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关键词： 糖尿病难愈合创面   高糖环境   人脂肪间充质干细胞   抗菌肽   LL-37   差异表达基因  

摘要： 目的:探讨LL-37对高糖环境下人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)增殖、迁移、分化能力、凋亡的影响,筛选差异表达基因(DEG)并对其进行功能分析与实验复证,以期为提高人脂肪间充质干细胞的治疗效果提供一种新的研究方法。 方法:(1)采用CCK8法检测不同浓度的LL-37对高糖环境下人脂肪间充质干细胞增殖的影响,确定实验浓度及作用时间。(2)划痕实验、成骨成脂分化相关基因检测、流式细胞术分别检测各组细胞经LL-37干预后细胞迁移、分化潜能和凋亡水平的变化;(3)运用高通量测序中RNA-seq技术分析筛选数据集中高糖环境下h ADSCs样本与高糖环境下经LL-37处理后h ADSCs样本之间的差异表达基因(DEG)。对筛选出的DEG分别进行生物学过程、分子功能、细胞组分的基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;根据基因组学分析中log2FC分数(相对表达量变化倍数的对数值)的大小对DEG进行排名,倾向于将高log2FC分数的基因视为关键基因。根据细胞的体外生物学行为及显著富集筛选,本研究将上调表达基因谱中log2FC分数排名前10的DEG视为关键基因,通过Gene Cards:The Human Gene Databases数据库及相关文献查找关键基因功能及所在通路,探讨在细胞生长发育方面密切相关的差异通路并加以实验验证。(4)实时荧光定量RT-q PCR检测各组中人即刻早期反应基因2(immediate early response 2,IER2)及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)m RNA的表达; 结果:(1)经CCK-8法检测确定LL-37能在适宜范围的浓度和时间下促进在高糖环境下人脂肪间充质干细胞的增殖,确定实验浓度为25μg/m L(P<0.001),确定作用时间为48小时(P<0.0001);(2)经LL-37干预后,h ADSCs在高糖环境下的迁移能力明显增加((P<0.001);细胞分化相关基因表达显著上调(P<0.05);细胞凋亡比例明显减少(P<0.001);(3)与单一生长在高糖环境下的h ADSCs相比较,我们在高糖环境下经LL-37干预后的h ADSCs中筛选出479个差异表达显著的DEG(校正P<0.05或校正P<0.01),包括230个上调DEG和249个下调DEG。GO术语分析显示,DEG在金属/离子结合、压力感应、细胞组分调控、生长发育过程/细胞增殖正向调控等方面显著富集(校正P值均<0.01);KEGG通路分析显示,DEG在细胞凋亡信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路和核转录因子kappa B(NF-κB)等方面显著富集(校正P值均<0.01);基因组学分析显示,LL-37处理显著增加IER2表达3.75倍。LL-37处理还增加了与免疫应答、信号转导、细胞周期、细胞趋化、细胞增殖和转录等多种功能相关的几个基因(包括MATR3,IER2,UTP14C,ORAI2等)的水平。(4)LL-37干预组中IER2及ERK的表达显著高于未干预组,且高糖环境可能会在一定程度上抑制IER2及ERK的表达(P<0.05)。 结论:1.经LL-37干预h ADSCs,可增加其在高糖环境下的增殖、迁移、分化以及抗凋亡的能力。***-37可能通过IER2和MAPK/ERK途径促进h ADSCs的增殖、迁移、分化及抗凋亡能力。因此,LL-37可以调节并激活h ADSCs,并可能通过加强h ADSCs的功能(例如,增殖、迁移等作用),从而为提高h ADSCs的治疗效果提供了新方法。

