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关键词： 凝血因子Ⅱ   肝癌   增殖   迁移   侵袭  

摘要： 目的 本研究以肝癌细胞为研究对象，探索凝血因子Ⅱ（简称F2）对肝癌细胞系的增殖、迁移、侵袭以及凋亡等生物学行为的影响，寻找新的肝癌预后标志物，为肝癌治疗提供潜在靶点。方法 利用ICGC数据库验证F2在肝癌中的表达水平及其与预后的关系。通过重组慢病毒载体构建稳定过表达和稳定敲低的肝癌细胞株，后通过CCK-8实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell细胞侵袭实验、流式细胞术、免疫印迹实验检测F2对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的影响。最后利用生物学信息方法进行通路富集分析。结果 F2在肝癌组织中表达下调（P<0.001），且与患者总生存时间更短有关（P<0.01）。CCK-8、平板克隆实验结果显示，F2对肝癌细胞的增殖起抑制作用（P<0.05）；划痕实验、Transwell细胞侵袭实验结果显示，F2对肝癌细胞的迁移和侵袭起抑制作用（P<0.05）；流式细胞术和免疫印迹结果显示，F2诱导肝癌细胞凋亡（P<0.05）。F2的潜在相关基因主要参与胆固醇代谢、PPAR信号通路、凝血等过程。结论F2对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭有一定的抑制作用，并诱导肝癌细胞凋亡，其可能在肝癌的发生发展中起抑制作用。

关键词： 静电纺丝   多孔钛   PRP   骨缺血坏死   药物缓释系统  

摘要： 背景:骨缺血坏死是由于各种病因使骨组织周围血液供应不足进而导致骨组织坏死从而出现骨组织塌陷或裂痕。临床上常见于股骨头,距骨及手腕舟骨,其中股骨头缺血性坏死在临床中最为常见。各种因素使骨组织周围血运受损或形成微血栓使骨组织周围血运减少进而导致骨坏死。静电纺丝可以将治疗股骨头坏死的药物或某些蛋白掺入纳米级粗细的纤维中,并且可以通过改变纳米纤维的参数和性质来提高药物在体内的稳定性和释放速率。我们将当前热门的静电纺微纳米载药系统作为基础,将其与多孔的钛金属棒相结合,研发出一种可以局部、长效、可控的释放药物的生物型支架。并对支架促进血管再生及其生物性能进行研究。 方法:将PRP(platelet rich plasma)与静电纺丝技术结合形成纳米载药系统再与多孔钛棒支架相结合。测试了纳米载药系统对于促进细胞体外生长、生长因子体外释放曲线的效果。 结果:本研究报告了一种用静电纺丝技术处理PRP并与钛棒支架结合的有效的方法的开发,以用于潜在的组织工程应用。通过将活化的PRP在多孔钛棒支架表面进行静电纺丝,得到适合于负载PRP而且缓慢释放的载体。静电纺丝PRP涂层显著改善了钛支架上的生物特性、增加间充质干细胞附着和增殖。此外,静电纺丝PRP-钛棒支架显示出能够维持例如PDGF(platelet-derived growth factor)、TGF(ransforming growth factor)的释放。本研究的结果证明了静电纺丝PRP-钛支架通过药物缓慢释放促进细胞附着、增殖以及释放生长因子。 结论:本研究运用静电纺丝技术构建了搭载PRP的纳米结构的药物缓释系统并与多孔钛假体相结合,检测了其支架纳米结构及性能、促进体外细胞生长以及体外药物释放曲线等效果。多孔钛棒的微孔结构使其具有更大的载药量,而静电纺丝纤维与多孔结构的结合则可以实现药物的缓释。静电纺丝结合多孔钛可能是一种在较长时间内实现局部缓释PRP的策略。但是此系统在药物的缓释浓度等方面仍然有很大的研究空间,真正用于批量生产以及临床应用仍需要进一步的研究。

