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关键词： 胶质瘤   TWSG1   肿瘤增殖   铁死亡  

摘要： 【背景与目的】 胶质瘤是成人最高发的颅内恶性肿瘤,预后较差,目前的治疗策略效果仍然有限,为延长患者生存周期,有必要进一步探索其发生发展的机制,寻找新的生物学治疗靶点及方法。扭曲原肠胚形成BMP信号调节剂1(Twisted Gastrulation BMP Signaling Modulator 1,TWSG1)在许多肿瘤中高度表达,在部分肿瘤中参与调控肿瘤的增殖与迁移。同时我们在TCGA等数据库中初步发现,TWSG1在胶质瘤中呈高表达且可能导致胶质瘤患者的不良预后,提示其对胶质瘤的发生可能存在促进作用。然而,TWSG1在胶质瘤中的实际表达情况及对胶质瘤发生发展的确切作用尚不明确,因此本课题着重于探讨TWSG1在胶质瘤中的表达情况及对其生物学进展的作用。 【方法】 (1)运用生信分析预测TWSG1在胶质瘤中的表达量及对患者预后的影响,并通过PCR对收集的临床样本进行TWSG1的RNA水平检测加以验证。(2)运用慢病毒载体感染LN229和U251细胞,以构建TWSG1敲降以及过表达的胶质瘤细胞系。并通过WB及PCR从蛋白及RNA层面对感染效率进行验证。(3)对构建的TWSG1敲降及过表达胶质瘤细胞系,运用CCK-8法检测0至72小时间细胞活力的连续变化;运用Ed U实验检测TWSG1敲降及过表达之后对肿瘤细胞增殖能力的影响,TRANSWELL实验检测对肿瘤细胞迁移能力的影响,使用双染凋亡流式细胞术检测对胶质瘤细胞凋亡水平的影响。(4)通过访问c Bio Portal等数据库使用生信分析预测TWSG1在GBM的生物功能,访问GEPIA数据库检测TWSG1在GBM中与铁死亡标志基因的相关性。 【结果】 (1)通过TCGA、CGGA、HPA等数据库生信分析及临床样本PCR检测结果提示TWSG1在胶质瘤中高表达,且高表达TWSG1组患者预后显著差于低表达组。(2)运用CCK-8法、Ed U、TRANSWELL实验检测发现感染胶质瘤细胞系TWSG1敲降病毒的肿瘤细胞增殖活力及迁移能力相对于对照组明显下降,感染TWSG1过表达病毒的肿瘤细胞则呈现更高的增殖活力及迁移能力。(3)通过双染凋亡流失细胞术对构建的TWSG1过表达及敲降组检测分析发现TWSG1敲降组与对照组相比细胞凋亡率更高,而在过表达组中凋亡减少。(4)通过访问c Bio Portal数据库获取胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)中TWSG1的相关基因,并进行GO分析,提示TWSG1及相关基因在金属离子螯合的功能方向上高度富集,访问GEPIA数据库检测TWSG1在GBM中与铁死亡标志基因的相关性提示TWSG1可能抑制铁死亡发生。 【结论】 本研究实验结果表明,TWSG1在胶质瘤中高表达且导致患者的不良预后。敲降TWSG1的表达将导致胶质瘤细胞增生及迁移能力受到抑制,并促进胶质瘤细胞凋亡的发生。功能富集分析提示在GBM中TWSG1或许在金属离子螯合尤其是铁稳态及铁死亡调控上有独特作用;对于TWSG1调控胶质瘤发生发展中的具体机制需要进一步研究以阐明。本研究结果为更深入地理解胶质瘤发生发展的机制提供了新的思路,并为胶质瘤的诊治提供了新的潜在靶点。

