例无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。3.转录组测序结果及分析通过转录组测序并分析其结果,共筛选出差异表达基因(DEGs)27个,GO功能富集分析结果显示,SPTLC1可能和线粒体呼

关键词： 细胞生物学   科学思维   教学改革  

摘要： 《细胞生物学》作为生物学领域的重要前言学科,具有知识、技术更新迅速等特点,其发展需要更多的创新型人才,而拥有科学思维能力是创新创造人才培养的关键。因此基于科学思维的《细胞生物学》教学改革势在必行。本文通过探讨教学过程中教师主导作用弱化、学生科学学习理念缺乏、实验课程教学方式陈旧等原因引起的学生科学思维培养欠缺问题,从科研素质培养、教学方法改变、实验教学内容优化三个方面提出相应的改革措施。希望相关建议能够为《细胞生物学》教学改革提供有效参考。

关键词： 细胞生物学实验课程   多元化教学设计   细胞化学染色实验  

摘要： 文章首先阐述了细胞生物学实验课程多元化教学设计的重要性,然后提出了细胞生物学实验课程多元化教学设计的要求与路径,最后论述了细胞生物学实验课程多元化教学设计实例。

关键词： 普萘洛尔   食管鳞癌   细胞培养   增殖   迁移   周期   凋亡   自噬   裸鼠  

摘要： 目的:探索普萘洛尔对食管鳞癌细胞皮下成瘤和食管鳞癌(ESCC)细胞增殖、迁移、周期、凋亡、自噬的影响及其可能的分子机制。方法:MTT(噻唑蓝)检测细胞增殖:常规培养食管鳞癌Eca109、KYSE-450、TE-1细胞,设置PBS组(不加Propranolol),加药组(40、60、80、100μmol/L),每组5个复孔,分别处理0、24、48、72 h后,每孔加入MTT 10μl(5 mg/ml),490 nm处测定吸光度值。Transwell检测迁移:常规培养食管鳞癌Eca109、KYSE-450、TE-1细胞,设置PBS组(不加Propranolol),加药组(40、60μmol/L),每组2个复孔,40 h后拍照,实验重复三次后统计学分析。流式细胞术检测细胞周期及凋亡:常规培养食管鳞癌Eca109、KYSE-450、TE-1细胞,设置PBS组(不加Propranolol),加药组(80μmol/L),固定、染色,检测488 nm处荧光。Western blot检测蛋白表达:常规培养食管鳞癌Eca109、KYSE-450细胞,设置PBS组(不加Propranolol),加药组(60、80μmol/L),凝胶电泳,湿法转膜,ECL显影,实验重复三次后统计学分析。裸鼠皮下成瘤实验:10只裸鼠,设置PBS组(不加Propranolol)和Propranolol组(加药组),每组5只,均接种Eca109细胞5×10^(6)cells/100μl于右侧腋下,加药组隔日灌胃,每次0.4 ml(6 mg/kg),期间隔日测量肿瘤大小,持续3周。20 d后处死裸鼠取瘤体组织。结果:结果显示Propranolol可抑制Eca109、KYSE-450、TE-1细胞增殖,48h IC_(50)均为70μmol/L;抑制Eca109、KYSE-450、TE-1细胞迁移,且具浓度依赖性(P<0.05);阻滞Eca109细胞周期于G2/M期,阻滞KYSE-450细胞和TE-1细胞周期于G0/G1期,并促进三种细胞凋亡(P均<0.05);细胞免疫荧光结果显示Propranolol处理TE-1细胞12 h、24 h、36 h后LC3荧光强度增加(P均<0.05);Western blot结果显示与PBS组比较,加药组p-mTOR、p-Akt、cyclin D1蛋白表达量下调、cleaved caspase 9蛋白水平上调(均P<0.05);裸鼠皮下成瘤结果显示对照组瘤重(0.91±0.05)g,实验组瘤重(0.65±0.12)g,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:普萘洛尔抑制ESCC细胞增殖、迁移、周期,促进其凋亡和自噬,并抑制裸鼠皮下肿瘤生长,其机制可能与其抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

关键词： 细胞生物学   流式细胞术   实验教学   教学改革  

摘要： 流式细胞术是目前生命科学、医药研究以及临床诊断中最常用的技术手段之一。为了让实验教学紧跟科学研究及临床诊断的实际需求,同时增加学生在实验教学过程中的思考性和参与度,课题组将流式细胞术分析小鼠脾脏原代分离的淋巴细胞引入细胞生物学实验教学,实验中设置大量开放性思考问题,涵盖分离细胞的方法、抗体的选择、实验结果的分析等,尽量在各个环节给予学生独立思考的空间。经过教学检验,学生的知识得到了强化,技能得到了提升,科研兴趣得以调动。后续实习证明,实验教学对实际应用有极大帮助。