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关键词： 结直肠癌   BASP1基因   细胞生物学功能   早期诊断  

摘要： 【目的】　　脑酸性可溶性蛋白1(Brainacidsolubleprotein1，BASP1)是一种神经生长相关蛋白，主要通过对细胞骨架相关蛋白的影响，调节其生物学功能，从而促进神经细胞轴突生长发育。在已发表的文献中显示BASP1参与多个系统肿瘤的发生与发展，且与临床预后相关，而在结直肠癌（CRC）中尚无相关研究。本研究拟通过实验验证BASP1基因在CRC组织中的表达情况，并研究BASP1基因对CRC细胞生物学功能的影响，评估BASP1是否可以作为CRC患者的独立危险因素，以期为CRC的早期发现、疾病诊治等方面提供新的思路。　　【方法】　　1.收集内镜及手术中CRC患者、大肠腺瘤患者以及正常人大肠粘膜组织共166例，使用荧光定量PCR实验技术手段检测BASP1mRNA的表达情况，用GraphpadPrism统计软件统计并分析BASP1mRNA的表达水平。收集临床病理资料，分析BASP1与CRC患者各类临床指标之间的关系。　　2.将BASP1过表达质粒（pcDNA3.1-BASP1）及空载质粒（pcDNA3.1）分别转染至人HCT116细胞株中。分别采用CCK-8法、流式细胞术方法、Transwell小室法分别检测细胞增殖情况、细胞凋亡能力、细胞周期阻滞情况及细胞迁移能力。　　【结果】　　1.各组中BASP1mRNA表达情况及与临床病理指标关系　　结果显示：CRC组分别与CRC癌旁组、大肠腺瘤组及正常对照组相比较，CRC组的BASP1mRNA的表达显著下调，且与各组相比较均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）;正常对照组、CRC癌旁组、大肠腺瘤组三组间两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　收集所有CRC患者临床病理资料，应用Fisher检验分析。结果显示：BASP1mRNA的表达量在肿瘤大小有统计学意义（P＜0.05），但在不同的年龄、性别、分化程度、分期、是否有淋巴结及远处转移等方面，差异均无统计学意义（P＞0.05）。　　***1对CRC细胞增殖、凋亡、周期和迁移的影响　　将BASP1过表达质粒（pcDNA3.1-BASP1）及空载质粒（pcDNA3.1）分别转染至HCT116细胞中，结果显示：pcDNA3.1-BASP1转染组的细胞增殖率显著降低(P＜0.001)，细胞周期被明显阻滞于G0/G1期（P＜0.01），细胞凋亡率显著升高（P＜0.0001），细胞迁移显著减少（P＜0.0001），以上试验差异均有显著统计学意义。　　【结论】　　***1在CRC组织中表达显著下调，BASP1的表达与CRC患者的肿瘤大小相关。　　***1基因能抑制CRC细胞增殖和迁移，促进CRC细胞调亡，并使细胞周期明显阻滞于G0/G1期，提示BASP1可能发挥抑癌作用。

关键词： 乳腺癌   外泌体   增殖   侵袭   凋亡  

摘要： 目的:探究乳腺MCF-7细胞来源的外泌体对乳腺癌MCF-7细胞生物学作用的影响。方法:使用超速离心法对乳腺癌MCF-7细胞培养液中的外泌体进行提取和纯化,使用通用透射电镜法观察MCF-7细胞来源外泌体的形态特征及直径大小,使用蛋白免疫印迹法对外泌体标志蛋白CD9及CD81进行鉴定。用MTT法、克隆形成实验,细胞划痕实验,细胞侵袭实验,免疫印迹实验,流式细胞术试验检测乳腺癌MCF-7细胞源性外泌体对MCF-7细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移、凋亡及上皮间质转化能力的影响。结果:透射电子显微镜下MCF-7细胞来源外泌体呈现杯托状或者凹的半球状的结构,直径约为40-110nm;蛋白免疫印迹实验结果显示MCF-7来源外泌体中其标志性蛋白CD9及CD81均明显富集;MTT实验结果显示,实验组的MCF-7细胞增殖能力较对照组明显增强(p<0.01);克隆形成实验显示,外泌体明显增强了MCF-7细胞的克隆形成能力(p<0.01);流式细胞术分析显示,在外泌体刺激的乳腺癌细胞中,凋亡细胞的百分比显著低于对照组(p<0.05);细胞划痕实验结果表明MCF-7来源外泌体可明显促进了MCF-7细胞的迁移(p<0.001);Transwell侵袭实验结果显示实验组MCF-7细胞迁侵袭能力相对于对照组明显增强(p<0.001);Western Blot结果显示,乳腺癌MCF-7细胞来源的外泌体增加了N-cadherin,vimentin的表达,降低了E-cadherin表达,促进了乳腺癌上皮间质转化过程(p<0.01)。结论乳腺癌细胞MCF-7来源的外泌体能显著增强肿瘤细胞的细胞增殖,克隆形成,侵袭,转移能力并诱导凋亡。表明乳腺癌MCF-7细胞来源的外泌体可作为细胞间信号转导的介质,在乳腺癌的发生发展和转移的信息传递方面发挥重要作用。