关键词： 胃癌   增殖   迁移   PATL1   自噬相关蛋白  

摘要： 研究背景胃癌（Gastric Cancer GC）是临床上常见的恶性肿瘤,起源于胃黏膜上皮细胞。其发病率与患者年龄呈现正相关,男女患者人数比例约为2∶1[1];胃癌的发病机制与外泌体mi RNA的调控密切相关,其通过调节丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1）、细胞分裂蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6,CDK6）及血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factors,VEGF）的表达等机制来调控细胞增殖、凋亡,从而影响胃癌的发生发展。PATL1经过测序筛选出在胃癌组织中高表达的分子之一。根据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）最新统计数据2018年胃癌发病率和病死率分别位居全球恶性肿瘤的第五位和第三位,数据显示,我国胃癌病死例数约占全球胃癌病死总数的40%[1]。目的检测PATL1在胃癌中的表达并探讨分析与胃癌患者临床预后的关系;探索PATL1对胃癌细胞增殖和迁移的影响。方法结合TCGA数据库和HPA数据库分析泛癌和胃癌中PATL1的表达,结合Kaplan-Meier Plotter曲线预后分析PATL1在不同类型胃癌中的表达。选择胃癌手术的42例患者,取手术切除的胃癌组织及配对癌旁组织,采用q RCR,分析胃癌组织中PATL1的表达。以siRNA对胃癌细胞系AGS进行干扰PATL1表达,通过CCK8实验分析PATL1对胃癌细胞株AGS增殖的影响,并以Transwell和划痕愈合试验探究PATL1对AGS迁移的影响。Western blotting检测敲减PATL1后C-MYC和ATG7蛋白表达变化。结果结合TCGA数据库使用仙桃（https://***/products）得出PATL1在33种泛癌中有18种高表达（P<0.01）,在胃癌中PATL1高表达（P<0.01）Kaplan-Meier Plotter曲线图预后分析,PATL1在肠型胃癌患者中高表达（P<0.01）。总生存时间短的胃癌患者中PATL1表达比总生存时间长的胃癌患者高（P<0.01）。在弥漫型和混合型胃癌患者中PATL1表达无统计学意义。结合HPA数据库,在胃癌组织中PATL1表达高于正常胃组织。经q PCR验证42例胃癌患者组织,结果显示胃癌组织中PATL1的表达明显高于配对癌旁组织（P<0.01）。对胃癌细胞株AGS的PATL1敲减后,进行CCK8增殖实验结果显示敲减PATL1后胃癌细胞株AGS增殖能力弱于对照组（P<0.01）;划痕愈合实验,Transwell实验表明敲减PATL1后胃癌细胞株AGS迁移能力弱于对照组（P<0.01）。Western Blot实验中敲减PATL1后C-MYC和ATG7蛋白表达随之降低。表明有可能通过PATL1,C-MYC,ATG7相互串扰调节自噬进而促进胃癌的进展（P<0.01）。结论PATL1在胃癌中的表达增加且与不良预后相关,PATL1促进胃癌细胞的增殖和迁移,PATL1有作为胃癌治疗新靶点的潜力。

关键词： PKMYT1   乳腺癌   细胞增殖   生物信息学分析   生物学行为  

摘要： 目的通过生物信息学分析预测PKMYT1在乳腺癌中的表达情况以及对乳腺癌生物学行为的影响,综合临床相关性分析、GSEA功能富集分析及生存分析探索PKMYT1在乳腺癌中发挥的作用及对乳腺癌发生发展的影响。且通过调节PKMYT1的表达探究其对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法1.生物信息学分析:利用TCGA、GEPIA 2以及TIMER2.0等多种生物信息学分析数据库研究PKMYT1在乳腺癌患者体内的表达水平,并且分析了与PKMYT1表达有关的临床特征相关性以及功能富集等情况。利用Cancersea数据库预测PKMYT1对乳腺癌生物学行为的影响,且根据Kaplan-Meier Plotter数据库的生存分析预测PKMYT1的表达与乳腺癌患者预后的关系。通过PINA数据库分析PKMYT1蛋白互作网络为了解其在乳腺癌进展中的作用机制及与其相关的癌症驱动靶点及药物靶点的预测。2.经实时荧光定量q RT-PCT实验检测PKMYT1在一种人类乳腺上皮细胞系MCF10A和四种人类乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937以及四种小鼠乳腺癌细胞系C127、4T1、EMT6、E0771中的相对表达水平。3.通过RNA干扰技术—脂质体转染法,将特异性的si-RNA和阴性对照序列si-Negative Control转染到MCF-7和MDA-MB-231细胞中,从而构建出具有特定功能的si-PKMYT1和si-NC细胞组,以实现对PKMYT1基因有效表达的抑制。4.通过q RT-PCR实验,验证si-PKMYT1的转染效果。5.通过Western Blot技术验证PKMYT1在转染MCF-7和MDA-MB-231后蛋白表达水平的变化。*** Counting Kit细胞实验探究了PKMYT1对乳腺癌细胞增殖功能的影响。7.经平板克隆实验探究PKMYT1对乳腺癌细胞集落形成和增殖能力的影响。8.通过划痕损伤实验,检测转染后细胞迁移愈合能力的变化。***细胞侵袭实验,验证转染si-RNA后对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。10.流式细胞术实验检测降低PKMYT1的表达对MCF-7、MDA-MB-231细胞其细胞周期的变化。11.经流式细胞术研究PKMYT1在乳腺癌细胞中对细胞凋亡的影响。12.使用SPSS25.0进行数据统计学分析。结果1.经生物信息学分析,PKMYT1在乳腺癌样本中的表达水平明显高于正常样本,P<0.001;对于同一个样本PKMYT1在癌组织中的表达远高于癌旁组织,P=<2e-16具有统计学差异;GEPIA2和TIMER2.0在线分析工具也进一步验证了PKMYT1在乳腺癌中的差异表达,结果表明,PKMYT1在乳腺癌样本中高表达。临床相关性分析发现,PKMYT1在乳腺癌中的表达与患者的年龄、肿瘤分期(Ⅰ～Ⅱ及Ⅰ～Ⅲ)以及原发肿瘤大小(T,T1～2、T1～3、T1～4)有显著相关性,P<0.05具有统计学意义,而与性别、远处移动(M)和淋巴结转移(N)无相关性,P>0.05无统计学差异;经GSEA功能富集分析发现PKMYT1高表达时与细胞周期、DNA复制、同源重组等功能相关性较高,说明PKMYT1在乳腺癌中可能对癌细胞的生长、增殖相关,以上P值均小于0.05,具有统计学意义;通过Cancersea数据库预测PKMYT1对乳腺癌生物学行为的影响,发现PKMYT1在乳腺癌发生发展中对其细胞周期、DNA损伤及修复、增殖、侵袭、转移、EMT以及凋亡均有不同程度的影响,且呈正相关关系;Kaplan-Meier Plotter数据库分析研究发现HR>1表明PKMYT1是乳腺癌的高风险因素,且PKMYT1的高表达会导致乳腺癌患者预后不良。蛋白互作网络分析发现与PKMYT1显著相关的蛋白在乳腺癌的发生发展过程中与细胞周期及细胞增殖机制密切相关,且发现PKMYT1相关的肿瘤药物靶点包括:MAPK10、MAPK8、CDK1、BCL2和PLK1。2.q RT-PCR结果分析,PKMYT1在人乳腺癌细胞系中的表达水平由高到低依次为MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和HCC1937,在小鼠乳腺癌细胞系中由高到低依次为4T1、E0771、C127和EMT6。3.在检测转染效率的实验中发现,与Control组和si-NC组比较,转染si-PKMYT1-2组中PKMYT1的表达水平显著降低P<0.05。4.经Western Blot实验显示PKMYT1在si-PKMYT1-2组中的蛋白表达水平显著降低P<0.05。*** Counting Kit细胞实验结果发现,与MCF-7、MDA-MB-231两种细胞的Control组及si-NC细胞组相比,转染si-PKMYT1-2细胞组的细胞增殖能力被显