关键词： 多发性骨髓瘤   长链非编码RNA   基因表达   细胞生物学  

摘要： 目的：通过检测多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者血清中长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）LINC00304的表达水平并研究其对MM细胞功能的影响，探索LINC00304作为生物标志物在MM中的诊疗价值。　　方法：（1）用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）方法检测LINC00304在100例MM患者及92例正常对照者血清中的表达水平;对LINC00304的表达水平与临床指标的相关关系进行分析;用受试者工作曲线（receiver operating characteristic，ROC）评价LINC00304的诊断效能，并评价与临床指标的联合诊断效能。（2）用LINC00304干扰质粒及过表达质粒转染RPMI-8226细胞及H929细胞，进行敲低和过表达试验，RT-qPCR验证转染效率，Transwell小室试验检测MM细胞迁移能力的变化，用流式细胞仪检测LINC00304对MM细胞凋亡和周期进程的影响。（3）MM基因表达矩阵来自基因表达集（gene expression omnibus，GEO）GSE2658和GSE57317，功能性富集分析揭示MM相关的信号通路。　　结果：与正常对照组相比，MM患者血清中LINC00304的表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.0001）;100例MM患者分为治疗前（29例）和治疗后（71例），治疗后LINC00304的表达水平显著下降（P＜0.05）。血清LINC00304的表达水平与球蛋白的增高有较强相关性。ROC曲线显示，LINC00304的ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为0.810（95%CI：0.751-0.869，P＜0.0001）。敲低LINC00304后，MM细胞的迁移能力明显受到抑制，MM细胞周期阻滞在G0/G1期，而S期明显减少，MM细胞增殖受到抑制，而且MM细胞的凋亡明显增加;而过表达LINC00304后结果则相反。GSE2658和GSE57317数据集取交集分析得出43个共同差异基因，LINC00304和这些共同差异基因在生物学功能和富集分析的结果揭示了LINC00304可能通过Ras信号通路等在分子生物活性、细胞囊泡膜等方面促进MM细胞的增殖，影响MM的发生、发展，从而有助于发现MM的发病机制，进而为MM的治疗提供新的靶点。　　结论：LINC00304在MM血清中表达升高，而经治疗后表达明显下降，由此，LINC00304可作为生物标志物辅助诊断多发性骨髓瘤及监测治疗效果;且LINC00304可影响MM细胞凋亡及周期分布，并影响MM细胞的迁移能力;另外LINC00304可通过一些信号通路（如Ras信号通路）影响MM细胞的生物学行为，从而促进MM的发展。上述研究表明LINC00304可辅助诊断多发性骨髓瘤，动态监测治疗效果，有希望成为MM治疗的新靶点。

