细胞生物学-文献订阅-三峡大学图书馆

宋帼

辽宁医学院

摘要： 目的探讨人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells，PDLC）经神经生长因子（nerve growth factor， NGF）基因转染后对其生物学性状的影响进行分析，为其能够成为牙周组织再生的种子细胞奠定基础。方法本文通过脂质体转染法采用pcDNA3.1载体将神经生长因子转入牙周膜细胞中，并通过免疫荧光法及免疫印记实验（Western blot）证明其在细胞中的表达。然后对通过MTT、ALP方法对其进行生物学性状的分析，统计学分析采用SPSS13.0软件包进行方差分析。结果 1.通过免疫荧光观察转染NGF的PDLC的胞浆中呈深红色，未转染的胞浆呈浅红色。 2.免疫印记法对表达产物的鉴定转染细胞，转染空质粒的细胞和未转染细胞均在13KD出现一条特异性条带，未转染和转染空质粒的细胞条带窄色浅，转染NGF组颜色深条带宽。 ***显示，前3天细胞无明显增殖变化，从第4天开始直至第7天转染NGF的PDLCs组与另两组细胞比较增殖明显（p<0.01），而另两组无明显变化（p>0.01），差异无统计学意义。 4. ALP含量显示转染NGF组PDLC与其余两组相比有增高趋势。结论牙周膜成纤维细胞经NGF因子基因转染后可促进细胞碱性磷酸酶活性增强，且MTT检测其细胞增殖能力明显提高。本研究将NGF基因转染体外培养PDLC，有望获得功能增强的种子细胞，为探索基因治疗和组织工程相结合在牙周组织缺损修复中的应用提供理论依据。

WT1基因表达对白血病细胞生物学特征的影响及相关机制研究

李晓燕

北京协和医学院中国医学科学院北京协和医学院清华大学医学部中国医学科学院

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关键词： 白血病 WT1基因生物学特征单克隆细胞信号途径

摘要： 研究目的：在不表达WT1基因的U937细胞中转导WT1基因，观察U937细胞增殖、凋亡、周期、对药物的反应性及细胞迁移能力等生物学特性的改变，进一步探究WT1基因在白血病中的作用及相关机制。<br>　　研究方法：采用PCR方法从质粒载体pCMV-CB6-WT1-B(+17aa/-KTS)、pCMV-CB6-WT1-D（+17aa/+KTS）扩增目的片段WT1-B(+17aa/-KTS)和WT1-D(+17aa/+KTS)，连接到pCDHI-MCS1-EF1-copGFP慢病毒载体上，采用磷酸钙共沉淀法转染293T细胞，包装病毒，感染U937细胞，流式分选GFP阳性细胞，筛选出稳定表达WT1基因的单克隆细胞，RT-PCR及western blot方法鉴定WT1基因及蛋白的表达，随后检测转导WT1基因后U937细胞生物学特性的改变。采用MTT方法检测细胞的增殖活性和姜黄素对单克隆细胞的抑制率。采用流式细胞技术检测单克隆细胞加入姜黄素后细胞周期和凋亡的改变。采用甲基纤维素半固体培养基观察各单克隆细胞集落形成能力的差别。应用Transwell迁移实验观察各单克隆细胞迁移能力的差别。同时采用基因表达谱芯片检测分析WT1表达引起功能相关的基因改变和涉及的信号通路，并用定量RT-PCR验证基因表达的可信性。<br>　　结果：WT1(-KTS)和WT1(+KTS)没有明显改变U937细胞的增殖活性(p＞0.05)，但降低了对姜黄素的敏感性、能对抗姜黄素引起的U937细胞凋亡（p均＜0.05）。WT1(-KTS)还提高了U937细胞的集落形成能力(p＜0.01)和迁移能力(p＜0.01)，而WT1(+KTS)则未明显改变U937细胞的集落形成能力和迁移能力（p均＞0.05）。虽然WT1(-KTS)和WT1(+KTS)没有明显改变细胞周期，但加姜黄素处理后，空载体与转导WT1细胞的周期改变有显著性差异(p＜0.05)。基因芯片分析结果显示，WT1(-KTS)引起的显著性差异基因涉及细胞增殖、凋亡、粘附迁移、细胞周期调节等功能，差异基因参与的信号转导通路主要有JAK-STAT途径、趋化因子信号途径、MAPK信号途径、mTOR信号途径、ErbB信号途径等。而WT1(+KTS)引起的显著性差异基因则明显少于WT1(-KTS)，主要涉及细胞生长、凋亡、代谢过程等。<br>　　结论：不同的WT1异构体在白血病发生中的作用不全相同。WT1(-KTS)抑制U937细胞凋亡，降低U937细胞对化疗药物的敏感性，促进细胞迁移及集落形成，可能与激活JAK-STAT途径、趋化因子信号途径、MAPK信号途径、mTOR信号途径等有关。WT1(+KTS)对靶基因的转录调节活性可能弱于WT1（-KTS），仅表现出抗凋亡和降低对药物敏感性的作用。