关键词： 胶质瘤   泛癌   LAMC1基因   细胞生物学   生物信息学   低氧诱导因子1α  

摘要： 【目的】　　1.分析公共数据库中泛癌组织中LAMC1基因表达、预后及临床病理相关性。　　2.生物信息学预测胶质瘤中LAMC1的潜在的生物学功能和作用机制。　　3.分析LAMC1基因对胶质瘤细胞株生物学功能的影响。　　4.探索低氧诱导因子1α（HIF-1α）对LAMC1基因表达的调控作用。　　【方法】　　1.采用生物信息学技术检测GTEx、CCLE、TCGA和CGGA泛癌数据集中LAMC1mRNA表达及其与预后的关系，并以胶质瘤为例来验证LAMC1基因表达与临床病理参数的相关性。　　2.采用生物信息学技术分别预测LAMC1基因表达与肿瘤突变负荷、肿瘤微卫星不稳定性、错配修复基因突变、DNA甲基转移酶的相关性，LAMC1表达与免疫的关系，并进行基因集富集分析。　　3.利用临床样本组织芯片和免疫组化方法检测胶质瘤组织中LAMC1蛋白的表达并分析其与预后的相关性。　　4.采用qRT-PCR、Westernblot和免疫荧光检测LAMC1基因在U87MG、U251、A172和Hs683胶质瘤细胞株中的表达情况。　　5.以LAMC1基因高表达的Hs683为对象，采用RNAi技术敲减其表达。　　6.利用CCK-8、损伤划痕修复实验、transwell法检测敲减Hs683细胞LAMC1表达后，其细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。　　7.生物信息学预测HIF-1α与肿瘤进展的关联性，分析HIF-1α及与LAMC1结合的可能性。　　8.物理性低氧（2%O2）诱导HIF-1α表达和YC-1（HIF-1α抑制剂）抑制HIF-1α表达对胶质瘤细胞株LAMC1蛋白表达的影响;采用双荧光素酶报告基因检测HIF-1α与LAMC1启动子的结合和活性的调控作用。　　【结果】　　1.基于多个国内外公开数据库结果，多种TCGA肿瘤中癌与正常组织相比，LAMC1基因表达明显升高，并提示预后不良。　　2.生物信息学技术预测结果显示LAMC1与多种免疫调节基因表达正相关。　　3.与正常脑组织相比，临床胶质瘤组织中LAMC1蛋白高表达，并与预后不良显著正相关。　　4.在U87MG、U251、A172和Hs683四种胶质瘤细胞株中，Hs683细胞株具有最高水平的LAMC1表达。　　5.构建了LAMC1敲减质粒并包装了相应慢病毒颗粒，筛选了具有敲减效应的RNAi靶点，并顺利获得LAMC1表达下降的Hs683细胞株。　　***-8、损伤划痕修复实验、transwell法证实LAMC1基因敲减后抑制胶质瘤细胞系Hs683的增殖、迁移与侵袭。　　7.生物信息学分析表明，HIF-1α高表达与大多少TCGA肿瘤进展正相关，并与LAMC1水平存在正相关。　　8.生物信息学分析表明LAMC1基因启动子具有多个HIF-1α接合位点。　　***结果证实，缺氧微环境可诱导胶质瘤Hs683和U251细胞表达HIF-1α和LAMC1，并且两者都能被HIF-1α抑制剂（YC-1）所抑制。　　10.双荧光素酶报告基因检测HIF-1α可激活LAMC1基因启动子活性。　　【结论】　　***1基因在包括胶质瘤在内的泛癌中普遍高表达。　　***1基因的高表达与胶质瘤患者高病理分级和不良预后正相关。　　3.敲低LAMC1基因抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力。　　4.缺氧微环境通过HIF-1α直接调控LAMC1基因表达而促进胶质瘤的临床进展。

