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关键词： HepG2细胞   人谷氨酰胺合成酶(hGS)   人精氨酸酶I(hArgI)   人鸟氨酸转氨甲酰酶(hOTC)   氨   尿素循环  

摘要： 目的：HepG2是一株永生化的人肝癌细胞株，已被用于生物人工肝系统的研究。然而，降氨毒能力的不充分限制了它的进一步应用，原因是HepG2细胞中两条氨代谢通路的谷氨酰胺合成酶(hGS)、精氨酸酶I(hArgI)和鸟氨酸转氨酶(hOTC)表达低下或缺失。在前期构建的过表达hArgI和hOTC的HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的基础上，本研究采用携带hGS的重组逆转录病毒感染HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的方法，试图恢复HepG2细胞的氨代谢双通路。 方法：将携带空载体pLNCX和逆转录病毒载体pLNAFhGS的重组逆转录病毒液分别感染HepG2/con （已转双基因空载体的HepG2细胞）细胞和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞（前期构建）；应用抗生素G418筛选抗性细胞克隆并扩增培养，将得到的抗性细胞克隆分别命名为HepG2/Mock和HepG2/hArgI+hOTC+AFhGS细胞。用RT-PCR和Western-blot法验证目的基因的表达；CCK-8法检测抗性细胞株的耐氨能力和增殖能力；生物化学法检测hArgI和hOTC酶活力和尿素合成量；商品化试剂盒检测谷氨酰胺产量； Western-blot法检测人精氨酸酶I(hArgI)、人鸟氨酸转氨甲酰酶(hOTC)、人氨基甲酰磷酸合成酶I(hCPSI)、人精氨酸酶代琥珀酸合成酶(hASS)、人精氨酸代琥珀酸裂解酶(hASL)和人精氨酸酶II(hArgII)的蛋白表达水平，最终评估各参与实验的细胞耐氨和解氨能力。另外，还通过基因芯片分析导入的基因对89种细胞周期相关基因的表达情况的影响。 结果：hGS成功导入HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞。各种重组HepG2细胞的耐氨能力、在高浓度氨环境下的尿素生成量和谷氨酰胺生成量均高于HepG2和HepG2/Mock（P<0.05），其中HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的功能最强。hGS的导入对尿素代谢通路的影响以hArgI的表达和酶活力最为明显，仅在HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞表达增强， OTC的表达和酶活力在HepG2/(hArgI+hOTC)4和HepG2/(hArgI+hOTC+AFhGS)1细胞的表达增强，而尿素循环另外三个关键酶之一的ASL表达在HepG2/AFhGS和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞增强，其余基因变化无明显差异。另外，hGS的导入一定程度上促进hArgII的表达。HepG2/AFhGS细胞增殖在第5和7天时落后于其它细胞（P<0.05），而其他细胞株的增殖能力与HepG2比较没有显著差异（P>0.05）；HepG2/AFhGS和HepG2/(hArgI+hOTC+AFhGS)1细胞生物合成功能没有发生显著性改变（P>0.05）只有HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的白蛋白合成增多；基因芯片结果可看出HepG2/AFhGS细胞CDC16、HERC5基因表达上调、BCL2基因表达显著下调；HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞除CDC16表达上调外，其余基因表达无明显改变。 结论：通过比较，建立的HepG2/(hArgI+hOTC+AFhGS)1细胞株在体外培养的降氨能力不如HepG2/AFhGS和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞，且导入的hGS会抑制先导入HepG2细胞中的hArgI的表达；HepG2/AFhGS细胞因抗凋亡基因BCL2的表达明显下调而影响增殖，因此，我们将选择HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞作为下一步动物实验的细胞株。