关键词： 生物人工肾   脱细胞外基质   肾皮质近曲小管上皮细胞   细胞转运   无血清培养  

摘要： 慢性肾脏病(CKD)会导致肾功能不全并发展为终末期肾病(ESKD)和心血管疾病,是全球第16大早期死亡原因,预计到2040年将上升到第5位。血液透析是治疗CKD的主要方式,但透析只能在一定程度上替代肾脏的功能,长期血液透析使患者的死亡率高达15%-20%,血液透析替代疗法是相关研究领域的重要发展方向。生物人工肾(BAK)将传统的血液过滤器与含有肾近端小管上皮细胞的生物反应器单元串联在一起,上皮细胞的生物转运功能够极大地提高血透患者的生存率,但解决肾小管上皮细胞在生物反应器上的结合及获得相应功能是BAK开发成功的关键。本研究围绕上述关键问题,研究并比较了肾小管上皮细胞在不同类型的脱细胞外基质(d ECM)上的粘附、增殖、分化及细胞转运功能;同时,基于优选的d ECM,研究并比较了不同特性的无血清培养体系;此外,还研究了基于现有透析器中空纤维膜表面修饰的改性技术方法,开发设计了未来可用于BAK细胞负载的细胞循环接种装置,相关研究内容将有助于BAK的研发。具体研究内容如下:论文尝试了冻融循环法、SDS法、EDTA法、Triton X-100法4种脱细胞外基质方法,综合DNA残留量和d ECM余留率,冻融循环法效果最佳。所以采用冻融循环法对HK-2、小鼠上皮样成纤维细胞(L929)和小鼠骨髓间充质干细胞(m BMSCs)进行脱细胞处理,保留了细胞外基质主要的多糖成分和蛋白,维持ECM结构。系统研究了不同细胞来源的脱细胞外基质对HK-2细胞的增殖和功能表达的影响,研究结果显示HK-2细胞在d ECM有更好的增殖能力,培养7天后细胞汇合,细胞铺展面积高于对照组,粘附基因(FAK和Integrin-β1)表达水平升高;HK-2-ECM和m BMSCs-ECM显著上调SGLT2的表达,L929-ECM和m BMSCs-ECM则显著上调Na-K ATPase的表达;对于有机阴离子、葡萄糖和蛋白质的运输,d ECM组的转运功能都强于对照组,且HK-2表达出更好的碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶活性。本论文建立了HK-2细胞无血清培养体系,在HK-2的粘附、增殖方面,该无血清培养体系和血清培养相比不存在统计学差异,无血清培养也不会降低HK-2转运功能。同样使用冻融循环法对无血清培养的HK-2细胞进行脱细胞处理,无血清培养时HK-2细胞在d ECM增殖更强,形成单层细胞汇合;SFM1-ECM和SFM2-ECM上调HK-2的FAK、Integrin-β1、SGLT2、Na-K ATPase的表达,粘附和转运功能提高;对于有机阴离子、葡萄糖和蛋白质的运输,d ECM组的转运效率都高于对照组,表达出更好的碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶活性,证明无血清时d ECM可以维持HK-2的分化表型。此外,本论文研究了聚醚砜中空纤维膜改性对HK-2细胞的增殖和功能表达的影响,改性膜HF-PDA和HF-PDA-Gel MA增加了亲水性和细胞粘附位点,显著促进细胞的粘附、增殖和转运功能表达。制备了d ECM/Gel MA水凝胶,将该水凝胶替代Gel MA,有望发挥脱细胞外基质对HK-2功能表达的提高作用。这些研究有望为生物人工肾细胞单元的建立做出贡献。

摘要： 随着医学教育的改革和发展，如何培养医学生的基础学科核心素养已成为医学教育需要探讨的问题。医学细胞生物学是医学专业中的重要基础学科之一，其核心素养涉及基础学科知识和实践技能等多个方面。本文以医学细胞生物学为例，针对医学专业背景的学生，如何培养其基础学科的核心素养，提出了以下几点建议：一是，加强基础学科教育，提高医学生的细胞生物学知识和实践技能；二是，注重医学生综合素质的培养，培养学生的创新思维和团队合作能力；三是，加强实践教学，让学生在实践中掌握医学细胞生物学知识和技能。通过以上建议，可以有效提高医学专业学生的基础学科核心素养，为医学教育的发展和进步做出贡献。