关键词： 颗粒细胞   N-乙酰半胱氨酸   氧化应激   绵羊  

摘要： 卵泡颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)是卵泡的主要功能细胞,GCs的增殖和凋亡与卵泡发育和成熟密切相关。N-乙酰半胱氨酸(N-acetly-L-cysteine,NAC)在降低机体细胞活性氧(Reactive oxygen species,ROS),维持细胞功能和细胞形态等方面发挥重要作用。NAC作为一种抗氧化剂已广泛应用。本研究在甘肃省武胜驿镇屠宰场采集2岁左右健康母绵羊正常发育的卵巢。待屠宰后立即取出两侧卵巢,37℃保存,4 h内送回实验室。采用卵泡液抽吸法分离GCs,免疫荧光技术进行GCs鉴定。探究最适GCs体外培养条件。通过添加不同浓度NAC(50、100、500、1000μmol/L),分析其对GCs增殖、凋亡、ROS水平、激素分泌及相关基因和蛋白表达水平的影响。使用PI3K/AKT抑制剂LY294002处理,探明NAC对绵羊GCs增殖、类固醇激素分泌的分子机制。利用HO对GCs进行处理构建氧化应激模型,通过NAC对模型进行预处理,研究NAC是否可以抑制模型细胞的凋亡。针对细胞抗氧化能力与NRF2及PI3K/AKT信号通路进行研究,探明NAC是否通过NRF2和PI3K/AKT信号通路来缓解HO诱导的氧化应激损伤。研究结果如下:1.免疫荧光鉴定结果表明体外培养绵羊GCs纯度达到99.2%;培养基加入15%血清时,细胞增殖效果显著高于其他浓度组(P<0.05),DMEM/F12组细胞的增殖效果优于DMEM组(P<0.05)。2.不同浓度NAC组GCs的增殖能力均高于对照组(P<0.05)。体外培养GCs48 h时,100μmol/L NAC能极显著提高GCs的增殖能力(P<0.01)。q RT-PCR和WB结果表明,100μmol/L NAC组的CCND1、CDK4和Bcl-2的表达水平显著上调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著上调(P<0.05),而Bax基因和蛋白的表达水平显著下调(P<0.05)。100μmol/L NAC显著降低GCs活性氧含量(P<0.05)。q RT-PCR结果表明,100μmol/L NAC组SOD1和CAT表达水平极显著上调(P<0.01)。ELISA和q RT-PCR结果显示,100μmol/L NAC组的P、E分泌量显著升高(P<0.01),P和E相关合成基因3β-HSD和CYP19A1的表达水平显著上调(P<0.05)。用NAC预处理后,再添加PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002,抑制剂LY294002显著降低GCs的增殖能力(P<0.01),抑制GCs分泌E、P(P<0.05);用NAC处理GCs,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著上调(P<0.05);用NAC预处理后,LY294002能够显著下调p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达(P<0.05)。3.200μmol/L HO,作用GCs12h,成功构建氧化损伤模型。HO组ROS、MDA含量显著增加(P<0.05),GSH含量及SOD活性显著降低(P<0.05),CAT和SOD1表达水平显著下调(P<0.05);GCs增殖活力显著降低(P<0.01),PCNA和Bcl-2的表达水平显著下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白水平显著下调(P<0.01),而Bax基因和蛋白的表达水平显著上调(P<0.05);E、P分泌量显著降低(P<0.05),炎症因子IL-18、IL-1b的含量显著升高(P<0.05);NRF2和HO-1基因和蛋白表达水平显著下调(P<0.05);p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。用NAC预处理后,再添加HO处理,ROS、MDA含量显著降低(P<0.05),GSH含量及SOD活性显著升高(P<0.05),CAT和SOD1表达水平显著上调(P<0.05);GCs增殖活力显著升高(P<0.01),PCNA和Bcl-2的表达水平显著上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白水平显著上调(P<0.01),Bax基因和蛋白的表达水平显著下调(P<0.05);E、P分泌量显著上升(P<0.05),炎症因子IL-18、IL-1b的含量显著降低(P<0.05);NRF2和HO-1的基因和蛋白表达水平显著上调(P<0.05);p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。综上所述,绵羊GCs体外培养最佳条件为含有15%血清的DMEM/F-12培养基、培养温度为37℃;NAC激活PI3K/AKT信号通路促进体外培养的绵羊GCs增殖,E和P分泌。NAC通过NRF2及PI3K/AKT信号通路来缓解HO诱导的氧化应激损伤。