关键词： 限时喂养   顺铂耐药   肺癌   转录组测序   p53  

摘要： 目的:由于化疗药物的原发性和获得性耐药,其他药物(包括膳食因素)与化疗药物的联合治疗在肺癌临床治疗中备受关注。本研究旨在了解限时营养干预模式/限时喂养(Time-restricted feeding,TRF)和顺铂(cisplatin,DDP)的同时处理对肺癌细胞敏感性和裸鼠皮下移植瘤生长的影响。方法:体外实验:用三种肺癌细胞系即A549、H460和对顺铂耐药的A549/DDP细胞在细胞水平上模拟限时喂养饮食,也称为限时营养干预模式,即TRF,将三种肺癌细胞分别分为6组,对照组(CON组)、顺铂处理组(DDP组)、限时营养干预模式组(TRF组),限时营养干预模式与顺铂联合处理组(TRF+DDP组),以及6小时模拟短期饥饿的限时营养干预(6h Short-Term starvation medium TRF mimicking)组(S6h TRFM/STS组)和6小时模拟短期饥饿的限时营养干预与顺铂联合处理组(S6h TRFM+DDP/STS+DDP组)。限时营养干预模式为用无糖无血清的RPMI-1640培养基处理细胞18h,10%血清和2g/L葡萄糖的RPMI-1640培养基处理细胞6h,24h后重复同样干预,连续干预48小时,观察肺癌细胞的生长情况,检测细胞的活力、增殖、凋亡和迁移等,并进一步将A549/DDP细胞干预之后进行转录组测序,通过m RNA序列分析、Western blot和RT-q PCR分析以进一步探索其耐药机制。体内实验:A549肺癌细胞在完全培养基中培养到一定密度后,收集细胞,以1.0×10～7细胞数量皮下移植到5～6周龄BALB/c裸鼠的腋窝中上侧,待肿瘤可触及时,按照肿瘤大小与小鼠体重随机分为4组,即对照组(CON组)、顺铂处理组(DDP组)、限时喂养组(TRF组)以及限时喂养与顺铂联合处理组(TRF+DDP组)。对照组为正常饮食,限时喂养组小鼠为禁食18小时+自由进食6小时,顺铂处理组设置为腹腔注射顺铂5mg/kg体重,4天一次。每3天检测肿瘤大小、小鼠体重以及摄食量,干预持续一个月后结束实验并收集肿瘤和相关组织,肿瘤大小用游标卡尺测量其宽度与长度,计算肿瘤体积。结果:(1)TRF具有抑制肿瘤细胞活力的作用,并使肿瘤细胞对DDP治疗重新敏感。(2)与DDP组或TRF组单独处理相比,TRF和DDP的联合处理显著抑制了肺癌细胞的增殖和迁移。(3)TRF明显增强了顺铂介导的肺癌细胞的凋亡作用,促进细胞的凋亡。(4)DDP和TRF联合的协同抗肿瘤作用大于DDP和6小时模拟短期饥饿的限时营养干预(S6h TRFM/STS)的联合作用。(5)m RNA序列分析确定p53信号传导和细胞凋亡途径参与了肺癌细胞对DDP的耐药;TRF和DDP的联合处理激活了细胞凋亡和p53信号通路,增加了A549/DDP细胞对DDP的敏感性,促进A549顺铂耐药细胞的凋亡并抑制其增殖。(6)P53蛋白的稳定性与TRF和DDP联合治疗时的协同抗肿瘤作用有关。(7)与DDP组或TRF组单独处理相比,TRF联合DDP组减缓了A549细胞异种移植小鼠肿瘤的生长。结论:TRF可以增加DDP耐药的A549细胞株对DDP的敏感性;TRF和DDP联合使用在抑制A549肺癌细胞的增殖、迁移和诱导细胞凋亡方面的具有协同作用,而且协同抗肿瘤效果优于与传统的STS联合组。其机制可能是其通过促进蛋白合成和抑制降解来提高P53蛋白水平的稳定性有关。