关键词： 翼状胬肉   成纤维细胞   SOX4   松果菊苷  

摘要： 目的:探讨性别决定基因-相关蛋白结构域4(sex determining region Y-related(SRY)-type high mobility group(HMG)-box4,SOX4)抑制剂松果菊苷(EA)对翼状胬肉成纤维细胞(HPFs)生物学特性的影响,为治疗翼状胬肉以及防止术后复发提供新的思路。方法:1.通过原代培养获得HPFs及结膜成纤维细胞(NFs),观察细胞生长及形态并用细胞免疫染色法对其进行鉴定。2.通过CCK-8、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测HPFs及NFs的增殖、迁移及侵袭能力。3.通过RT-pcr、WB检测HPFs及NFs中SOX4 RNA及蛋白的表达情况。4.通过CCK-8实验检测不同浓度及时间的EA对HPFs增殖能力的影响。5.选择适宜浓度的EA处理HPFs,检测EA处理组与未处理组之间SOX4RNA及蛋白表达情况的改变及细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化情况。结果:***与NFs在细胞增殖、迁移及侵袭能力上均存在明显差异,且SOX4在HPFs中的表达显著高于NFs。***可以下调HPFs中SOX4的表达,并以剂量、时间依赖性的方式抑制HPFs的增殖、迁移及侵袭能力。

关键词： 肝癌   PD-1/PD-L1   CRISPR/Cas9系统   细胞增殖  

摘要： 背景肝癌作为全球最常见和致死率较高的恶性肿瘤之一,目前仍以手术等传统治疗方式为主。近年来,随着免疫治疗的迅猛发展,使得肿瘤治疗模式发生了巨大变化,特别是免疫检查点已成为治疗晚期癌症最具有潜力的途径之一。程序性细胞死亡蛋白1(Programmed death-1,PD-1)是研究最多的免疫检查点,其通过影响T细胞活性,发挥免疫逃逸机制。以往的研究证实,PD-1在免疫细胞高表达,与其主要配体程序性细胞死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)结合,诱导肝癌细胞免疫逃逸,进而导致肿瘤转移和复发。但在近期的研究中证实,肝癌细胞内源性PD-1呈过表达,对于探讨该部分PD-1在肝癌细胞中的生物学影响具有重要意义。目的利用CRISPR/Cas9系统敲除人源肝癌细胞HepG2的PD-1基因,构建PD-1基因敲除的HepG2细胞系,探讨肝癌细胞内源性PD-1对HepG2细胞生物学功能的影响。方法1.通过生物信息学、蛋白印迹法检测PD-1在肝癌细胞中的表达;利用酶切、连接等方法构建具有PD-1基因双sgRNA的CRISPR/Cas9系统敲除质粒。2.通过细胞转染、抗性筛选及有限稀释法获得HepG2-PD-1-KO细胞系,采用PCR半定量和蛋白印迹法分别检测PD-1的mRNA、蛋白表达水平。3.通过CCK8法检测HepG2-PD-1-KO细胞系增殖能力,克隆形成实验评估细胞克隆形成能力,细胞划痕检测细胞迁移能力,Transwell实验评估细胞侵袭能力,流式细胞检测术检测细胞凋亡水平。4.通过裸鼠皮下移植瘤实验,检测HepG2-PD-1-KO细胞系在体内成瘤能力和增殖情况。结果1.肝癌细胞的PD-1表达水平较肝脏正常细胞有明显升高(P<0.05),成功构建了PD-1基因敲除的双sgRNA重组质粒。2.将构建成功的敲除质粒转染肝癌细胞HepG2,通过抗性筛选、有限稀释法获得单克细胞隆株,经基因测序证实了PD-1基因成功敲除;PD-1基因的mRNA、蛋白表达水平明显降低(P<0.05),最终获得HepG2-PD-1-KO细胞系。***8实验、克隆形成实验证实HepG2-PD-1-KO细胞系的增殖能力较野生型细胞减弱(P<0.05),细胞划痕、Transwell实验结果表明HepG2-PD-1-KO细胞的迁移、侵袭能力降低(P<0.05),流式细胞术检测结果表明两组细胞的凋亡水平无明显差异(P>0.05)。4.在裸鼠成瘤实验中,HepG2-PD-1-KO细胞系的肿瘤体积较HepG2-WT细胞明显减小(P<0.05),肿瘤增殖在体内受到抑制。结论通过CRISPR/Cas9系统获得了HepG2-PD-1-KO稳定细胞系。PD-1基因敲除可以显著抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力,肝癌细胞内源性PD-1基因缺失可有效抑制HepG2肿瘤细胞的体内外生长。