关键词： 间充质干细胞   CD200   生物学特性   免疫调节   急性移植物抗宿主病  

摘要： 目的：　　探讨高表达CD200人脐带来源间充质干细胞（humanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcell，hUC-MSC）生物学特性及其治疗急性移植物抗宿主病（acutegraftversushostdisease，aGvHD）的作用。　　内容：　　1.培养鉴定hUC-MSC，流式细胞术分选CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC细胞亚群;2.体外实验探讨CD200highhUC-MSC生物学特性和免疫调节功能;3.建立小鼠aGvHD模型，探讨CD200highhUC-MSC治疗aGvHD的疗效。　　方法：　　1.体外分离培养hUC-MSC，采用吉姆萨染色观察细胞形态、流式细胞术分析细胞表型、碱性磷酸酶（ALP）染色和油红O染色分别检测细胞的体外成骨和成脂分化能力，实时荧光定量PCR(qPCR)检测成骨和成脂关键转录因子的表达。　　2.流式细胞分选仪分选CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC两群细胞，通过流式细胞术检测分选效率，Western印迹检测CD200在蛋白水平的表达情况，吉姆萨染色和流式细胞术检测CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC的细胞形态与细胞表型。　　3.将CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC进行体外诱导分化，碱性磷酸酶染色和油红O染色分别检测细胞的体外成骨和成脂分化能力，qPCR检测成骨和成脂关键转录因子的表达。CCK-8实验、流式细胞术、CFU-F实验和细胞划痕实验检测CD200highhUC-MSC、CD200lowhUC-MSC和hUC-MSC的细胞增殖能力、细胞周期、细胞克隆形成能力和迁移能力。　　4.将CD200highhUC-MSC、hUC-MSC和CD200lowhUC-MSC分别与小鼠T淋巴细胞共培养，采用流式细胞术CFSE染色法检测各组细胞对T细胞增殖能力的影响，qPCR检测T细胞炎症因子在mRNA水平的表达。　　5.构建小鼠急性移植物抗宿主病（aGvHD）模型，尾静脉注射CD200highhUC-MSC、hUC-MSC、CD200lowhUC-MSC进行治疗。通过记录小鼠的体重、临床Cook评分、生存率评估各组小鼠的生存状态;HE染色检测各组小鼠的肺、肝、肛周皮肤、小肠的病理学变化;流式细胞术检测各组小鼠脾脏T淋巴细胞向Th1细胞极化的比例;qPCR检测各组小鼠脾脏T淋巴细胞炎症因子在mRNA水平的表达。　　结果：　　1.对分离培养的hUC-MSC进行鉴定，结果表明，倒置显微镜下可见细胞均呈纤维样、长梭形，贴壁生长;流式细胞术检测细胞表型，细胞高表达CD73、CD90、CD105，低表达或不表达CD14、CD34、CD45;经体外成脂成骨诱导分化后，相较于自分化组，成骨诱导组ALP染色阳性，且ALP和OPN的mRNA表达水平显著升高，而成脂诱导组油红O染色阳性，且ADI和PPAR-γ的mRNA表达水平亦显著升高。以上结果表明，成功分离培养人脐带来源MSC，且符合国际MSC的认定标准。　　2.采用流式细胞术成功分选获得CD200highhUC-MSC和CD200-hUC-MSC，流式细胞术检测CD200highhUC-MSC中CD200表达率为(97.3±0.01)%。Western印迹结果证实CD200highhUC-MSC中CD200的表达明显高于hUC-MSC组与CD200lowhUC-MSC组。对CD200highhUC-MSC和CD200lowhUC-MSC进行生物学特性鉴定，结果表明，两种细胞的形态和表型均未发生改变，均可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。　　3.对CD200highhUC-MSC、hUC-MSC、CD200lowhUC-MSC进行CCK-8和细胞周期实验，结果显示，CD200highhUC-MSC的细胞增殖能力强;CFU-F实验和细胞划痕实验结果显示，CD200highhUC-MSC的克隆形成能力和迁移能力均较CD200lowhUC-MSC显著增强。　　4.体外T淋巴细胞增殖实验结果显示，CD200highhUC-MSC可显著抑制CD3+T细胞的增殖，同时促炎因子IL-17A的表达亦显著降低。　　5.成功建立小鼠aGvHD模型，CD200highhUC-MSC治疗组小鼠体重恢复较快，生存率升高，Cook评分值降低;HE染色结果表明，CD200highhUC-MSC组小鼠的肺、肝、肛周皮肤以及小肠的病理损伤恢复较CD200lowhUC-MSC组、hUC-MSC组明显增强;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中Th1比例的变化，结果显示，CD200highhUC-MSC可有效抑制小鼠脾脏T淋巴细胞向Th1细胞极化;qPCR检测各组小鼠

关键词： 单酰基甘油脂肪酶抑制药   胃癌细胞   侵袭   迁移   磷脂肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路  