ISBN: (纸本)9787309164459

关键词： 褪黑素   卵泡膜细胞   焦亡   绵羊  

摘要： 褪黑素(Melatonin,MT)是一种强效抗氧化剂,其存在于哺乳动物卵泡液中。MT通过抗氧化作用,限制卵母细胞(Oocytes)和颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)中的氧化应激,进而参与调节卵泡发育和排卵;还可有效治疗多囊卵巢综合征(PCOS)、卵巢早衰(POF)等疾病。卵泡内膜细胞(Theca cells,TCs)是组成卵泡的重要结构,能够为Oocytes和GCs的发育提供营养物质和信息交流;同时,卵泡发育与排卵是三种细胞高度协同发育的最终结果,缺一不可。目前有关Oocytes、GCs以及MT在以上两种细胞中的研究较多,但关于TCs的研究未见报道。本研究通过组织切片技术,对发情期绵羊卵泡膜组织发育与MT受体(Melatonin receptor,MTR)表达进行分析;通过改进后的分离方法获得TCs,优化体外培养条件和分析MTR的表达与定位;通过体外培养添加MT,探究MT对TCs生物学功能的影响与机制;脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建TCs焦亡(Pyroptosis)模型,探究MT对其焦亡损伤的影响与保护机制。研究结果如下:1.绵羊TCs最早出现在次级卵泡中,三级卵泡阶段厚度增加并分化形成内外膜结构;成熟卵泡时期膜厚度降低,形成黄体时厚度再次增加;卵泡膜和黄体组织均表达MTR,次级、闭锁卵泡内膜组织MTR表达量显著低于三级、成熟卵泡内膜组织和膜黄体组织(P<0.05)。2.通过有齿镊分离卵泡内膜组织和非连续percoll梯度离心法,获得纯度较高(98.26±0.73%)的TCs;TCs体外分离培养最佳条件为:内膜组织消化时间为30 min,培养时血清浓度为15%、培养温度为38℃、CO浓度为5%,适宜培养液为DMEM/F12和DMEM高糖培养液。TCs均表达MT1和MT2,MT2表达量显著高于MT1(P<0.05),MT1和MT2表达定位于TCs的细胞质和细胞膜。***显著提高TCs Cat和Sod1 m RNA表达,降低ROS含量(P<0.05);MT显著提高TCs Bcl-2 m RNA和蛋白表达,显著降低Bax m RNA和蛋白表达(P<0.05);除10M(生理浓度)外,MT显著降低TCs增殖活力和Cyclin D1、CDK4 m RNA表达(P<0.05);MT促进TCs分泌孕酮(P<0.05),对雄激素分泌无影响(P>0.05);MT提高TCs St AR m RNA和蛋白表达(P<0.05),但对CYP11A1、CYP17A1和3β-HSD m RNA表达无影响(P>0.05);LY294002(PI3K/AKT通路抑制剂)抑制TCs St AR和P-AKT蛋白表达(P<0.05),MT提高TCs P-AKT蛋白表达(P<0.05);LY294002、Luzindole(非特异性MT1和MT2抑制剂)和4p-PDOT(特异性MT2抑制剂)均抑制MT诱导的TCs孕酮分泌以及St AR和P-AKT蛋白表达(P<0.05);MT提高TCs中MT1和MT2 m RNA表达(P<0.05),Luzindole和4p-PDOT均抑制MT促进的MT1和MT2 m RNA表达(P<0.05)。***提高TCs中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18和雄激素的分泌(P<0.05),抑制TCs增殖、孕酮分泌和MTR m RNA表达(P<0.05),提高NLRP3、Caspase-1、GSDMD和Caspase-4蛋白表达以及ROS含量(P<0.05)。MT预处理后,LPS诱导的TCs TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18和雄激素分泌显著降低(P<0.05),增殖活力、孕酮分泌和MTR m RNA表达显著升高(P<0.05),NLRP3、Caspase-1、GSDMD和Caspase-4蛋白表达以及ROS含量显著降低(P<0.05)。***抑制SIRT1和SOD2蛋白表达(P<0.05),MT促进SIRT1和SOD2蛋白表达(P<0.05),MT预处理后,SIRT1和SOD2蛋白表达显著高于LPS单独作用(P<0.05),并与对照组间无差异(P>0.05);EX527(SRIT1抑制剂)与MT共作用后,TCs中炎性因子浓度、ROS含量和GSDMD蛋白表达显著高于MT与LPS共作用(P<0.05),与LPS单独作用无显著差异(P>0.05),SIRT1和SOD2蛋白表达显著低于MT与LPS共作用和LPS单独作用(P<0.05);Resveratrol(SRIT1激活剂)与LPS共作用后,TCs炎性因子浓度、ROS含量和GSDMD蛋白表达与对照组无差异(P>0.05),SIRT1和SOD2蛋白表达显著高于LPS单独作用(P<0.05);Luzindole与MT共作用后,T