关键词： 微流控芯片   细胞生物学   细胞迁移   水流动力学   免疫酶联分析   微环境控制  

摘要： 微流控芯片技术是一种用来处理和控制微量液体的科学技术系统,它可以集成管道、微阀、混合器、泵等多种多功能元器件从而实现芯片上的样品进样、预处理、传输、检测等多种功能,从而实现对多种生物实验的微尺度检测。微流控芯片系统减少了样品和试剂的消耗、缩短了实验反应时间、准确性高、携带方便且能够实现原位实时检测。经过多年的科研发展,微流控芯片技术已经成为目前比较前沿的新兴交叉科研领域,其独特优势使其能够以独特的方法解决很多目前大尺度生物实验难以实现的问题,从而为生物学研究提供极大的便利。本文在前人工作的基础上,开发了多款用于研究单细胞长期培养、肿瘤细胞一内皮细胞共培养、细胞迁移、水流动力学对内皮细胞力刺激的影响、免疫酶联反应等领域的集成微流控芯片,这些芯片设计构思新颖,从根本上解决了所研究领域目前存在的科研问题,主要内容如下:　　1.用于研究单细胞长期培养的集成微流控芯片　　在本章中我们设计并制备了一种集成微流控芯片用于长期培养单细胞,通过集成在芯片装置上的压力阀可以精确地控制单细胞定位到不同的培养小室中进行分隔培养,避免了细胞之间直接接触的相互作用。通过优化培养液的换液频率及引入条件培养基等培养方法,实现单细胞在微流控芯片上长达四天的正常培养。我们将数百个细胞培养在芯片上的一个独立培养小室中,并将其生成的条件培养基持续提供给与之连通的单细胞培养小室中的单个细胞,这种方法明显地改善了单细胞的生长状态,产生了一个更合适于原位监测单细胞独立生长的微环境。这种可长期培养单细胞的微流控芯片能够扩展到更高的通量水平,用于进一步满足药物筛选及干细胞培养等领域的需求。　　2.用于定量研究肿瘤细胞一内皮细胞共培养过程中动态相互作用的集成微流控共培养芯片　　在本章中我们制备了一款微流控芯片对人宫颈癌细胞(Hela)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养过程中的相互作用进行单细胞水平的定量化的动态研究,以探索这种相互作用在肿瘤转移和血管生成过程中的功能。通过定量化分析自动化成像系统拍摄到的每个培养小室的时间序列相差图片,我们观察到在共培养过程中HUVEC细胞伴随Hela细胞接近出现了撤退行为,这精确验证了共培养体系中两种细胞通过可溶性细胞因子存在着相互作用,通过改变细胞培养过程中的培养液更换频率,进一步证实了这种旁分泌机制的存在。这种微流控芯片技术高度可控,避免了对细胞的污染,全自动化而且成本较为低廉,对细胞一细胞之间的相互作用进行了定量化的动态研究,并对细胞培养的微环境在时间空间上进行精确调控。　　3.集成微流控芯片装置应用于高通量细胞迁移的研究　　在本章中我们设计并制备了一款微流控芯片,能够精确地生成均一的“伤痕”区域来研究细胞迁移的运动能力,确保细胞在微环境中的迁移行为有较好的平行性。通过分析实时拍摄的细胞迁移过程中的相差显微图像,在几个小时内就能得到一个简单的参数定量描述细胞迁移的速度,而如此短的实验时间也减少了细胞迁移过程中细胞增殖行为对其的影响。通过结合自动化图像分析平台和基于模型的数值模拟结果,我们动态准确可靠地测量了原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在各种条件下的细胞迁移,检验了基因HDAC7和其他基因的沉默对内皮细胞的影响,验证了这种方法在细胞生物物理学领域及高通量筛选中的应用。　　4.集成微流控芯片装置应用于水流动力学对内皮细胞基因表达调控的研究　　动脉粥样硬化是造成心血管疾病的主要诱因,主要发生在血管的分叉和弯曲的位点,这些区域的液体流动比较混乱。目前已经研发了若干种装置用于研究水流动力学中力刺激对内皮细胞的影响,以模拟人血管内血液流动对细胞的作用,但是它们需要消耗大量细胞和试剂,实验花费较高。在前人工作的基础上,我们制备了一种集成微流控芯片用于研究剪切力对内皮细胞的作用,该芯片集成了芯片上的蠕动泵以实现培养液在封闭管道内循环的持续流动。对受剪切力刺激的细胞样品进行实时定量PCR及高通量测序的检测,我们找到若干待研究的与剪切力相关的基因、可变剪切、非编码长链RNA等未被报道的生物学相关结果,我们认为这些结果能够帮助人们更清楚地理解动脉粥样硬化的发生。　　5.集成微流控芯片装置应用于高通量免疫酶联反应的研究　　酶联免疫吸附反应(ELISA)是一种用于研究生化分析和诊断检测的重要技术,传统的免疫酶联吸附反应多在孔板上完成,试剂消耗量大且花费时间长。虽然许多基于微流控芯片的检测技术被研发来检测免疫酶联反应,但是生成一种集成的微流控芯片来快速、精确、高效、低背景地检验ELISA反应仍旧是一个迫切需求。我们在前人工作的基础上设计并制备了一种集成微流控免疫分析芯片来实现芯片上的高通量三明治夹心法免疫酶联检测。这款芯片通过集成力学纽扣阀到芯片上生成了若干图案化反应位点,只需要1μL的反应溶液即可在一个小时内完成整个ELISA检测,检测极限可以达到10