摘要： 目的 探究单酰基甘油脂肪酶（MAGL）抑制药对胃癌细胞侵袭、迁移及磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路的影响。方法 体外培养人胃癌细胞系MKN-45,分为空白组和低、中、高剂量实验组。空白组给予正常DMEM培养基培养，不作任何处理；低、中、高剂量实验组分别用含1,10和20μmol·L-1MAGL抑制药的DMEM培养基进行培养。用噻唑蓝法、划痕实验、Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移、侵袭能力，用蛋白质印迹法检测PI3K/AKT信号通路蛋白的表达情况。结果 中、高剂量实验组和空白组的细胞抑制率分别为（9.12±0.48）%,（23.78±0.65）%和0.00%,侵袭细胞数分别为（221.64±28.66）,（118.58±18.75）和（308.21±36.36）个，划痕愈合率分别为（18.36±2.88）%,（11.03±1.72）%和（27.05±4.10）%,PI3K蛋白相对表达水平分别为0.64±0.05,0.48±0.07和1.18±0.08,p-AKT蛋白相对表达水平分别为0.74±0.06,0.45±0.09和0.97±0.07。中、高剂量实验组的上述指标与空白组比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论 MAGL抑制药可能通过调控PI3K/AKT信号通路，抑制胃癌MKN-45细胞增殖、侵袭及转移。

关键词： miR-485-5p   MFGE8   膀胱癌  

摘要： 背景和目的:膀胱癌(Bladder cancer,BC)是泌尿系统最常见恶性肿瘤之一,近年来发病率逐渐升高。虽然初诊患者中约75%为非肌层浸润性尿路上皮癌,但因其具有高复发特点,且随着膀胱癌的复发,恶性程度逐渐进展。当前膀胱癌综合治疗取得了一定疗效,但对于浸润性、高级别、分期晚的膀胱癌患者预后仍较差,肿瘤特异性死亡率仍较高。目前认为肿瘤相关基因的研究对于肿瘤的诊治非常重要,大部分肿瘤已经有靶向药物用于临床,但膀胱癌目前仍没有非常合适的靶向药物。故对膀胱癌基因靶点的研究亟待加强。目前在恶性肿瘤的研究中,肿瘤的发生被认为与多种基因的异常表达密切相关,抑癌基因和促癌基因在肿瘤的发展中扮演着重要的角色,对肿瘤相关基因的研究已逐渐成为肿瘤治疗领域的前沿。Micro RNA是一种长约22个核苷酸的短链非编码RNA分子,可与信使RNA的3’非翻译区互补结合,通过靶向调节m RNA的翻译和降解来调控基因表达,发挥着抑癌基因或促癌基因的作用。研究显示,miR-485-5p参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭,与肿瘤的发生发展密切相关,并证实其在肿瘤中低表达,发挥抑癌基因作用。但是,miR-485-5p在卡波西肉瘤患者血清和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染细胞中表达升高,对细胞的增殖、迁移等起促进作用。可见miR-485-5p在不同肿瘤中的表达不同,发挥作用不同。目前,miR-485-5p在膀胱癌中的作用及分子机制不明确。研究表明,MFGE8可以增强巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬和清除。MFGE8是否是miR-485-5p的靶基因,是否影响膀胱癌发生、发展,目前暂不明确。本课题研究miR-485-5p对膀胱癌增殖、迁移等生物学行为的影响,证实MFGE8作为miR-485-5p的靶基因之一参与膀胱癌的发生、发展,并阐述其分子机制。方法:1.通过qRT-PCR检测16对膀胱癌及癌旁组织中miR-485-5p的表达水平。2.通过qRT-PCR检测膀胱癌细胞(T24、EJ、J82、5637、UMUC-3)及膀胱上皮永生细胞(SV-HUC-1)中miR-485-5p表达水平,并选取miR-485-5p表达最低的2个膀胱癌细胞系(T24、EJ)进行过表达、选择表达相对较高的2个膀胱癌细胞系(5637、UMUC-3)进行抑制表达以开展后续实验。3.过表达和敲减膀胱癌细胞中miR-485-5p,并检测miR-485-5p表达情况。利用CCK-8实验观察细胞的生长曲线,通过平板克隆实验检测细胞集落形成能力,Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力,并通过Western Blot实验检测与细胞凋亡相关蛋白的表达。4.通过miRBase、Target Scan和miRanda数据库筛选miR-485-5p潜在的靶基因:MFGE8。双荧光素酶实验验证miR-485-5p与MFGE8的靶向关系。过表达和敲减膀胱癌细胞miR-485-5p,WB实验检测MFGE8蛋白水平变化。5.T24及EJ转染MFGE8过表达质粒,5637及UMUC-3转染siMFGE8,WB实验检测MFGE8蛋白水平变化。***-485-5p与MFGE8共转染实验:CCK-8实验观察细胞的生长曲线,通过平板克隆实验检测细胞集落形成能力,Transwell细胞迁移实验来观察细胞的迁移能力,并通过WB实验检测与细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:1.完成16对膀胱癌与癌旁组织miR-485-5p的qRT-PCR检测,发现miR-485-5p在膀胱癌中较相对应的癌旁组织表达明显降低。***-485-5p在膀胱癌细胞系(5637、UMUC-3、J82、EJ、T24)中表达较正常膀胱上皮细胞系(SV-HUC-1)明显降低。3.T24及EJ膀胱癌细胞转染miR-485-5p mimic,膀胱癌细胞miR-485-5p表达量明显升高,进行功能实验发现膀胱癌细胞增殖、迁移能力减弱;5637及U MUC-3膀胱癌细胞转染miR-485-5p inhibitor,miR-485-5p表达明显下降,进行功能实验发现膀胱癌细胞增殖、迁移能力增强。进行WB实验发现转染miR-485-5p mimic的细胞Bcl2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高;转染miR-485-5p inhi bitor的细胞Bcl2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低。4.双荧光素酶实验验证了miR-485-5p与MFGE8的靶向关系,T24及EJ膀胱癌细胞转染miR-485-5p mimic,WB检测MFGE8蛋白水平降低,5637及UMUC-3膀胱癌细胞转染miR-485-5p inhibitor,WB实验检测MFGE8蛋白水平升高。5.T24及EJ细胞转染MFGE8过表达质粒,Western Blot检测MFGE8蛋白水平升高,5637及UMUC-3转染M