关键词： CD90   肝癌   Notch   AKT  

摘要： 目的:本课题旨在研究CD90+肝癌干细胞的生物学特征与Notch、AKT基因之间的关系,为肝癌的诊断和治疗提供新思路。 方法: 1.本实验选取CD90高表达Sk-Hep-1人肝癌细胞及CD90低表达HepG2人肝癌细胞,在体外用DMEM进行培养。 2.通过流式细胞术检测Sk-Hep-1人肝癌细胞及HepG2人肝癌细胞CD90的含量; 3.通过CCK8检测CD90+肝癌细胞和CD90-肝癌细胞增殖能力。 4.通过划痕实验检测CD90+肝癌细胞和CD90-肝癌细胞迁移能力。 5.通过RT-PCR及WB检测CD90+肝癌细胞和CD90-肝癌细胞的Notch、AKT基因表达情况。 6.收集实验数据,进行统计分析。 结果: 1.经流式细胞仪检Sk-Hep-1肝癌细胞的CD90表达量为97.43%±0.09%,HepG2肝癌细胞的CD90表达为0.12%±0.08%。 2.肝癌细胞数量随着时间的推移逐渐增多,CD90+肝癌细胞的增殖能力强于CD90-肝癌细胞。 ***90+肝癌细胞的迁移能力强于CD90-肝癌细胞。 ***90+肝癌细胞的Notch、AKT相关基因表达均大于CD90-肝癌细胞。 结论:CD90作为一种间充质标志物在Sk-Hep-1和HepG2肝癌细胞中高表达,尤其在Sk-Hep-1肝癌细胞中表达更高,同时呈现出更高的增殖、迁移能力。并且激活了Notch及AKT信号通路中肿瘤发生相关基因表达。研究结果提示CD90可能与肝癌细胞的生物学行为变化及更强的肿瘤干细胞特性密切相关。

关键词： 慢性髓系白血病   PYCR1   能量代谢   活性氧   BCR-ABL  

摘要： 背景:慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一种克隆性骨髓增殖性肿瘤,其特征是9号和22号染色体易位t(9:22)(q34:q11),并形成BCR/ABL融合基因。BCR/ABL融合基因编码的BCR/ABL融合蛋白具有组成型酪氨酸激酶活性,激活下游一系列的信号通路,从而促进CML细胞增殖。伊马替尼(Imatinib,IM)等酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)的问世,极大地改善了CML患者的生存和预后。然而,随着临床上TKI的广泛应用,部分患者却出现了治疗效果不佳和耐药现象,因此探索CML进展的具体机制和新的治疗靶点具有重要意义。脯氨酸代谢在肿瘤代谢重编程中起重要作用,并与肿瘤细胞中ATP、蛋白质和核苷酸的合成以及氧化还原稳态有关。吡咯啉-5-羧酸还原酶1(Pyrroline-5-carboxylate reductase,PYCR1)作为脯氨酸生物合成重要的关键酶,与多种实体肿瘤的进展密切相关,已被认为是抗癌药物开发的潜在靶点,但是PYCR1在CML中的研究尚未见报道。目的:本研究旨在探究PYCR1对CML细胞生物学表型的影响及其作用的机制,为探索CML治疗的新靶点、新思路提供理论和实验基础。方法:1.采用生物信息学方法分析GEO、TCGA等数据库CML细胞中PYCR1的表达水平,然后收集临床样本分离单个核细胞,通过RT-q PCR检测PYCR1 m RNA的实际表达水平。2.通过慢病毒转染技术,构建沉默和过表达PYCR1的CML细胞稳转株;采用RT-q PCR和Western blot检测转染的效果;通过CCK-8、流式细胞术、Transwell、细胞毒实验检测沉默和过表达PYCR1对CML细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、伊马替尼敏感性的影响。3.采用Western blot检测沉默PYCR1对BCR-ABL通路的影响;通过RNA-seq筛选沉默PYCR1后的差异表达基因和影响的相关通路;进一步通过RT-q PCR验证RNA-seq中所鉴定相关通路的基因表达水平;最后利用流式细胞术检测沉默PYCR1对CML细胞线粒体ROS水平的影响。结果:***数据库分析结果表明,PYCR1在健康人、CML慢性期和CML急变期的表达依次上调,且在CML患者骨髓干、祖细胞中的表达显著高于正常人。在TCGA数据库中的泛癌分析也显示PYCR1在大多数肿瘤中高表达;进一步临床样本验证CML病人中的PYCR1 m RNA的表达,结果显示PYCR1呈现高表达的水平。2.成功构建沉默和过表达PYCR1的CML细胞稳转株。沉默PYCR1可抑制CML细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡、细胞周期阻滞于G1期,并增强CML细胞对伊马替尼的敏感性;过表达PYCR1可促进CML细胞增殖、迁移和细胞周期G1期向S期的转变,抑制CML细胞凋亡和对伊马替尼的敏感性。3.沉默PYCR1可抑制BCR-ABL及其下游的Stat5、Crkl信号通路。转录组测序分析发现,沉默PYCR1可抑制CML细胞中三羧酸循环、氧化磷酸化等线粒体能量代谢通路,并诱导线粒体ROS水平升高。结论:PYCR1在CML中高表达,并且促进了CML细胞的增殖、迁移,抑制了CML细胞的凋亡和对伊马替尼的敏感性。抑制PYCR1的表达,可通过下调BCR-ABL下游信号通路、破坏线粒体能量代谢、诱导线粒体ROS水平升高等机制诱导CML细胞的凋亡,从而抑制CML的恶性表型。