关键词： RPS15A基因   前列腺癌   生物学功能   顺铂   耐药性  

摘要： 【目的】前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性癌症疾病中最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围内高居老年男性泌尿生殖系统恶性肿瘤第1位及男性全身恶性肿瘤第2位。在我国,近年来PCa的发病率和死亡率都呈显著增加的趋势,其主要原因包括人口老龄化加剧及PCa早期诊断和有效治疗手段的欠缺等。许多PCa患者在初次就诊时就已经发现了转移,目前晚期转移性PCa的治疗以新型内分泌治疗为主,但内分泌治疗最终会导致PCa的去势抵抗性,治疗效果大大降低。化学治疗是治疗转移性去势抵抗性前列腺癌(Metastatic castration resistant prostate cancer,m CRPC)患者不可或缺的疗法,但大部分的m CRPC患者在治疗后期会产生耐药性而导致化疗失败。因此,研究克服化疗药物耐药性的方法对m CRPC患者具有重要意义。RPS15A属于核糖体蛋白质(ribosomal proteins,RPs)家族,其参与许多肿瘤的发生发展。大量研究发现,许多RPs家族蛋白能影响肿瘤的耐药性。顺铂(Cisplatin,DDP)主要通过诱导DNA损伤发挥作用,而RPs家族具备DNA修复等核糖体外功能,也有许多研究表明,多种RPs家族蛋白与肿瘤细胞产生DDP耐药性相关。本课题组前期研究已经发现,RPS15A在PCa细胞中呈高表达,RPS15A敲低能抑制PCa细胞DU145的增殖、侵袭等,促进细胞凋亡。因此,RPS15A可能与PCa细胞产生DDP耐药性有关。本课题拟在细胞水平上检测RPS15A过表达对PCa细胞DU145生物学功能的影响及探索RPS15A与PCa细胞产生DDP耐药性的相关性。【方法】1.通过RNA慢病毒载体转染实验构建RPS15A敲低和过表达的PCa细胞系DU145稳转株shRPS15A-DU145和oeRPS15A-DU145,通过荧光显微镜观察慢病毒转染效率,用荧光定量PCR和WB实验分别检测转染细胞中RPS15A的RNA和蛋白表达水平;2.通过平板克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测RPS15A过表达后对DU145细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响;通过流式细胞术检测RPS15A过表达DU145细胞的凋亡情况;3.通过CCK-8法检测shRPS15A-DU145、oeRPS15A-DU145及正常DU145细胞经DDP处理后的细胞存活率,计算半数抑制浓度及耐药指数,评价各细胞株对DDP耐药性的差异;4.通过平板克隆形成实验和流式细胞术检测RPS15A过表达及敲低后DU145细胞对DDP耐药性的影响;5.通过蛋白质印迹法(Western Blot,WB)实验检测shRPS15A-DU145、oeRPS15A-DU145及正常DU145细胞经DDP处理后凋亡蛋白的表达情况。【结果】***细胞系DU145在RNA慢病毒载体感染72h后,荧光显微镜观察可见shRPS15A-DU145组、oeRPS15A-DU145组和空载组细胞感染效率达80%以上,细胞生长良好;荧光定量PCR结果显示,shRPS15A-DU145组中RPS15A的m RNA表达量显著低于sh Ctrl-DU145组,oeRPS15A-DU145组中RPS15A的m RNA表达量明显高于oe Vec-DU145组(P<0.01);WB实验结果显示,shRPS15A-DU145组中RPS15A的蛋白表达水平相比sh Ctrl-DU145组得到了明显的抑制,oeRPS15A-DU145组相比oe Vec-DU145组RPS15A的蛋白表达水平上升;2.平板克隆形成实验结果显示,DU145细胞过表达RPS15A后,细胞克隆数及克隆形成率增加(P<0.05);细胞划痕实验结果表明,DU145细胞过表达RPS15A后,与对照组比较,细胞迁移率升高9%(P<0.01);Transwell侵袭实验结果表明,DU145细胞过表达RPS15A后,与对照组比较,细胞转移率升高16%(P<0.01);流式细胞术检测结果表明,DU145细胞过表达RPS15A后,相比对照组,细胞凋亡数减少(P<0.01);***-8法检测结果显示,shRPS15A-DU145、oeRPS15A-DU145及正常DU145细胞经DDP处理后,同等浓度下shRPS15A-DU145组的细胞存活率明显降低,半数抑制浓度和耐药指数也明显比oeRPS15A-DU145及正常DU145组细胞较低(P<0.01);4.平板克隆形成实验结果显示,用DDP处理后,shRPS15A-DU145组细胞克隆形成的数量及大小均明显不如oeRPS15A-DU145及空载组DU145细胞(P<0.01);5.流式细胞术检测结果表明,用DDP处理后,shRPS15A-DU145组细胞的早期