关键词： 肝细胞癌   环状RNA   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：1.检测环状RNA（circular RNA，circRNA）hsa_circ_0016863在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者血浆、组织及细胞株中的表达，探讨血浆hsa_circ_0016863在HCC临床诊疗中的价值;2.探讨hsa_circ_0016863对HCC细胞生物学行为的影响;3.分析hsa_circ_0016863促进HCC进展的机制。　　方法：1.基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中筛选差异表达的circRNA;2.建立实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测hsa_circ_0016863表达量的方法并进行性能评价;***测序、琼脂糖凝胶电泳、Rnase R酶消化实验、放线菌素D实验来验证hsa_circ_0016863的环状结构及其稳定性;4.通过临床病理参数相关性分析、术前术后血浆hsa_circ_0016863表达变化以及绘制生存曲线探讨血浆hsa_circ_0016863对HCC的临床诊疗价值;***-PCR检测hsa_circ_0016863在HCC组织和细胞株中的相对表达及亚细胞定位;6.分别构建hsa_circ_0016863的干扰载体和过表达载体，并通过qRT-PCR验证其转染效率;***-8、克隆形成、Transwell、细胞周期及细胞凋亡实验检测hsa_circ_0016863对HCC细胞增殖、迁移、侵袭、周期及凋亡的影响;8.通过circinteractome和starbase数据库预测hsa_circ_0016863下游的miRNA，通过miRDB、mirDIP、ENCORI、TarBase数据库预测miRNA的靶mRNA，并绘制circRNA-miRNA-mRNA网络图;9.通过Sangerbox3.0对靶mRNA进行GO富集分析和KEGG分析;10.结合TCGA、ENCORI和miRDB数据库，进一步分析hsa_circ_0016863与靶miRNA、miRNA与靶mRNA的相关性。　　结果：1.从GEO数据库中筛选出在HCC中高表达的hsa_circ_0016863;***-PCR检测hsa_circ_0016863的熔解曲线单峰特异，琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序证实其引物设计正确;放线菌素D和Rnase R酶消化实验证实hsa_circ_0016863具有稳定的环状结构;***患者血浆中hsa_circ_0016863表达升高，与肿瘤直径（P=0.013）、分化程度（P=0.012）和TNM分期（P=0.003）相关。动态监测发现术后HCC患者血浆hsa_circ_0016863含量明显下降，而且血浆hsa_circ_0016863表达高的患者生存时间越短;***_circ_0016863在HCC患者癌组织及HCC细胞株中高表达;5.构建hsa_circ_0016863的干扰载体（sh-circ），转染HCCLM3细胞后，hsa_circ_0016863表达下降;构建hsa_circ_0016863过表达载体（ov），转染SMMC-7721细胞后，hsa_circ_0016863表达升高;6.转染sh-circ后的HCCLM3细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力下降，细胞凋亡能力增强，细胞周期阻滞在G0/G1期;转染ov后的SMMC-7721细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力增强，细胞凋亡能力减弱，细胞周期进展加速;7.核质分离实验显示hsa_circ_0016863主要定位于细胞质，提示hsa_circ_0016863可能作为竞争性内源RNA（ceRNA）;8.构建以hsa_circ_0016863为中心的circRNA-miRNA-mRNA调控网络;***富集分析和KEGG分析表明，hsa_circ_0016863的下游mRNA基因主要富集在“p53信号通路”上;10.通过相关性分析，初步确定了hsa_circ_0016863可通过调节hsa-miR-576-5p介导的CDK6促进HCC发生发展。　　结论：HCC初诊患者血浆hsa_circ_0016863表达显著升高，与不良预后相关，提示其可能是一个潜在的HCC临床生物标志物;hsa_circ_0016863在HCC组织和细胞株中高表达，与HCC细胞增殖、迁移、侵袭、周期和凋亡有关;hsa_circ_0016863/hsa-miR-576-5p/CDK6轴可能通过p53信号通路调控HCC的进展。