关键词： 转化生长因子β1   绒毛膜癌JEG-3细胞   PI3K/AKT信号通路   波形蛋白   E-钙粘蛋白  

摘要： 目的:研究转化生长因子-β1(TGF-β1)能否通过PI3K/AKT信号通路调控绒毛膜癌细胞系JEG-3发生增殖、侵袭、迁移及上皮间质转化。方法:体外培养绒毛膜癌细胞系JEG-3,随机分为对照组、TGF-β1组(TGF-β1浓度:25、50、100和200ng/m L),分别处理0h、24h、48h、72h后,采用CCK-8细胞增殖实验测定JEG-3细胞的增殖能力,用于筛选并确定TGF-β1的最佳作用浓度及时间;通过细胞划痕实验及Transwell小室迁移实验检测对照组和100ng/ml TGF-β1实验组处理48h后,对JEG-3细胞迁移能力的影响;Transwell侵袭实验检测对照组和100ng/ml TGF-β1实验组对JEG-3细胞侵袭的影响;蛋白质印迹法(Western blot)检测100ng/ml TGF-β1对JEG-3细胞中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的变化;功能恢复实验:培养JEG-3细胞将其分为对照组、TGF-β1组、LY294002+TGF-β1组(用LY294002预处理JEG-3细胞1h后,再加入100ng/ml TGF-β1继续培养),重复上述实验验证TGF-β1对绒毛膜癌增殖、迁移及侵袭的影响及蛋白表达的变化。结果:***-8实验结果:随着TGF-β1浓度和作用时间的增加,JEG-3细胞的增殖活性逐渐增强。与浓度100ng/ml相比,浓度为200ng/ml无显著增加。说明在一定浓度范围内,TGF-β1对绒毛膜癌细胞的增殖作用具有良好的浓度和时间依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。由于浓度在100ng/ml和48h时增加的趋势更为明显,因此将其作为后续实验的浓度和时间。2.划痕实验发现:对照组、TGF-β1组处理48h后,JEG-3细胞的迁移率分别为(46.31±0.024)%、(80.92±0.038)%,差异具有统计学意义(P<0.01)。***小室迁移实验结果:与对照组(383.5±12.02)个/高倍显微镜相比,TGF-β1组(765.5±43.13)个/高倍显微镜通过小室的细胞数显著增加。差异具有统计学意义(P<0.05)。***小室侵袭实验结果:与对照组(342.0±16.97)个/高倍显微镜相比,TGF-β1组(883.5±45.96)个/高倍显微镜通过小室的细胞数明显增多。差异具有统计学意义(P<0.01)。5.蛋白质印迹实验(Western blot):100ng/ml TGF-β1组和对照组中PI3K、AKT蛋白表达量相比,未见显著差别,差异无统计学意义(P>0.05)。p-PI3K、pAKT、E-cadherin、Vimentin蛋白在100ng/ml TGF-β1处理组中表达量分别为(1.986±0.0014、2.2405±0.0063、0.6995±0.0615、1.2055±0.0389),与对照组中的表达量(0.9985±0.0035、0.9985±0.0063、0.9765±0.0063、1.0285±0.0078)相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.功能恢复实验:加入PI3K抑制剂LY294002(20umol/L)后,抑制了TGF-β1对JEG-3细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(EMT);蛋白质印迹实验显示,加入LY294002后,抑制了TGF-β1对PI3K、AKT磷酸化。结论:1.外源性TGF-β1对绒毛膜癌细胞系JEG-3的增殖具有浓度和时间依赖性。***-β1对绒毛膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT均具有明显的促进作用。***-β1可能通过PI3K/AKT信号通路促进绒毛膜癌细胞的恶性生物学行为。