关键词： 肺癌   细胞生物学   分子机制   分泌蛋白   流式细胞术  

摘要： 肺癌是当今世界最常见的肺原发性的恶性肿瘤,在发生的早期就易发生远端脏器的转移,为全球癌症死因之首。但是,如今对肺癌的产生发展机制并没有一个清楚的认识。因此,筛选、鉴定和肺癌相关的基因以及蛋白,研究其生物学功能及分子机制,将有助于更深入的了解肺癌的产生发展机制,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。　　S100A7又称为psoriasin,是S100蛋白家族成员之一。S100A7是本实验室在前期工作中,从原发性的肺鳞癌NCI-H226细胞以及其脑转移细胞株NCI-H226Br细胞中筛选出来的一个差异蛋白,它在原发性的肺鳞癌NCI-H226细胞中低表达,而在脑转移细胞株H226Br细胞中高表达。有报道称S100A7在乳腺癌、食管癌和膀胱癌中高表达,其高表达能够明显促进ER阴性的乳腺癌细胞生长和转移,但在肺癌中报道很少。在前期工作中发现在高表达S100A7的H226Br细胞中沉默S100A7后可抑制细胞的体内生长。为了进一步探究S100A7表达变化对肺癌细胞生物学功能的影响,对过表达S100A7的NCI-H226及其空载对照细胞进行了体外增殖和体内荷瘤生长的检测,结果发现S100A7过表达可显著促进NCI-H226细胞的体内外生长。由此可见,S100A7的表达变化与肺癌细胞的生长密切相关。　　有文献报道在乳腺癌中S100A7可通过与Jab-1相互作用,促进后者入核。前期结果也显示在H226Br细胞中S100A7可与Jab-1相互作用。本研究发现沉默S100A7之后,H226Br细胞中p27KipJ蛋白的表达量上升,cdk-2蛋白的表达量下调。流式细胞术检测结果显示沉默S100A7后,G1期细胞比例增多,S期细胞比例减少。由此推测,S100A7可能是通过与Jab-1结合,共同入核诱导p27Kipl,蛋白出核降解,提高cdk-2蛋白表达量,促进细胞从G1向S期转化,从而促进肺癌细胞生长。　　另一个有趣的发现是:过表达S100A7的NCI-H226细胞胞外分泌物可以促进NCI-H226/control细胞的体内生长。这提示,S100A7作为一种分泌蛋白可能通过旁分泌作用促进肺鳞癌细胞的体内生长。为了检测培养上清中分泌蛋白的种类,采用抗体芯片对过表达S100A7及其空载细胞的培养上清进行了检测,共得到了174个差异蛋白,其中143个表达上调,31个表达下调(差异大于2倍)。其中FGF蛋白家族及内皮素Endothelin上升显著。为了验证抗体芯片的结果,分别选择了FGFR的特异性阻断剂PD173074以及ETAR的特异性阻断剂ZD4505对细胞进行处理,结果显示加入FGFR抑制剂PD173074后过表达S100A7细胞及其空载细胞的体外增殖均受到了抑制,而加入ETAR抑制剂ZD4505后,空载细胞增殖几乎没有受到影响,而过表达S100A7细胞生长有明显的抑制。由此分析:正义转染S100A7的NCI-H226细胞胞外分泌物可以促进NCI-H226/control细胞的体内生长的作用可能是通过内皮素Endothelin及其受体ETAR通路发挥作用的。　　综上所述:在肺鳞癌细胞NCI-H226细胞过表达S100A7可明显促进肺癌细胞的体内外生长;并发现S100A7可能具有自分泌或旁分泌作用,而Endothelin受体通路可能参与了S100A7介导的自分泌作用。