关键词： 富含亮氨酸重复激酶2   Ⅱ型P21活化激酶   蛋白相互作用   荧光共振能量转移   线粒体蛋白共定位分析  

摘要： 目的:本研究以富含亮氨酸重复激酶2(Leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)蛋白及其相互作用蛋白质分子(PAK5、PAK6)为研究对象,从细胞生物学角度阐明LRRK2蛋白与PAKs蛋白的相互作用机制及其内在联系,为了解LRRK2在帕金森病中的致病机制提供新的理论基础。方法:利用分子克隆技术制备本实验中所需要的重组蛋白表达质粒,包括带HA标签、GFP荧光标签的LRRK2全长蛋白,带Cy Pet荧光标签的LRRK2蛋白,带Myc标签、GFP、YPet荧光标签的PAK5、PAK6蛋白,通过转染在哺乳动物细胞系(HEK293T)中瞬时表达蛋白。利用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测LRRK2与PAKs蛋白的相互作用及其相互作用程度。通过蛋白免疫印迹检测蛋白表达情况并探究其激酶活性变化。利用线粒体红色荧光探针检测二者在线粒体中的定位情况。结果:FRET结果显示,LRRK2与PAK6及PAK5在细胞中会发生相互作用,与野生型相比,LRRK2的Roc结构域的致病突变和保护突变会增强其与PAK5、PAK6的相互作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白免疫印迹结果显示LRRK2与PAKs在HEK293T细胞中共表达后对PAKs的磷酸化水平没有显著影响。过表达PAK5或PAK6对内源性LRRK2及过表达野生型LRRK2及LRRK2的磷酸化水平无明显影响,对过表达LRRK2的磷酸化水平有下降的趋势,对过表达LRRK2的磷酸化水平有升高的趋势。荧光探针染色后皮尔森相关系数分析显示,PAK6及LRRK2与线粒体共定位信号强于PAK5,二者在细胞中共表达后,LRRK2在细胞中的分布形态由弥散分布变为散在聚集性分布。过表达野生型LRRK2及R1398H、R1441H突变体增强了PAK5与线粒体的共定位荧光信号,而N1437H、R1441C突变体则对PAK5在线粒体中的定位没有明显改变,过表达LRRK2(野生型及突变体)对PAK6与线粒体的共定位荧光信号没有明显改变。结论:LRRK2可以和PAK6及PAK5在细胞中发生相互作用;二者在细胞中共表达会改变LRRK2在细胞中的分布形态;PAK6与LRRK2定位在线粒体上,PAK5在线粒体上没有明显定位;LRRK2的Roc结构域的致病突变和保护突变会增强其与PAK5、PAK6的相互作用,同时会改变PAK5在线粒体上的定位,对PAK6在线粒体上的定位没有明显改变。