二氯乙酸钠对人胰腺癌PANC1细胞生物学特性的影响及其机制的研究

王玉鹏

苏州大学

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关键词： 胰腺癌有氧糖酵解二氯乙酸钠线粒体膜电位凋亡基因

摘要： 目的研究二氯乙酸钠（Dichloroacetate, DCA）对人胰腺癌PANC1细胞增殖及凋亡的影响，并对其机制进行初步探讨。方法体外培养人胰腺癌PANC1细胞；MTT法检测DCA对胰腺癌细胞增殖的影响；Hoechst33342染色荧光显微镜下观察DCA作用后胰腺癌细胞的形态变化；培养基中乳酸含量的检测；流式细胞仪检测DCA对胰腺癌细胞早期凋亡的影响；罗丹明123和碘化丙啶进行线粒体膜电位的检测；RT-PCR测定DCA作用后PUMA、BCL-2、Survivin基因的表达；运用SPSS17.0软件进行统计分析。结果①MTT检测显示：DCA对胰腺癌PANC1细胞的增殖抑制作用是具有时间和浓度依赖性的。10mmol/L以下浓度组的DCA作用24h并未观测到明显的抑制作用，P>0.05；当作用时间延长至48h，5mmol/L浓度组DCA的增殖抑制作用开始显现，P<0.05；DCA作用48h和72h对细胞的增殖抑制作用并无显著差异，P>0.05；5mmol/L-40mmol/L浓度的DCA对细胞的抑制作用具有浓度依赖性；②DCA作用后镜下可见细胞核浓聚或碎裂的特征性表现，证实了细胞凋亡的存在；③5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L的DCA作用48h后培养基乳酸的相对含量分别为（89.84±2.35）%、（83.04±2.37）%、（76.84±2.74）%，说明DCA可以浓度依赖性的减少乳酸的含量，从侧面证明丙酮酸进入三羧酸循环的量增加了；④FCM检测显示DCA促进了细胞的凋亡，并呈浓度依赖性，由低浓度到高浓度细胞的凋亡率分别为（5.18±1.03）%、（11.94±1.78）%、（20.04±1.97）%；与对照组（1.06±0.27）%的凋亡率相比具有明显差异，P<0.05；⑤PANC1细胞的MMP在DCA作用后明显降低，分别以5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L的DCA作用PANC1细胞24h后相应的较弱荧光组细胞所占的比例分别为（9.03±1.04）%、（19.33±0.78）%、（28.51±0.57）%，较对照组的（3.06±0.24）%明显升高，P<0.05；以RH123-/PI-细胞所占比例的变化表示MMP的变化趋势，24h组和48h组并无明显差异，P>0.05；⑥DCA作用48h后PUMA基因表达增加，BCL-2和Survivin基因的表达下降，P<0.05。结论二氯乙酸钠对胰腺癌PANC1细胞的增殖具有抑制作用；胰腺癌细胞的凋亡也受到了DCA的诱导；DCA作用机制涉及MMP的降低、PUMA基因表达的增强以及BCL-2和Survivin基因表达减弱。

人羊水间充质干细胞生物学特征及其体外向内皮细胞诱导分化的研究

王一茹

中国人民解放军医学院

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关键词： 间充质干细胞羊水细胞增殖细胞分化内皮细胞分化低氧