关键词： 宫颈癌   E3泛素连接酶   AKT/mTOR通路   生物学功能   肿瘤细胞  

摘要： 研究背景　　宫颈癌是全球女性第四高发的恶性肿瘤，据全球肿瘤流行病学研究报道，每年约有五十七万人新诊断出患宫颈癌，其中约三十一万人因宫颈癌死亡。我国是宫颈癌的高发地之一，每年约新增十一万病例。宫颈癌的发生和发展比较迟缓，往往需要持续10-30年的时间，这给宫颈癌的筛查和防治提供了绝佳的时间窗口。目前治疗手段包括手术和放化疗，在早期宫颈癌中具有一定的疗效，但对晚期和复发性宫颈癌中作用比较有限。因此有必要开发一个新发肿瘤标志物，应用于宫颈癌的诊疗和预后中。Siah2是RINGE3泛素连接酶家族的主要成员，在DNA损伤调节、缺氧适应、凋亡、血管生成和细胞增殖等中发挥关键作用。Siah2可以单独或与其他蛋白质结合作为E3泛素连接酶发挥作用。它靶向调控多种蛋白底物以供泛素-蛋白酶体系统（UPS）降解，从而对许多细胞途径起调节作用。UPS紊乱会导致底物蛋白质水平异常，从而导致癌症发生。已知Siah2在多种肿瘤中表达上调并具有临床价值。本课题通过构建siah2敲低和过表达模型以及组织芯片染色，探究siah2在宫颈癌中表达情况及机制探讨。　　目的Siah2作为一种E3泛素连接酶，在多种恶性肿瘤中发挥促癌功能，但对其在宫颈癌中的作用研究的较少。本课题旨在探究siah2在宫颈癌中的表达情况及临床价值、对宫颈癌细胞系生物学功能的影响以及作用机制探讨。　　方法1.通过RNA干扰技术，敲低siah2在宫颈癌细胞Siha、C33a中的表达。2通过CCK-8、伤口愈合、平板克隆和Transwell实验，研究siah2对宫颈癌细胞生物学功能的影响。3.通过质粒转染使siah2过表达后进行免疫沉淀实验，检测GSK3β是否作为siah2的泛素化底物。4.在siah2过表达细胞中转染GSK3β过表达质粒，通过CCK-8、伤口愈合、平板克隆和Transwell实验研究其促癌作用。5.对宫颈癌患者的宫颈组织芯片进行免疫组化染色并积分，研究siah2表达与临床病理学参数的关系。　　结果***2敲低后宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力受到抑制。***2敲低后细胞凋亡蛋白Caspase3、Bax和Caspase9的表达水平显著增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著受抑，细胞的凋亡水平增加。***2敲低后N-cadherin、Vimentin和Snail1的表达水平显著受抑，E-cadherin表达水平显著增加，细胞上皮间充质转化(EMT)过程发生逆转。***2敲低后p-AKT和p-mTOR表达水平显著下降，说明siah2可能通过AKT信号通路参与细胞增殖和凋亡的调节。***2过表达显著促进了GSK3β的泛素化，证明siah2可以泛素化降解GSK3β。***3β可以拯救由siah2过表达引起的细胞增殖和侵袭增加，进一步证明了GSK3β为siah2的泛素化靶标。***2蛋白在siah2在宫颈炎、上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌患者中表达逐渐增加，且siah2表达程度与宫颈癌分化程度有关，与患者的年龄、肿瘤直径、浸润深度、是否淋巴结转移无关。　　结论***2/GSK3β轴的下调可能通过抑制AKT/mTOR通路和逆转EMT进程来抑制宫颈癌细胞的生物学功能。***2宫颈癌患者组织中表达显著增加，且与肿瘤分化程度有关，可作为宫颈癌诊断的潜在蛋白标记物。