关键词： 结直肠癌   循环肿瘤细胞   甲基化   miR-486-5p   miR-34c-5p  

摘要： 第一部分结直肠癌循环肿瘤细胞（CTC）分选捕获系统的建立目的:构建针对结直肠癌CTC的多功能高效纳米免疫脂质磁球,用于结直肠癌CTC的分选捕获及数量统计。方法:通过反向蒸发法制备Ep CAM（Ep CAM Magnetic liposome,EP-IML）和EGFR免疫脂质磁球（EGFR Magnetic liposome,EG-IML）,采用粒径电位分析仪、蛋白电泳仪、原子力显微镜、紫外分光光度仪、磁性能分析仪和X射线衍射仪等对构建的免疫脂质磁球系统进行分子结构和性能的表征,初步建立一套针对结直肠癌CTC分选捕获系统。结果:成功制备了EP-IML和EG-IML两种免疫脂质磁球;粒径分别为227.8±5.6 nm和200.8±7.2 nm,电位分别为30.3±2.7 m V和32.5±3.7 m V,免疫磁球在水溶液中分散均匀稳定（分布分散且不团聚）。此系统磁球表面抗体纯度较高,饱和磁化强度分别为26.7和49.2 Am2/Kg,具备FeO磁性颗粒的结晶性能。结直肠癌细胞毒性实验结果显示该磁球系统细胞毒性较低,生物相容性好,能达到临床使用要求。结论:完成结直肠癌CTC的多功能高效纳米免疫脂质磁球的制备,并完成对其功能特性的表征,可用于结直肠癌CTC的分选捕获及数量鉴定。第二部分结直肠癌CTC分选捕获系统的精准和稳定性研究目的:开展循环肿瘤細胞高效磁分选捕获系统相关结直肠癌辅助诊断功能验证;并进行功能优化。方法:对建立的结直肠癌CTC分选捕获系统;选取部分有代表性的病例作为重点考察,分析捕获系统与临床病理的一致性。此外,进行此系统与Cell Search检测系统的比对,进一步证明检测体系的可行性和稳定性。结果:对建立的结直肠癌CTC分选捕获系统所用试剂用量和反应条件等作出优化和完善调试后,成功构建针对结直肠癌循环肿瘤细胞捕获系统:高精度、高稳定性的分选、捕获、鉴定系统。细胞实验显示EP-IML和EG-IML对结直肠癌细胞均有较高的捕获能力,捕获率可达90%以上。临床实验证实:EP-IML和EG-IML能有效地捕获结直肠癌患者外周血中的CTC,染色效果清晰可辨。与Cell Search检测系统进行比对,发现此检测体系有较强的精确度和更高的稳定性。结论:通过对建立的结直肠癌CTC分选捕获系统各项参数进行逐步优化,一系列综合验证后,此结直肠癌CTC分选捕获系统具有精确度高,稳定性好的特点。第三部分微小RNA mi R-486-5p/mi R-34c-5p在CRC单细胞和组织中的表达目的:临床入组结直肠癌样本,开展对外周血CTC及对应组织样本mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的检测。方法:通过EP-IML和EG-IML磁分选获得的细胞分别提取DNA和RNA,通过荧光定量PCR及q MSP分别进行mi R-486-5p/mi R-34c-5p的表达水平及甲基化水平的检测。选取入组检测结直肠癌CTC患者的配对组织样本,提取DNA和RNA进行反转录后通过荧光定量PCR及q MSP分别进行mi R-486-5p/mi R-34c-5p的表达水平及甲基化水平的检测。检测与之对应的循环肿瘤细胞mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的一致性,建立结直肠癌来源的组织层面与血液层面的一致性分析及引起动态差异的因素。结果:基于CTC分离获得的核酸样本,荧光定量PCR结果显示:来源于结直肠癌患者的mi R-486-5p/mi R-34c-5p的表达水平低于正常人群（P<0.05）;q MSP结果显示:来源于结直肠癌患者的mi R-486-5p/mi R-34c-5p的甲基化水平明显增高（P<0.05）。此外,与CTC对应的组织样本中mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的检测结果显示,与CTC获得的mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平一致。结论:通过对来源于临床入组的结直肠癌样本中mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平的检测,来源于CTC与来源于组织样本的mi R-486-5p/mi R-34c-5p表达水平及甲基化水平变化趋势一致。第四部分微小RNA mi R-486-5p/mi R-34c-5p过表达及去甲基化对CRC细胞功能的影响目的:分别在mi R-486-5p/mi R-34c-5p过表达及去甲基化状态下对结直肠癌细胞增殖,侵袭,迁移以及凋亡的影响。方法:设置:对照组（NC组）,采用5-Aza进行去甲基化处理,构建mi R-486-5p/mi R-34c-5p的去甲基化组（5-Aza组）,通过慢病毒构建mi R-486-5p/mi R-34c-5p过表达组（mimics组）。在SW480和LOVO结直肠癌