摘要： 目的体外分离培养人羊水间充质干细胞（HAFMSCs, human amniotic fluid mesenchymal stem cells）,观察其生物学特性。低温冻存HAFMSCs三个月,观察冻存后细胞的生物学特性,找出最佳的冻存方案。体外诱导HAFMSCs向内皮细胞分化,分别在常氧及低氧环境下观察其分化为内皮细胞的能力。方法采用四种方法分离培养HAFMSCs,用MTT法观察各组细胞的增殖能力。流式细胞技术（FACS）检测各组细胞表面抗原CD29, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, HLA-ABC, HLA-DR等的表达。比较各组细胞成脂、成骨的分化能力,及检测各组细胞中OCT-4, Nanog等mRNA表达水平。用不同成分的冻存液冻存HAFMSCs,冻存三个月后复苏细胞,并分析其存活率、生物学特性及分化能力。体外采用VEGF和bFGF联合诱导HAFMSCs向内皮细胞分化,FACS分析细胞vWF、CD31及CD133mRNA的表达水平,采用细胞免疫荧光的方法鉴定诱导分化后细胞vWF的表达情况,观察诱导后细胞在Matrigel上形成毛细血管样结构的能力。比较低氧环境与常氧环境下上述指标的差异。结果四种不同的培养方法均培养出HAFMSCs。其中Chang培养基两步培养法培养的细胞,其贴壁时间、细胞集落形成时间及细胞传代时间较其余三组更短,培养1.5天即有细胞贴壁,4-5天可见细胞集落形成,细胞增殖快。四组细胞均表达间充质干细胞标记物CD29、CD44、CD73、CD90,而不表达造血干细胞标记物CD34、CD45,符合间充质干细胞的特征,各组之间无明显差异。四组细胞成骨、成脂诱导成功,并分别通过油红O染色及von Kossa染色证实。四组细胞中均检测到OCT-4, Nanog mRNA的表达。冻存三个月后的HAFMSCs,以冻存液方案为DMEM:FBS:DMSO=5:4:1勺细胞存活率最高,细胞增殖能力最强。而复苏后细胞的生长曲线、细胞表型、分化能力及OCT-4, Nanog6勺表达与冻存前细胞相比无统计学差异。HAFMSCs体外诱导分化为内皮细胞,流式细胞技术分析比较各组诱导后细胞中vWF, CD31,CD133等内皮相关标记物抗原的水平,以VEGF和bFGF联合诱导组诱导效率最高,Mtrigel上形成毛细血管结构的能力也最强。低氧环境下经VEGF和bFGF联合诱组HAFMSCs内VEGF, v WF和CD31mRNA水平高于其余组，毛细血结构能力也明显强于其余组。结论HAFMSCs具有易获、体外增殖快、多向分化能力等优势。Chang培基两步培法能够在较短时间内培大量HAFMSCs。短期冻存HAFMSCs对于其生物学特无明显影，最佳冻存配方为DMEM:FBS:DMSO=5:4:1。VEGF和bFGF联合诱较为理体外诱HAFMSCs分化为内皮细胞诱方案。低氧能够促进这过程，在短期低氧环境下，HAFMSCs诱分化为内皮细胞能力与暴于低氧环境时间关。

S100A6在卵巢子宫内膜异位症在位内膜间质细胞中的表达及其与该细胞生物学特性的相关性研究

高菊梅

南昌大学

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关键词： 卵巢子宫内膜异位症间质细胞增殖凋亡侵袭 S100A6

摘要： 目的：检测钙周期蛋白（S100A6）在卵巢子宫内膜异位症（OEMs）在位子宫内膜间质细胞中的表达情况，以及该细胞的增殖、凋亡、侵袭能力，并分析S100A6表达水平与该细胞生物学行为的相关性，从而探讨S100A6与OEMs发生发展的关系。方法：体外培养并鉴定32例OEMs和32例卵巢良性畸胎瘤的在位子宫内膜间质细胞，应用MTT法、流式细胞仪、transwell法分别检测该细胞的增殖、凋亡和侵袭能力，并应用实时定量RT-PCR检测该细胞中S100A6mRNA的表达情况。结果：在位子宫内膜间质细胞体外培养成功，细胞鉴定纯度达90%以上。OEMs组0时的光密度值（OD值）为（0.127±0.013），对照组为（0.129±0.008），两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；OEMs组24时增长的OD值为（0.148±0.020），对照组为（0.048±0.008），两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；OEMs组48时增长的OD值为（0.397±0.029），对照组为（0.119±0.022），两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。OEMs组在位子宫内膜间质细胞凋亡率为（26.430±3.789）%，对照组为（35.571±4.485）%，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。OEMs组在位子宫内膜间质细胞穿过小室后的OD值为（0.950±0.014），对照组为（0.653±0.028），两组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。OEMs组与对照组中S100A6mRNA均有表达，OEMs组S100A6mRNA的相对表达量为（2.908±1.413），对照组为（0.985±0.742），两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。OEMs组S100A6mRNA的相对表达量与细胞的增殖、凋亡、侵袭能力的相关系数r分别为0.947（P<0.01）、-0.939（P<0.01）、0.967（P<0.01）；对照组S100A6mRNA的相对表达量与细胞的增殖、凋亡、侵袭能力的相关系数r分别为0.820（P<0.01）、-0.800（P<0.01）、0.904（P<0.01）。结论： OEMs患者的在位子宫内膜间质细胞的增殖能力、侵袭能力及S100A6mRNA的表达水平均高于对照组，凋亡能力低于对照组，OEMs组和对照组S100A6mRNA表达与细胞增殖、侵袭能力均呈正相关，与凋亡能力呈负相关。S100A6mRNA的高表达可能与OEMs在位子宫内膜间质细胞异常的生物学特性密切相关，并在OEMs的发生发展中起重要作用。