关键词： KIF21B   胃癌   临床意义   生物学功能  

摘要： 目的:驱动蛋白家族成员21B(Kinesin Family Member 21B,KIF21B)是微管马达蛋白,在细胞内发挥运送不同物质的功能,其对胃癌发生发展的影响目前尚不明确。通过临床人胃癌组织样本、生物信息学分析和体外实验等阐明KIF21B基因在胃癌中的表达水平、与胃癌患者临床病理特征和总体生存率的相关性以及对胃癌细胞生物学功能的影响,为寻找新的肿瘤治疗靶点及研发新型靶向药物提供理论基础。方法:利用TCGA-STAD数据和GEPIA在线库验证KIF21B在胃癌中的表达结果,Kaplan-Meier Plotter数据库分析KIF21B的表达与胃癌患者总体生存率(Overall survival,OS)的关系;收集2021年9月至2022年10月于甘肃省人民医院病理诊断为胃癌并行手术治疗的患者胃癌和癌旁组织标本共53对,其中43对制作组织芯片采用免疫组化法(Immunohistoc hemical,IHC)检测KIF21B基因蛋白表达情况,并结合患者的临床信息分析KIF21B的表达与临床病理特征的关系;采用反转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术检测10对胃癌/癌旁组织,胃癌细胞系MKN45、MGC803、HGC27、AGS和正常胃细胞GES-1中KIF21B m RNA的表达水平;筛选出表达量较高的细胞系,使用Lipofe ctamine 3000转染试剂将si-KIF21B转染至KIF21B m RNA表达量较高的胃癌细胞系中,荧光显微镜下观察,并采用RT-PCR技术验证转染效率;WB实验检测AGS转染Si-KIF21B后KIF21B蛋白的表达水平;采用划痕实验、Transwell实验、CCK8实验及流式细胞技术分别检测成功转染Si-KIF21B后胃癌细胞迁移、侵袭、增殖及凋亡能力的变化;使用R语言分析TCGA-STAD数据中与KIF21B相关的差异表达基因,并进行功能富集分析;使用R语言分析KIF21B高低表达组中,免疫细胞表达水平的差异及KIF21B的表达水平与免疫细胞的相关性。结果:KIF21B蛋白在GC组织中的表达(34/43,79.07%)明显高于癌旁组织(13/43,30.23%)(P<0.01),且KIF21B高表达与肿瘤大小、病理分期有关(P<0.05);与癌旁组织相比,GC组织中KIF21B m RNA的表达水平明显升高,TCGA数据库和GEPIA数据库在线验证后得到了相同的结果(P<0.05);Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示高表达KIF21B的患者,总体生存时间明显缩短(P<0.05),ROC曲线下面积为0.848;与正常的人胃黏膜上皮细胞GES-1相比,KIF21B基因在MGC-803、AGS、HGC27和MKN-45四种胃癌细胞系中的m RNA表达量显著增加(P<0.05),其中胃癌细胞株AGS中最高,选取AGS细胞系用于后续转染实验。分别将Si-KIF21B-1、Si-KIF21B-2和Si-KIF21B-3转染至AGS细胞株后,发现转染Si-KIF21B-3的AGS细胞株中KIF21B蛋白和m RNA的表达水平最低,转染效率最高;成功转染si-KIF21B-3后,与对照组RNAi-Ctrl相比,胃癌细胞AGS的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制,而凋亡能力受到促进。与KIF21B表达相关的差异表达基因共有321个,其中前10个差异表达基因分别为SERPINA9、CALCA、FCRL1、MIR4537、CD22、SPRR2E、VCX2、PNLIP、KRT5和KRTDAP;参与的生物过程(BP)包括B细胞受体信号通路、B细胞激活、免疫反应受体信号激活通路、淋巴细胞体液免疫反应激活的调节,参与构成的细胞成分(CC)包括免疫球蛋白复合物、质膜受体复合物、T细胞受体复合物、外侧质膜、循环免疫球蛋白复合物,参与的分子功能(MF)包括结合免疫球蛋白受体、结合抗原b、细胞因子受体活性、受体配体活性、嘌呤能核苷酸受体活性,KEGG包括细胞因子与其受体的相互作用、原发性免疫缺陷、造血细胞谱系、病毒蛋白与细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路;KIF21B高低表达组中,多种免疫细胞的表达存在显著差异(P<0.05),且KIF21B的表达与Tem细胞、T细胞、B细胞、TFH细胞和Treg细胞呈显著正相关(P<0.05)。结论:KIF21B基因在GC组织的表达明显高于癌旁组织,且高表达的KIF21B与肿瘤大小、病理分期有关,并显示不良预后;沉默KIF21B基因使胃癌细胞凋亡能力增强,增殖、侵袭和迁移能力降低,KIF21B促进了胃癌的进展;KIF21B基因可能通过影响胃癌免疫细胞浸润进而影响胃癌的进展