关键词： Musculin   骨髓来源树突状细胞   生物学功能   冲击伤  

摘要： 在近年来的局部战争和恐怖袭击中,爆炸冲击伤始终是最常见的致伤类型之一。冲击伤是冲击波的超压和负压引起的损伤,主要造成含气器官如肺、听器和胃肠道的损害。随着新一代高爆炸力武器的逐步升级和各种爆炸性武器的大量使用,短时间内会产生大量不同伤情的冲击伤伤员,从而给战创伤救治提出了更严峻的挑战。开展冲击伤防治研究,对于减少作战人员伤亡,有效控制并发症发生,提升临床救治效能具有重要的军事医学价值。过度炎症反应和免疫功能紊乱是严重战创伤并发症发生过程中的重要事件,既是引起组织和器官损伤的前提,也是导致严重战创伤患者死亡和不良预后的重要原因。迄今为止,针对免疫细胞开展的免疫治疗和调理仍是临床上治疗严重战创伤并发症的有效手段之一。然而,目前针对其功能调控因素的研究仍很有限,尤其是充当机体免疫反应源头、在固有免疫和适应性免疫中发挥“桥梁”作用的树突状细胞(dendritic cell,DC)。因此,系统挖掘调控机体免疫细胞的关键分子,探讨其在严重战创伤介导免疫紊乱中的分子机制,将有效延缓甚至阻止严重战创伤并发症的发生和转归,为免疫细胞治疗严重创伤并发症的完善和优化提供新策略。 DC广泛分布于上皮组织及除脑以外的实质性脏器的间质,是体内最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)。作为免疫反应的启动者,DC在免疫激活和免疫耐受免疫诱导中具有独特的地位。研究表明,严重创伤后DC发生失能,直接影响辅助性T细胞(help T cell,Th)分化结局,是引发机体免疫失衡,进而导致严重创伤并发症的重要原因。因此,内源性和外源性干预正逐渐成为DC救治严重创伤的有效手段,这更加凸显了发掘调控DC生物学功能关键因子的重要性和紧迫性。 Musculin是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋结构的新型转录因子,可与多种蛋白相互作用。最初对Musculin功能的研究多局限在哺乳动物骨骼肌发生、组织发育、分化和再生领域。后续研究发现,Musculin在脾、胸腺和淋巴结等免疫器官和B细胞中也有表达,并参与调控T细胞亚群的分化。本团队前期研究结果也显示,Musculin不但直接介导炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)中的组织损伤和炎症反应,还参与天然淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)亚群的功能调控。上述研究表明,Musculin对免疫细胞生物学功能的调控正日益受到关注和确认。然而,目前尚未见Musculin调控DC生物学功能的研究报道。 基于BMDC获取方法成熟,得率高,能够替代因严重创伤而遭破坏DC的特点,本研究选择BMDC为目的细胞,以C57BL/6野生型(wildtype,WT,+/+)和Musculin敲除(knockout,KO,-/-)小鼠为实验动物,通过体内、外研究模式,采用实验动物学、病理学、免疫学、分子和细胞生物学等实验技术,阐明Musculin对BMDC生物学功能的调控特点以及在严重冲击伤预后中的作用规律,为发掘改善严重创伤并发症病理进程的关键分子和新策略提供理论基础和新思路。 本研究结果表明,在BMDC体外诱导过程中,Musculin对BMDC增殖分化中的形态和表型没有明显作用,但能够增强共刺激、共抑制和MHC分子的表达,减弱促异源淋巴细胞增殖能力,并抑制BMDC分泌炎性因子的水平,提示Musculin参与了对BMDC生物学功能特别是抗原递呈和炎症反应的调控。同时,以小鼠生存率为标准,选择不同驱动段压强进行小鼠冲击致伤实验,确定小鼠发生严重冲击伤的驱动段压强为5.4兆帕(megapascals,MPa)。以上述选择的驱动段压强制备小鼠严重冲击伤模型,探讨严重冲击伤后Musculin对BMDC生物学特征的影响,并通过尾静脉输注方式将WT和Musculin-/-小鼠BMDC过继转移入严重冲击伤Musculin-/-小鼠体内,观察严重冲击伤后小鼠生存率、重要脏器功能及靶器官肺功能损伤,分析Musculin缺失的BMDC输入能否影响严重冲击伤后机体的免疫学功能及小鼠预后。结果证明,严重冲击伤后,Musculin对BMDC生物学调控作用主要表现在降低其表面分子表达,减弱促异源淋巴细胞增殖和细胞因子分泌能力,并随着时间的推移,这种差异更显著。同时,Musculin能够改善严重冲击伤后小鼠机体预后,主要表现在能够降低小鼠严重冲击伤死亡率,减轻其肺部损伤和炎症水平以及对小鼠心脏、肝脏和肾脏等重要脏器的保护。 本研究揭示了Musculin对BMDC生物学功能的调控作用,进一步拓展和深化了Musculin和免疫细胞关系研究,为后续Musculin调控机体免疫功能和炎症反应的分子机制探索及免疫细胞治疗干预的医学实践奠定基础。同时,建立可复制的小鼠严重冲击伤模型,探讨Musc