关键词： 胃癌   5’-tiRNAGly基因   基因表达   OGDHL基因   细胞生物学   Warburg效应   代谢重编程  

摘要： 目的：检测5’-tiRNAGly在胃癌患者血清中的相对表达水平，探究其作为胃癌诊断和预后标志物的潜能;从体外和体内探究5’-tiRNAGly对胃癌生物学进程的影响;探究5’-tiRNAGly和OGDHL的结合及调控关系，研究其对胃癌细胞生物学功能的影响，深入探究5’-tiRNAGly靶向OGDHL增强胃癌Warburg效应调控胃癌代谢重编程的机制。　　方法：高通量测序筛选胃癌组织中差异表达的tsRNAs;RT-qPCR检测5’-tiRNAGly在胃癌血清、组织和细胞中的表达水平;通过ROC曲线分析5’-tiRNAGly在胃癌患者血清中的诊断效能;卡方检验、Kaplan-Meier生存分析用于研究胃癌血清中5’-tiRNAGly的表达水平与临床病理参数的相关性及其预后价值;CCK-8、克隆形成、EdU、Transwell实验、流式细胞术和裸鼠成瘤实验检测5’-tiRNAGly对胃癌生物学进程的影响;核浆分离实验和荧光原位杂交实验用于检测5’-tiRNAGly的亚细胞定位;双荧光素酶报告基因实验用于验证5’-tiRNAGly与OGDHL的结合关系;LC-MS/MS质谱检测胃癌细胞的能量代谢产物;功能回复实验验证5’-tiRNAGly靶向OGDHL调控胃癌细胞Warburg效应和生物学功能;Western blot实验验证5’-tiRNAGly靶向OGDHL激活糖酵解关键酶和PI3K/Akt/mTOR信号通路。　　结果：高通量测序和RT-qPCR检测发现5’-tiRNAGly的表达水平在胃癌组织中显著升高。与健康体检者和胃炎患者相比，胃癌患者血清中5’-tiRNAGly的表达水平显著升高。生存曲线显示高5’-tiRNAGly表达水平的患者总体生存率较低。ROC曲线显示5’-tiRNAGly在血清中的表达水平可以区分胃癌患者与健康体检者和胃炎患者，具有较好的诊断效能，且在与临床常用肿瘤标志物联合后诊断效能进一步提高。临床病理资料相关性分析显示5’-tiRNAGly的表达水平与T分期、淋巴结转移、TNM分期和神经/脉管侵犯相关。　　体外细胞功能实验发现5’-tiRNAGly可以增强胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而对胃癌细胞的凋亡起抑制作用。体内裸鼠成瘤实验发现抑制5’-tiRNAGly可以抑制肿瘤组织的生长。KEGG富集分析显示5’-tiRNAGly的靶基因在代谢通路中富集。检测胃癌细胞的葡萄糖摄取量和乳酸生成量发现5’-tiRNAGly可以增强胃癌细胞的Warburg效应。生物信息学分析预测了5’-tiRNAGly的靶基因OGDHL。双荧光素酶实验验证了5’-tiRNAGly与OGDHL的结合关系。α酮戊二酸脱氢酶活性检测发现OGDHL与α酮戊二酸脱氢酶活性的活性呈正相关。LC-MS/MS质谱分析结果显示抑制5’-tiRNAGly或过表达OGDHL后α酮戊二酸含量减少，三羧酸循环增强。功能回复实验发现，OGDHL可以有效回复5’-tiRNAGly对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和Warburg效应的作用。此外，5’-tiRNAGly可以上调糖酵解关键酶的蛋白表达并激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，这种效果可以被OGDHL所挽回。　　结论：5’-tiRNAGly在胃癌组织和血清中表达上调，具有成为胃癌诊断和预后生物标志物的潜能;5’-tiRNAGly在体内外均可以促进胃癌的生物学进程;5’-tiRNAGly通过靶向OGDHL降低了OGDHC的活性，抑制三羧酸循环，同时上调了糖酵解关键酶的表达并激活PI3K/Akt/mTOR通路，共同增强了胃癌细胞的Warburg效应，促进了胃癌的恶性进展。