关键词： Schlafen3   内皮祖细胞   增殖   迁移   周期蛋白D1  

摘要： 1目的研究斯拉芬3(Schlafen3,Slfn3)对内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)迁移,增殖等生物学功能的影响及机制。2方法离体培养小鼠脾源EPCs,利用免疫荧光检测Slfn3在小鼠脾源EPCs的表达和定位。通过过表达及RNA干扰的方法过表达及沉默EPCs中的Slfn3基因,将细胞分为五个组:control、Ad-control、Ad-Slfn3、sh RNA-control、sh RNA-Slfn3。在转染48小时后,分别用CCK-8检测细胞增殖情况、transwell小室及流式细胞术检测Slfn3基因表达的改变对EPCs迁移及周期的影响。通过q RT-PCR对CDK2、p27kip1、PCNA、Rb、Cyclin D1的m RNA表达水平进行检测,进一步明确Slfn3调控EPCs生物学功能可能的作用机制。3结果1.成功分离培养小鼠脾源EPCs。用FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL进行鉴定,激光共聚焦结果提示,同时摄取Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-I的细胞占细胞总数79.3%。流式细胞术结果提示细胞CD34阳性表达(33.55±0.35)%、CD133阳性表达(14.81±1.12)%、FLK-1阳性表达(16.48±1.48)%,故分离的小鼠脾源细胞被鉴定为内皮祖细胞。2成功构建小鼠Ad-Slfn3重组腺病毒载体及小鼠sh RNA-Slfn3重组腺病毒载体,并将其成功感染EPCs,其在EPCs中的中的转染效率分别为(90.64±2.08)%、(91.64±1.98)%。3.免疫荧光共定位结果提示,Slfn3在原代EPCs中表达,主要定位在EPCs的细胞质中,在细胞核中也有少量定位。***-8法、transwell小室结果提示,在EPCs中过表达Slfn3抑制EPCs的增殖及迁移(P<0.05),而在EPCs沉默Slfn3的表达,促进EPCs的增殖及迁移(P<0.05)。5.细胞周期结果显示,与Ad-control组相比,Ad-Slfn3增加了G1期EPCs的比例,而与sh RNA-control组相比,sh RNA-Slfn3减少了G1期EPCs的比例。6.通过q RT-PCR检测CDK2、p27kip1、PCNA、Rb、Cyclin D1的m RNA表达水平,结果提示Ad-Slfn3转染可显著降低cyclin D1 m RNA表达(P<0.05),sh RNA-Slfn3转染显著增加cyclin D1 m RNA表达(P<0.05),CDK2、p27kip1、PCNA、Rb的m RNA表达在各组之间无明显差异(P>0.05)。通过Western blot分析各组细胞cyclin D1的表达水平,结果显示Ad-Slfn3转染可显着降低cyclin D1蛋白水平的表达(P<0.05),与之相反,与对照组相比,sh RNA-Slfn3转染显著增加了cyclin D1蛋白水平的表达(P<0.05)。4结论沉默Slfn3的表达显著促进EPCs的增殖、迁移;反之,过表达Slfn3,则抑制EPCs的增殖、迁移,且EPCs被停滞在细胞周期的G1期,其机制可能与调控cyclin D1的表达有关。