关键词： 降钙素基因相关肽   单核苷酸多态性   重组腺病毒   人牙周膜成纤维细胞   细胞增殖   成骨分化  

摘要： 牙周炎是侵犯牙龈和牙周支持组织的慢性炎症性的破坏性疾病，它是引起牙齿缺失的主要原因之一。以前认为牙周炎的发病与进展主要受细菌及其他环境因素的影响与调节。最近，有充足的证据表明基因在该病的发病和进展中起着重要的作用。 我们的前期研究发现：降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）阳性神经纤维广泛存在于牙周组织中，尤其是牙周炎的起始部位;牙周炎时，牙周组织中的CGRP阳性神经纤维显著增多，并向周围间质释放;一定浓度的CGRP可促进体外培养的牙周膜成纤维细胞的增殖。 另外国外有研究报道CGRP基因存在四个多态性位点，并且发现与帕金森氏病和精神病的发病有关。在以前一系列的研究中发现：CGRP+5247位点存在等位基因杂合子多态性现象;CGRP+5247位点单核苷酸多态性与广东人成人重度牙周炎有相关性。虽然目前对CGRP与牙周炎发生关系的研究很多，但是研究CGRP基因多态性对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响仍需实验验证。 本研究通过构建CGRP基因多态性重组腺病毒，转染人牙周膜成纤维细胞，进一步检测了CGRP多态性基因对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响，为进一步研究CGRP基因与牙周炎的关系提供了细胞学基础。 第一部分：人牙周膜成纤维细胞的原代培养及检测 目的：取材培养人牙周膜成纤维细胞并检测其组织胚胎学来源 方法：离体牙取自长海医院门诊口腔科因正畸而拔出的双尖牙，年龄12-26岁，所选牙齿无龋坏、根尖周疾病及牙周炎。采用酶消化+组织贴附的方法进行人牙周膜成纤维细胞原代培养，在原代细胞生长达到一定数量后，局部消化传代培养。对第4代细胞进行人牙周膜成纤维细胞的形态学观察和免疫组织化学鉴定（采用sABC法，进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色）。 结果：原代培养出人牙周膜成纤维细胞，免疫荧光鉴定波形丝蛋白染色显示阳性，细胞角蛋白染色显示阴性。 结论：成功原代培养出中胚层来源的人牙周膜成纤维细胞。 第二部分:构建降钙素基因相关肽（CGRP）5247单核苷酸多态性(A/C)的重组腺病毒，转染人牙周膜成纤维细胞并测定细胞内CGRP基因及表达蛋白的变化 目的：制备与鉴定携带CGRP-A和CGRP-C的重组腺病毒并将CGRP-A,CGRP-C基因转染入人牙周膜成纤维细胞 方法：以计算机软件辅助设计引物扩增CGRP-A开放阅读框序列，通过重叠PCR点突变活动CGRP-C开放阅读框序列;分别将CGRP-A和CGRP-C插入pShuttle中构建腺病毒穿梭质粒pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C，经酶切线性化后采用电穿孔法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1一起转化到BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中，挑选同源重组质粒，酶切线性化后利用脂质体法将其转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒，观察细胞病变效应（CPE）现象，收集细胞反复冻融、裂解，获得高滴度重组腺病毒，通过酶切分析及PCR分析，鉴定重组腺病毒是否含有插入的目的序列。Ad-CGRP-A,Ad-CGRP-C重组腺病毒以及对照组Ad-EGFP分别转染处于对数生长期的人牙周膜成纤维细胞中，72小时后抽RNA，反转录为cDNA，用定量PCR和Westen-blot等方法测定细胞内CGRP基因及表达蛋白的变化。 结果：DNA序列测定结果证实重组质粒载体pShuttle-CGRP-A及pShuttle-CGRP-C构建正确，插入序列位置正确。PCR及酶切鉴定结果，重组腺病毒含有目的插入序列。定量PCR结果显示转染了CGRP-A,CGRP-C基因的人牙周膜成纤维细胞组，CGRP基因含量明显高于对照组。测序显示两实验组细胞内确实含有CGRP-A与CGRP-C基因序列。 结论：成功构建Ad-CGRP-A,Ad-CGRP-C重组腺病毒载体，并成功将CGRP-A,CGRP-C基因转染入人牙周膜成纤维细胞中。 第三部分：检测转染了CGRP-A,CGRP-C基因的人牙周膜成纤维细胞的胶原mRNA与胶原蛋白的表达，细胞增殖能力以及细胞成骨分化 目的：研究CGRP-A,CGRP-C基因多态性对人牙周膜成纤维细胞生物学特性的影响。 方法：实验细胞与对照细胞抽提RNA，反转录cDNA后，用定量PCR和Westen-blot测定细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量和胶原蛋白表达;用流式细胞仪测定细胞周期，观察两基因对细胞增殖的影响;钙盐染色定性观察细胞成骨分化。 结果：显示，含有CGRP-A基因的细胞，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量及胶原蛋白的表达明显高于对照组，含有CGRP-C基因的细胞Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白mRNA含量则表达上明显低于对照组;细胞周期测定结果显示，含有CGRP-C基因的细胞增殖能力明显弱于对照组和CGRP-A实验组;钙盐染色可于含有