关键词： 胰腺癌   EMP1   生物信息学   增殖   侵袭   迁移   PI3K-AKT  

摘要： 目的:探索EMP1在胰腺癌细胞中的生物学作用及促癌机制。阐明EMP1在人胰腺癌细胞中的差异表达及其对胰腺癌As PC-1、Bx PC-3细胞生物学行为的影响及其下游分子机制,为胰腺癌患者在预后评估和分子靶向治疗方面提供理论依据。方法:首先在TCGA、GTEx数据库中分析EMP1在胰腺癌组织中的表达情况及其与临床预后的关系,通过EMP1共表达基因的GEO分析和KEGG通路富集分析,探索EMP1可能参与调控的胰腺癌进展信号通路。其次培养胰腺癌细胞系,通过RT-PCR、WB检测EMP1 m RNA及蛋白水平的表达差异。构建慢病毒载体,分别转染胰腺癌As PC-1、Bx PC-3细胞系获得敲低实验组(EMP1-sh1、EMP1-sh2、EMP1-sh3),转染空白载体病毒获得阴性对照组(Negative control)。采用CCK8、克隆形成、划痕、Transwell实验检测下调EMP1对胰腺癌细胞生物学行为的影响,WB检测下调EMP1对胰腺癌细胞增殖、凋亡及下游相关分子信号通路蛋白的影响。结果:1.与正常胰腺组织和细胞相比,EMP1在癌组织和细胞中高表达,对胰腺癌患者有临床诊断意义。EMP1高表达是胰腺癌患者预后的一个独立危险因素,与预后不良密切相关,是潜在的一个预后生物标志物。GEO结果显示,EMP1涉及多个生物过程和分子功能。KEGG通路富集结果显示EMP1通过PI3K-AKT等多种信号通路影响胰腺癌的进展。2.与正常胰腺上皮细胞相比,EMP1 m RNA和蛋白在胰腺癌细胞系中高表达(P<0.05)。下调EMP1的表达可显著抑制As PC-1、Bx PC-3细胞的增殖、侵袭及迁移能力(P<0.05)。***富集分析显示,大部分基因富集在PI3K-AKT通路中。在胰腺癌细胞系中下调EMP1显著降低了P-PI3K、P-AKT蛋白表达。与Negative control组相比,敲低EMP1癌细胞凋亡蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,Bcl-2/Bax比值降低。结论:胰腺癌组织细胞中EMP1的高表达对胰腺癌的诊断和预后有一定的价值,EMP1的高表达与患者预后不良有关。其机制可能是EMP1通过PI3K-AKT途径促进癌细胞的增殖、侵袭、迁移,并抑制癌细胞的凋亡。因此,EMP1在胰腺癌中对肿瘤生长起到支持作用,可能成为胰腺癌诊断、治疗及预后的潜在靶点。