关键词： 刚地弓形虫   恶性肿瘤   膀胱癌   流行病学   生物学行为  

摘要： 目的:本研究通过检测大理地区恶性肿瘤患者弓形虫感染率,进一步丰富弓形虫感染数据库,为恶性肿瘤患者弓形虫感染防控提供参考依据。同时探讨弓形虫培养上清对恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响,旨在为恶性肿瘤的临床治疗提供新的思路。方法:1.收集2020年至2022年期间在大理大学第一附属医院接受治疗的721例恶性肿瘤患者的血清样本,同时收集100例健康体检者血清作为对照,采用酶联免疫吸附试验检测血清中抗弓形虫IgG及IgM抗体,比较分析不同类型以及不同特征恶性肿瘤患者抗弓形虫特异性抗体阳性率差异。2.取对数生长期的人膀胱癌5637细胞接种于细胞培养板中,实验组分别加入RH型及ToxoDB#9型弓形虫速殖子培养24 h后的上清液,对照组加入等体积的RPMI1640培养基。通过显微镜观察弓形虫培养上清干预后细胞的形态变化,采用CCK-8实验检测弓形虫培养上清对细胞增殖能力的影响,利用划痕愈合实验和Transwell实验检测对细胞的迁移和侵袭能力的影响,使用TUNEL实验检测对细胞的凋亡率的影响,通过Western blot实验检测对细胞中凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2表达情况的影响。使用统计学软件对实验结果进行统计分析以得出有效结论。结果:1.721例恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgG抗体阳性率为21.22%,高于健康对照组的8.00%(P<0.05),血清抗弓形虫IgM抗体阳性率与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)。不同类型恶性肿瘤中,胃癌、膀胱癌、结直肠癌、甲状腺癌、肺癌、子宫颈及子宫内膜癌与肝癌患者的血清抗弓形虫IgG抗体阳性率均显著高于健康对照组(P<0.05),子宫颈及子宫内膜癌患者血清抗弓形虫IgM抗体阳性率显著高于健康对照组(P<0.05),但不同类型恶性肿瘤患者的血清抗弓形虫IgG及IgM抗体阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。不同性别、年龄、民族、职业和居住地的恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgG抗体阳性率的差异均无统计学意义(P>0.05),不同性别、不同年龄恶性肿瘤患者血清抗弓形虫IgM抗体阳性率的差异有统计学意义(P<0.05)。2.(1)镜下观察细胞形态,弓形虫培养上清干预24 h后,与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组细胞量减少,细胞皱缩,核浆比例降低,核固缩、破裂。(2)在CCK-8实验中,弓形虫培养上清对5637细胞的增殖能力具有抑制作用,且ToxoDB#9组抑制率高于RH组(P<0.05)。(3)在划痕愈合实验中,24 h时对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率分别为(19.92±8.62)%、(11.80±3.18)%、(4.02±1.73)%,36h时对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率分别为(64.60±5.60)%、(17.57±4.24)%、(15.47±4.82)%。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞迁移率均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组迁移率低于RH组(P<0.05)。(4)在Transwell迁移实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的迁移细胞数分别为(899.33±28.19)、(476.00±25.96)、(439.00±31.38)。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的迁移细胞数均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组迁移细胞数低于RH组(P>0.05)。(5)在Transwell侵袭实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的侵袭细胞数分别为(459.67±11.61)、(343.33±20.74)、(217.33±32.42)。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的侵袭细胞数均降低(P<0.05),且ToxoDB#9组侵袭细胞数低于RH组(P<0.05)。(6)在TUNEL实验中,对照组、RH组与ToxoDB#9组的细胞凋亡率分别为(5.71±2.37)%、(74.35±5.88)%、(79.29±6.54)%。与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞凋亡率均上升(P<0.05),且ToxoDB#9组凋亡率高于RH组(P>0.05)。(7)在Western blot实验中,与对照组相比,RH组与ToxoDB#9组的细胞中Bax蛋白表达水平明显上升,Bcl-2蛋白表达水平明显下降,且Bcl-2/Bax比值下降,经统计学分析显示,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.大理地区恶性肿瘤患者弓形虫感染率显著高于健康对照者,但不同类型恶性肿瘤患者弓形虫感染率差异无统计学意义。恶性肿瘤患者弓形虫感染率不具有性别、年龄、职业、居住地和民族特异性。提示恶性肿瘤患者合并弓形虫感染较为常见,临床治疗时应加强对弓形虫感染的防治。2.弓形虫培养上清对膀胱癌5637细胞的增殖、迁移及侵袭能力有明显的抑制作用

关键词： 维奈托克   人脐带间充质干细胞   BCL-2基因   成骨分化  

摘要： 目的:探究BCL-2抑制剂维奈托克(venetoclax,ABT-199)治疗白血病诱导白血病细胞凋亡的同时,对骨髓微环境中间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的影响。方法:以人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)作为本研究对象,用含0、0.5、2.5、5、10、20和40μmol/L维奈托克的hUC-MSCs完全培养基分别培养hUC-MSCs 24h、48h、72h后,通过CCK-8法检测不同浓度维奈托克对hUC-MSCs细胞活力的影响,确定后期实验的最适宜浓度。最终确定维奈托克实验组的浓度,分别为0.5、2.5、5μmol/L,并设立对照组的浓度为0μmol/L。用流式细胞术检测hUC-MSCs细胞周期、细胞凋亡率;通过碱性磷酸酶染色检测各组成骨分化7天后碱性磷酸酶活性;茜素红染色检测各组成骨分化21天后钙结节的形成量;RT-qPCR法分别测定体外诱导成骨分化第7天、第14天各组BCL-2m RNA的表达情况。结果:***-8检测结果显示,与对照组(0μmol/L维奈托克)相比,0.5、2.5、5、10、20和40μmol/L维奈托克组作用下hUC-MSCs在24h、48h和72h后细胞活力均下降。且在48h时,hUC-MSCs细胞活力随药物浓度的增加下降更明显,表明维奈托克对hUC-MSCs平均在48h增殖抑制率最高(P<0.01)。2.细胞周期结果显示:维奈托克浓度为5μmol/L时,G0/G1期细胞占41.4333±1.283%,S期细胞占14.9333±0.7767%,G2/M期细胞占20.6±1.2124%。维奈托克使大部分hUC-MSCs处于G0/G1期,少部分hUC-MSCs处于S期、G2/M期。细胞凋亡结果示:随着维奈托克浓度的增大,hUC-MSCs凋亡率增大,与对照组对比差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。3.成骨分化7天后行碱性磷酸酶染色法检测结果提示,随着维奈托克浓度的增加阳性区域逐渐变小,且与对照组对比,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.成骨分化21天后行茜素红染色检测结果表明,与对照组(0μmol/L维奈托克)相比,0.5、2.5、5μmol/L维奈托克实验组钙结节沉淀的阳性区域均降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。***-qPCR检测结果显示,与成骨组比较,低浓度组BCL-2基因表达量在第14天下降,差异无统计学意义(P>0.05),低浓度组在第7天BCL-2基因表达量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与成骨组比较,中、高浓度组在第7天、第14天BCL-2基因表达量均下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1.维奈托克可影响hUC-MSCs增殖活力,及促进细胞凋亡,并使大部分hUCMSCs处于G0/G1期;2.维奈托克影响hUC-MSCs分化为成骨细胞能力;***-MSCs中有BCL-2基因的表达,维奈托克影响hUC-MSCs的增殖、分化与BCL-2基因的表达有一定相关性。