关键词： 重组全长人釉原蛋白   牙周膜成纤维细胞   细胞内信号分子   牙周组织再生   提取纯化   DNA合成  

摘要： 目的:牙周组织再生是临床牙周治疗的终极目标,尽管釉基质蛋白(Enamelmatrix proteins,EMPs)能够诱导实现牙周组织的功能性重建,但现有商品化的猪EMPs存在着来源限制及其他成分干扰等诸多问题。近年来有研究提出EMPs的主要成分釉原蛋白(amelogenin,Am)是其诱导牙周组织再生的关键,有望替代EMPs用于牙周组织再生。然而,对单一成分Am的细胞生物学活性及其与EMPs的比较目前还缺乏系统研究,而Am本身异质性和表达的时空特异性使其单一组分的提取纯化极为困难,因此,本课题拟分别纯化原核大肠杆菌和真核毕赤酵母表达的重组全长人釉原蛋白(rhAm175),比较不同来源的rhAm175与天然EMPs对人牙周膜成纤维细胞(Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)生物学作用的差异。初步探讨rhAm175促进牙周组织再生的作用和可能机制,为rhAm175代替EMPs用于牙周组织再生提供实验依据。<br>　　方法:将全长人Am编码序列分别插入选择原核表达载体pET28a或真核表达载体pPIC3.5K中,重组表达质粒转化*** BL21(DE3)和*** GS115(Mut+)感受态细胞后筛选阳性克隆。诱导表达的重组全长人釉原蛋白(E-rhAm175和Y-rhAm175)通过镍柱亲和层析纯化,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)鉴定。乙酸法提纯猪釉基质蛋白(pEMPs)。比较E-rhAm175、Y-rhAm175和pEMPs对体外培养人牙周膜成纤维细胞粘附、迁移、增殖和分化的影响,并分析可能参与这些细胞生物学作用的细胞内信号分子——细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal response kinase,ERK1/2)和Akt激酶(Akt kinases/protein kinase B,Akt/PKB)的活化情况。<br>　　结果:1、分别在*** BL21(DE3)和*** GS115(Mut+)细胞中成功表达E-rhAm175和Y-rhAm175,通过亲和层析法获得纯化的重组蛋白,经SDS-PAGE和WB鉴定为全长人釉原蛋白。2、10 ug/ml和20ug/ml的E-rhAm175或Y-rhAm175均能显著促进hPDLFs黏附、迁移和增殖,抑制成骨分化标志物(ALP、OCN、COL I、Runx2)的mRNA表达水平,其作用与200ug/ml pEMPs之间无明显差异。3、***175、Y-rhAm175或pEMPs均通过激活ERK1/2促进hPDLFs的DNA合成,进而发挥促增殖的作用。而Akt激酶不参与rhAm175或pEMPs对hPDLFs生物学特性的影响。<br>　　结论:重组全长人釉原蛋白rhAm175与pEMPs对hPDLFs具有相似的细胞生物学作用。单一成分的rhAm175可通过与pEMPs相同的方式作用于hPDLFs,从而参与促进牙周组织的修复和再生。

