关键词：
糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D
糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白质
前列腺干细胞抗原
前列腺癌
PC-3细胞
摘要：
目的
初步研究GPI-PLD基因过表达对前列腺癌PC-3细胞株GPI-PLD酶活性的影响,探讨GPI-PLD释放前列腺干细胞抗原(PSCA)后前列腺癌PC-3细胞株生物学功能的改变,进一步探讨PSCA的生物学功能和在前列腺癌发病过程中的作用与地位,为运用GPI-PLD基因
治疗前列腺癌等肿瘤性疾病打下坚实基础。
方法
1.收集26例正常人外周血血清和18例前列腺癌患者外周血血清,测定其GPI-PLD酶活性。
2.采用梭华-Sofast阳离子聚合物将本实验室已经构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPI-PLD转入前列腺癌PC-3细胞,以转染空载体的pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组、未转染的PC-3细胞组为对照,800ug/mLG418筛选出稳定表达的阳性细胞克隆。
3.逆转录酶-PCR(RT-PCR)检测转染前后细胞内GPI-PLD mRNA水平。利用本实验室自制的具有完整GPI结构的胎盘型碱性磷酸酶(placental-type alkaline phosphatase, PLAP)作为底物,定量检测稳定转染前后细胞内GPI-PLD酶活性。ELISA法检测各组细胞PSCA的释放情况,流式细胞术检测细胞表面GPI锚定的PSCA表达水平以及细胞周期和凋亡率,细胞计数法测定细胞生长曲线。
结果
1.前列腺癌患者和正常人对照组外周血血清GPI-PLD酶活性(转化底物PLAP的百分率)分别为29.79%±4.13%和38.27%±5.73%,前列腺癌患者比正常人对照组的GPI-PLD酶活性明显下降,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。
2. RT-PCR结果和GPI-PLD酶活性测定结果表明,稳定高表达GPI-PLD的前列腺癌PC-3细胞系已经建立。①经G418筛选后,稳定转染GPI-PLD的PC-3细胞组GPI-PLD mRNA相对表达量较转染pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组明显增高,GPI-PLD mRNA表达水平(相对灰度值,IA比值)分别为0.976±0.041、0.549±0.032和0.522±0.047,差异有显著统计学意义(P<0.01)。②相比转染pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组,稳定转染GPI-PLD的PC-3细胞中GPI-PLD酶活性明显增高,差异有显著统计学意义(P<0.01),转染GPI-PLD的PC-3细胞组中GPI-PLD酶活性(转化底物PLAP的百分率)达到24.47%±6.89%,转染pcDNA3.1(+)的PC-3细胞组和未转染的PC-3细胞组GPI-PLD酶活性(%)相对较低,分别为11.63%±6.04%和10.10%±5.38%。
***法检测细胞培养基上清中释放的PSCA浓度结果显示,转染GPI-PLD的PC-3细胞组培养基上清中PSCA浓度为146.96±3.32pg/mL,转染pcDNA3.1(+)组和未转染组这一值分别为90.66±3.19pg/mL和89.24±1.77pg/mL,差异有显著统计学意义(P<0.01)。
4.流式细胞术检测细胞表面GPI锚定蛋白质PSCA水平结果显示,相比pcDNA3.1(+)/PC-3细胞组和PC-3细胞组,pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组的平均荧光强度显著降低,有显著性统计学意义(P<0.01)。GPI-PLD转染组平均荧光强度为59.79±0.92,而其他两对照组分别为85.63±1.30和85.97±1.23。
5.流式细胞术检测细胞周期结果显示,相比pcDNA3.1(+)/PC-3细胞组和PC-3细胞组,pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组的G0-G1显著上升,S期显著下降,G2期略有下降,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞计数和细胞生长曲线表明,pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组生长速度较pcDNA3.1(+)/PC-3细胞组和PC-3细胞组明显减慢。凋亡结果显示,pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3细胞组相对于其他两个组,凋亡值显著上升,差异有显著统计学意义(P<0.01)。
结论
1.前列腺癌患者较正常人的外周血血清GPI-PLD酶活性显著降低,提示前列腺癌患者GPI-PLD基因表达下调。
2.成功构建GPI-PLD基因稳定过表达的前列腺癌PC-3细胞株。
3. GPI-PLD基因过表达能成功释放PC-3细胞膜上GPI锚定蛋白质PSCA,使细胞培养基上清中的失GPI锚定PSCA增加,降低膜表面GPI锚定PSCA的水平。
4. GPI-PLD基因过表达可引起前列腺癌PC-3细胞株细
欢迎来到三峡大学图书馆！