关键词： 贵州黑山羊   COL1A1基因   颗粒细胞   细胞增殖   产羔性能  

摘要： 贵州黑山羊(Capra hircus)是贵州省地方三大品种之一,是人工选育和自然选择的产物,具有适应性好、抗病力强、耐粗饲和肉品质优良等特点,广受养殖户及消费者喜爱。但贵州黑山羊产羔数偏低,繁殖成本高,严重制约着肉羊产业发展。研究发现,I型胶原蛋白α1链(Collagen type I alpha 1 chain,COL1A1)作为细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)I型胶原蛋白的重要组成成分,在维持人及动物卵巢正常功能中发挥作用,与动物繁殖性状密切相关,然而COL1A1基因在影响贵州黑山羊卵泡发育及卵巢细胞增殖和凋亡中的作用并不清楚。因此,为研究COL1A1基因与贵州黑山羊繁殖力间的关系,分析其对卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,论文以贵州黑山羊为研究对象,运用RTq PCR技术检测COL1A1基因在单羔、多羔贵州黑山羊性腺轴组织中m RNA的表达水平;通过免疫组化和Western blot检测COL1A1蛋白在单羔、多羔贵州黑山羊卵巢组织中表达及定位;随后分离培养卵巢颗粒细胞,构建COL1A1基因干扰和过表达载体,转染至卵巢颗粒细胞中,通过RT-q PCR、Western blot、CCK-8、细胞划痕、流式细胞术等技术检测COL1A1基因不同表达水平对产羔相关基因的影响、颗粒细胞增殖、迁移、周期、ROS水平、以及凋亡指标蛋白和PI3K/AKT/m TOR通路蛋白表达的影响。主要研究结果如下:***1A1基因在多羔组贵州黑山羊性腺轴组织中的表达水平显著高于单羔组在同期发情处理的前提下,从形态学上来看,多羔组贵州黑山羊卵巢组织明显比单羔组体积更大,卵泡发育更为成熟;RT-q PCR试验结果发现,COL1A1基因在多羔组卵巢、下丘脑、垂体和输卵管组织中的表达均极显著高于单羔组(P<0.01),且在多羔组卵巢中的表达量最高;免疫组化及Western blot试验结果表明,COL1A1蛋白在单羔和多羔卵巢组织各级卵泡、卵巢细胞、结缔组织中均有表达,且在多羔组卵巢中高表达(P<0.01)。以上结果暗示COL1A1的表达量可能与山羊繁殖率呈正相关关系,在维持卵巢组织结构和卵泡发育中发挥积极作用。2.成功构建了COL1A1基因过表达载体和干扰载体论文通过重叠延伸PCR-酶切酶连法构建COL1A1基因过表达载体,双酶切鉴定、测序鉴定、RT-q PCR及Western blot试验结果表明,论文成功构建了pc DNA3.1(+)-COL1A1真核表达载体。根据sh RNA设计原则,构建4个干扰COL1A1基因表达的干扰载体,并通过绿色荧光蛋白发光强度、RT-q PCR及Western blot检测不同干扰载体对COL1A1基因和蛋白的抑制效率,结果表明sh RNA-COL1A1-2为抑制COL1A1基因表达的最佳干扰载体。上述结果为后续验证COL1A1基因不同表达水平影响颗粒细胞的生物学功能奠定基础。3.过表达和干扰COL1A1基因严重影响了颗粒细胞的表型及产羔相关基因的表达CCK-8、细胞划痕、流式细胞及活性氧检测试验结果表明:COL1A1基因在颗粒细胞中的过表达,显著促进了颗粒细胞的增殖能力(P<0.01)、迁移能力(P<0.05),改变了细胞周期进程,降低了细胞中ROS的水平(P<0.01);而下调COL1A1基因的表达,显著抑制了颗粒细胞的增殖(P<0.01)、迁移(P<0.05),改变细胞周期进程,促进细胞内ROS水平升高(P<0.05)。此外,RT-q PCR结果表明,上调COL1A1基因的表达,能促进颗粒细胞中产羔相关基因GDF9、BMP15和FSHβ的表达水平(P<0.01),而干扰COL1A1基因的表达,上述基因表现出明显相反的表达结果。以上结果说明,COL1A1基因与山羊颗粒细胞增殖、迁移和产羔基因的表达正相关,与细胞中ROS水平负相关。***1A1基因通过调控PI3K/AKT/m TOR通路影响颗粒细胞的增殖和凋亡对COL1A1基因影响颗粒细胞的增殖和凋亡的信号通路研究发现,上调COL1A1基因在颗粒细胞中的表达水平,促进了p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR比值及细胞增殖相关蛋白PCNA的表达(P<0.05),抑制了凋亡相关蛋白BAX、Caspase-3和Caspase-9的表达(P<0.05);而下调COL1A1基因的表达,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、pm TOR/m TOR、BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白,则具有相反的表达模式。综上可见,COL1A1基因可能通过激活PI3K/AKT/m TOR通路蛋白的表达,调节PCNA、BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达来调控颗粒细胞的增殖、迁移、周期和RO