Pokemon与miR-203对人神经胶质瘤U251细胞生物学特性的影响及机理研究

杨红伟

南华大学

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关键词： Pokemon MicroRNA203 Survivin 神经胶质瘤生物学特性

摘要： 背景：红系髓性致癌因子pokemon (POK erythroid myeloid ontogenic factor)是POK蛋白家族中的新成员，位于许多肿瘤原癌基因和抑癌基因的上游，在癌基因转化过程中起关键性作用;MicroRNA203（miR-203）是近几年来发现的又一个非编码小RNA，像其它的microRNAs一样，能够与靶基因mRNA的3’UTR结合来影响其稳定性或直接降解，从而抑制靶基因的翻译过程。Survivin则是IAP (inhibitor of apoptosis)家族中最小的成员，在大多数肿瘤和胚胎中都明显表达，而在正常分化的细胞中几乎无表达，它可以通过影响肿瘤细胞周期和caspase-3、caspase-7活性来促进增殖。本研究主要探讨了原癌基因pokemon与miR-203对胶质瘤U251细胞生物学特性的影响，并且阐明了它们对surivivn基因表达的调控机制。目的：观察原癌基因pokemon与miR-203对胶质瘤U251细胞生物学特性的影响;探讨pokemon和miR-203在胶质瘤细胞中对survivin表达的调控机制。方法：通过脂质体转染方法将si-pokemon RNA，pokemon表达质粒和miR-203表达质粒分别导入胶质瘤U251细胞后，应用细胞生长曲线、克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术评价细胞生长、增殖和凋亡等生物学特性的变化及对TRAIL和塞来昔布的敏感性，通过Real-time PCR和Western blot方法检测surivivin在mRNA和蛋白水平的变化，采用双荧光素酶分析技术和ChIP实验(Chromatin immunoprecipitation assay)进行功能性验证和机理研究。结果： 1.胶质瘤U251细胞与胶质瘤组织中pokemon和survivin的表达水平明显高于正常胶质HEB细胞和正常脑组织。转染si-pokemon RNA后，胶质瘤U251细胞的生长明显减慢（P<0.05），增殖能力减弱（P<0.05），对TRAIL和塞来昔布的敏感性增加，Real-timePCR与Western blot结果显示pokemon与survivin的mRNA水平和蛋白水平协同降低（P<0.05）;反之，转染pokemon表达质粒后，pokemon与survivin的mRNA水平和蛋白水平协同升高（P<0.05）。双荧光素酶报告基因检测和ChIP实验结果证实pokemon与survivin启动子结合并激活其活性。 2.胶质瘤U251细胞中miR-203的表达水平明显低于正常胶质HEB细胞。TargetScan预测结果发现survivin为miR-203的靶基因;转染miR-203的模拟物或表达质粒后，Real-time PCR与Western blot结果分别提示survivin的mRNA水平和蛋白水平下调（P<0.05）;双荧光素酶报告分析技术证实抗凋亡基因survivin为miR-203的直接靶点;细胞生长曲线结果显示miR-203组的生长速度明显受抑（P<0.05）;MTT实验表明miR-203组的增殖能力减弱（P<0.05）及药物敏感性增加;流式细胞术结果示miR-203组的凋亡比例明显升高（P<0.01）。结论：原癌基因pokemon能促进胶质瘤U251细胞的生长和增殖，减弱其对TRAIL和塞来昔布的敏感性;相反，miR-203则使胶质瘤U251细胞表现出相反的生物学特性，是一个抗增殖、促凋亡的miRNA，其机理可能通过调控survivin的表达来实现，这为探索胶质瘤的发病机理和生物学治疗提供一条新思路。

分子细胞生物学

韩贻仁

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