关键词： 人端粒酶逆转录酶   胎儿成纤维细胞   山羊  

摘要： 胎儿成纤维细胞（Fetal fibroblast cells, FFCs）由于具有易培养、体外培养生长速度快、耐操作、染色体倍性稳定等特点，被作为常用的细胞核移植的供体细胞。既便如此，胎儿成纤维细胞的利用依旧面临着取材较为困难，传代细胞容易衰老，扩大培养难等问题；并且在基因转染过程中常需要将胎儿成纤维细胞在体外多次传代，这将导致细胞快速衰老并逐渐不适合用于核移植操作；而通过各种技术和方法获得稳定传代和有较强增殖能力的胎儿成纤维细胞，就成为了研究人员解决核移植供体细胞问题的途径。人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase，hTERT)与端粒酶活性存在平行关系，并可在分裂增殖的细胞中起到维持端粒的长度的作用。因此，人端粒酶逆转录酶基因被用于本试验的细胞转染，以期该基因能得到表达并最终起到延长细胞寿命的作用。 本研究用含有人端粒酶逆转录酶基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染了西农萨能山羊的胎儿成纤维细胞。检测了转染细胞的包括细胞生长曲线、hTERT基因的表达、端粒酶活性、端粒长度、细胞核型、细胞致瘤性、以及生长因子Oct-4和Nanog的表达等生物学特点。试验结果显示，人端粒酶逆转录酶被成功转入山羊胎儿成纤维细胞并可在一定程度上延长成纤维细胞体外培养的寿命。人端粒酶逆转录酶基因在转染细胞中得到了表达，端粒酶在不同代数转染细胞中的活性均高于对照组的未转染细胞。应用Real-time PCR的方法测定端粒长度后发现，转染组细胞的端粒的长度在一定程度上得到了维持。另一方面，核型分析表明经人端粒酶逆转录酶转染的细胞仍具有正常核型，染色体数目为58+2条。不同代数的转染细胞注射裸鼠皮下后，均未表现致瘤性。hTERT基因的转染甚至可以提高生长因子Oct-4和Nanog在山羊胎儿成纤维细胞的表达，尤其在低世代细胞中这种差异更为显著，但随着传代次数的增加，hTERT基因对生长因子Oct-4和Nanog表达的促进作用逐渐减弱。 以上结果表明hTERT基因修饰提高了细胞端粒酶活性，一定程度延长了细胞寿命，对山羊胎儿成纤维细胞的生存和增殖具有促进作用，同时还能维持细胞的生物学特征。本细胞系可以作为转基因的供体细胞使用。