关键词： 盐酸青藤碱   胃癌   细胞增殖   细胞凋亡   细胞焦亡   泛凋亡  

摘要： 目的:胃癌是全球常见恶性肿瘤之一,已有研究发现盐酸青藤碱(sinomenine hydrochloride,SIN)能够抑制胃癌细胞增殖,多种程序性细胞死亡方式同时存在,对胃癌发生或发展的影响研究尚浅。本研究旨在进一步探讨SIN对人胃癌AGS细胞的生物学特性的影响,初步探索SIN对胃癌细胞是否同时存在多种细胞死亡,为胃癌药物治疗的研究提供新的思路和证据。方法:1.通过CCK-8法检测SIN对人胃癌AGS细胞活力的影响,并确定作用于人胃癌AGS细胞的半数抑制浓度(IC50),以确定后续实验的药物浓度。2.通过LDH释放实验明确SIN对人胃癌AGS细胞的损伤情况;采用划痕实验和Transwell侵袭实验验证SIN对人胃癌AGS细胞迁移和侵袭的影响;使用流式细胞术评价SIN对人胃癌AGS细胞周期的影响。3.利用流式细胞术和蛋白质免疫印迹实验(Western blot)分别检测凋亡细胞和细胞焦亡相关蛋白cleaved Caspase-1以及炎性因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-18(Interleukin-18,IL-18)的表达,基于细胞凋亡和细胞焦亡的相关检测观察SIN对胃癌细胞泛凋亡现象的影响,探讨SIN对胃癌细胞是否存在泛凋亡样细胞死亡。结果:***-8实验结果显示,SIN能够降低人胃癌AGS细胞的活性(P<0.001)。与对照组比较,SIN处理组具有活性的AGS细胞数量明显降低,CCK-8法检测了不同浓度SIN处理人胃癌AGS细胞48h后的细胞活力,通过计算得出药物的IC50值为0.4876mmol/L。***释放实验结果表明,随着SIN浓度升高,LDH释放量逐渐增加,当SIN浓度达到IC50时,差异有统计学意义(P<0.01);划痕实验和Transwell细胞侵袭实验结果显示,与对照组比较,SIN处理组人胃癌AGS细胞迁移的距离明显缩短(P<0.05或P<0.001),Transwell小室细胞数目减少(P<0.01或P<0.001),且具有浓度依赖性(P<0.05),表明SIN能够抑制AGS细胞的迁移和侵袭;流式细胞术结果显示,SIN处理组AGS细胞处于G1期的比率较对照组显著升高(P<0.01或P<0.001)。3.流式细胞仪测细胞凋亡结果显示,与对照组比较,SIN处理组凋亡细胞所占比例明显升高(P<0.001),且具有浓度依赖性(P<0.001);Western blot实验结果表明,随着SIN浓度升高,细胞焦亡相关蛋白cleaved Caspase-1的表达和炎性因子IL-1β和IL-18的表达逐渐降低(P<0.05或P<0.001)。结论:***能够抑制人胃癌AGS细胞增殖,其机制可能与诱导胃癌细胞凋亡和细胞G1期阻滞有关;***可以抑制人胃癌AGS细胞的侵袭和迁移,抑制效果随药物浓度升高而增强;***可能会诱导胃癌细胞产生泛凋亡现象,其中细胞凋亡现象随药物浓度升高而增强,细胞焦亡现象可能随药物浓度升高而减弱。