关键词： 大鼠   牙周膜   牙槽窝   间充质干细胞   P75神经营养因子受体   生物学特性  

摘要： 目的:提取大鼠牙槽窝干细胞(dental socket derived stem cells,DSCs)和大鼠牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),在体外探讨PDLSCs和DSCs的部分生物学特性的差异,以选择更优的种子细胞,为牙发育与牙周缺损再生修复打下基础。方法:(1)建立大鼠拔牙后的牙槽窝模型,苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察拔牙术后即刻与拔牙后第1、3、7天的牙槽窝组织形态,并用免疫组织化学法,检测在牙槽窝内P75神经营养因子受体(P75 Neurotrophin receptor,P75NTR)的表达与分布情况。(2)细胞的制取:观察大鼠牙槽窝的愈合组织(Extraction socket-derived early healing tissue,ESEHT)的形成情况,结合HE染色与免疫组织化学染色结果,选择最佳时间点的ESEHT,提取大鼠DSCs;另拔除大鼠切牙分离出PDLSCs,流式细胞仪鉴定PDLSCs与DSCs的表型。(3)增殖、克隆形成与多向分化能力:用CCK-8法和克隆形成检测对比PDLSCs与DSCs的差异;PDLSCs与DSCs进行成脂与成骨诱导,分别用油红O染色,与ALP及茜素红染色,并用RT-PCR及Western blot检测PDLSCs与DSCs成骨相关基因及蛋白表达情况,比较成骨分化能力的差异。结果:(1)建模后的大鼠拔牙创口愈合良好,逐渐形成一定形状的ESEHT,尤其在第3天时最为明显;HE染色结果中,拔牙术后3天的牙槽窝内,观察到大量的纤维结缔组织增生,而拔牙术后第1天的牙槽窝内未见结缔组织,拔牙术后第7天则骨组织愈合明显,骨小梁数量明显增多,较多骨髓腔形成。(2)免疫组化结果显示,拔牙术后即刻和第1天时,牙槽窝内壁的骨髓孔边缘,可见P75NTR的表达;而第3天,阳性表达区域出现在牙槽窝中心的纤维结缔组织周围,而牙槽窝内壁亦可见少量着色;拔牙术后7天,P75NTR表达于骨小梁边缘的纤维结缔组织。(3)培养出来的PDLSCs与DSCs形态较为类似,细胞呈长梭形和多角形,均高表达间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)相关表型。CCK-8法检测DSCs的增殖活力较PDLSCs强(p<0.05),且克隆形成率更高(p<0.001)。(4)PDLSCs与DSCs经油红O染色后,显示两种细胞都可形成脂滴,二者都显示出成脂分化的潜能。而ALP及茜素红染色后,DSCs的染色最深,且钙化结节形成更多,RT-PCR及Western blot检测成骨诱导7天后,DSCs的ALP、RUNX2的表达较PDLSCs高(P<0.05),结果都表明DSCs成骨分化能力较PDLSCs强。结论:大鼠拔牙后的牙槽窝内可以提取分离出DSCs,其可以在体外稳定的扩增,增殖和克隆形成能力均较PDLSCs高,DSCs有多向分化潜能,且成骨分化潜能比PDLSCs强。