关键词： 钠钾交换ATP酶   结直肠肿瘤   肿瘤干细胞   肿瘤转移  

摘要： 结直肠癌(Colorectl cancer, CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居世界第三位，死亡率却占第二位，远处转移是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的转移是多因素及多步骤调控的级联过程，而侵袭穿过基底膜仅是转移过程的第一步。近年来，结直肠癌经标准化疗和分子靶向治疗，其生存率虽有显著提高，但对转移性结直肠癌的治疗效果仍然有限。目前，结直肠癌的复发、转移及治疗抵抗都归因于肿瘤干细胞的存在。因此，如何抑制肿瘤转移、逆转多药耐药及特异清除肿瘤干细胞对提高结直肠癌的治疗效果极为重要。 Na-K-ATP酶是广泛存在于上皮细胞膜上的一种跨膜蛋白，其α亚单位在多种肿瘤组织和细胞中特异表达，包括结直肠癌，异常表达的α亚单位涉及某些肿瘤如非小细胞肺癌、胶质瘤细胞的生长、迁移及侵袭，而β1亚单位在多数组织均有表达，作为细胞黏附分子，参与细胞间紧密连接形成、维持上皮细胞原有极性，与癌上皮组织分化程度、肿瘤细胞的侵袭及转移有关。Na-K-ATP酶活性异常及亚单位特异表达伴随结直肠癌肿瘤的发生，但是否参与结直肠癌的转移、多药耐药及肿瘤干细胞的“干性”维持等尚不明确。因此，我们推测：Na-K-ATP酶亚单位在结直肠癌亲本细胞、耐药细胞及干细胞中特异表达，其中亚单位可能与肿瘤细胞的增殖、侵袭、多药耐药及干细胞“干性”维持有关。本课题拟以不同临床分期的结直肠癌亲本细胞SW480、SW620、耐药细胞及肿瘤干细胞为研究对象，检测Na-K-ATP酶亚单位在上述3种细胞中的特异表达水平，观察特异表达的亚单位与结直肠癌细胞增殖、侵袭、多药耐药(Multidrug resistance, MDR)、肿瘤干细胞自我更新及致瘤能力的关系，阐明Na-K-ATP酶亚单位特异表达对结直肠癌亲本细胞、耐药细胞及肿瘤干细胞生物学特性影响的分子机制，最终为结直肠癌的治疗提供新的靶点和思路。 目的 明确Na-K-ATP酶活性及其亚单位特异表达与人结直肠癌细胞增殖、侵袭、多药耐药、干细胞自我更新及致瘤能力的关系，探讨Na-K-ATP酶亚单位特异表达对结直肠癌细胞生物学特性影响的分子机制，旨为有效抑制结直肠癌转移、逆转多药耐药及靶向结直肠癌干细胞(Cancer stem cells，CSCs)治疗提供新靶点。 方法 1.以不同临床分期的结直肠癌亲本细胞SW480、SW620为实验材料，通过递加培养液中奥沙利铂浓度建立慢性抵抗奥沙利铂细胞株SW480/OxR，流式细胞术分选CSCs。采用MTS或MTT法检测细胞增殖能力，Transwell小室检测细胞侵袭力，用酶学比色法测定Na-K-ATP酶活性，荧光定量PCR及Western blotting或流式细胞技术等检测细胞Na-K-ATP酶亚单位(α1、α2、α3及β1)、P-糖蛋白及EpCAM/CD44表达。从Na-K-ATP酶亚单位中分别筛选出与结直肠癌亲本细胞、SW480/OxR及CSCs增殖、侵袭、多药耐药、自我更新及致瘤能力的有关的亚单位为治疗靶点。 2.观察Na-K-ATP酶抑制剂Ouabain对结直肠癌亲本细胞、SW480/OxR及CSCs增殖、侵袭、多药耐药、自我更新、致瘤能力及Na-K-ATP酶亚单位表达的影响，验证拟筛选靶点的特异性，及揭示Ouabain治疗结直肠癌的可能机制。 3.构建针对Na-K-ATP酶亚单位的慢病毒载体并感染结直肠癌CSCs，观察携带Na-K-ATP酶亚单位-shRNA慢病毒载体对结直肠癌CSCs生物学特性、结直肠癌标志物EpCAM/CD44表达及凋亡等影响，进一步验证拟筛选靶点的特异性，寻求结直肠癌治疗的新靶点及可能机制。 4.观察携带靶向结直肠癌CSCs的Na+-K+-ATP酶亚单位-shRNA的慢病毒载体对NOD/SCID小鼠致瘤能力的影响，及其对移植瘤细胞增殖及凋亡的生物学效应，揭示靶向结直肠CSCs治疗的分子机制。 结果 1. SW620细胞增殖及侵袭力均较SW480细胞明显增加(P均<0.05)，SW620细胞Na-K-ATP酶活性下降，并伴随Na-K-ATP酶α1亚单位mRNA及蛋白表达上调(P均<0.001);而SW480细胞Na-K-ATP酶α3亚单位mRNA表达却上调(P <0.001)，且与蛋白表达水平一致;生理浓度(1nM)Ouabain(Ouabain)在24、48及72h均能显著抑制SW620细胞及SW480细胞的增殖能力，以48h效应最强，减弱其侵袭力，并下调Na-K-ATP酶α1亚单位蛋白表达，而对Na-K-ATP酶α2和α3亚单位蛋白表达却无影响，仅增加SW620细胞Na-K-ATP酶活性，对SW480细胞Na-K-ATP酶活性无影响。 2. SW480/OxR细胞的增殖能力较SW480细胞无明显变化(P>0.05)，并对5-FU也产生耐药，但细胞侵袭力却显著增加

关键词： 羊水干细胞   成骨细胞   骨质疏松   骨密度  

摘要： 研究目的 1.复苏，传代培养羊水干细胞 2.对其生物学特性及向成骨细胞定向分化经行研究 3.沿尾静脉注射AFS，对其治疗大鼠骨质疏松（OP）效果进行评价 材料和方法 1.选取不同代数的AFS，复苏，传代培养。 2.观察细胞的形态学特性，描述体外培养的AFS的生物学特性 3.应用诱导因子诱导AFS定向分化为成骨细胞，并通过一系列方法（细胞形态，细胞碱性磷酸酶染色，Ⅰ型胶原蛋白测定等）对分化后的细胞进行鉴定 4. AFS对大鼠OP治疗效果的评价：采用同龄SD大鼠，随机分为4组，A组正常组，B组模型组， C组制造模型并且一次性注入AFS， D组制造模型并且不同时间两次注入AFS。除A组灌胃用等量生理盐水，其余各组连续14天灌胃RA，同时，C组于灌胃第14天尾静脉注射AFS，D组于灌胃第7天及第14天尾静脉注射AFS。实验过程观察生活习性及体重变化，骨密度测定，血清骨代谢指标检测定，测量股骨横断面外径（B）及湿重，骨微观结构的观察。 结果 1.成功复苏AFS，诱导分化细胞具有成骨细胞特性 2. AFS对大鼠骨质疏松治疗效果的评价 2.1股骨骨密度（BMD）测定结果显示：D组实验前后差异无统计学差异（P>0.05），说明AFS对骨质疏松具有潜在缓解效果 2.2血清生化指标检测结果显示：D组血钙，血磷，TRACP实验前后均无统计学差异（P>0.05），ALP实验后较前明显增加，说明AFS对骨质疏松钙盐沉积具有潜在治疗效果 2.3D组大鼠股骨湿重实验前后无统计学差异，说明AFS对骨质疏松的修复作用表现在股骨重量上 2.4骨薄片Goldner三色法染色显示：D组可见部分胶原恢复到与A组骨胶原相似的结构 结论 1.成功复苏并传代不同代数的AFS，证明其具有定向诱导分化的能力 2. RA具有致骨质疏松作用，成功制造出OP模型 3. AFS可以抑制血钙浓度升高，增加钙盐沉积，减少TRACP的生成，减少骨吸收，从而增加骨量。 4. AFS对OP具有潜在修复作用。

关键词： HCN4   Tbx3   慢病毒   生物学活性  

摘要： 目的： 电子起搏器的局限性促使人们在缓慢性心律失常的治疗中寻找新的途径和方法，体外重新构建具有窦房结功能的细胞便是尝试之一。目前主要以HCN4基因转染干细胞，其虽能分化成心肌样细胞，但由于缺乏窦房结标记基因，功能上与窦房结细胞仍有差距。Tbx3基因在胚胎发育成熟晚期存在于窦房结前体细胞中使之保留起搏功能并抑制窦房结前体细胞向心房肌细胞分化。同时Tbx3与肿瘤的发生密切相关，目前已经发现乳腺癌、膀胱癌、肝癌等恶性肿瘤都存在Tbx3基因的过表达。本研究拟构建同时携带有人HCN4基因、Tbx3基因及增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的慢病毒颗粒，并研究HCN4和Tbx3对小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）细胞生物学活性的影响，为进一步通过HCN4、Tbx3共表达重建窦房结细胞功能奠定基础。 方法： 1、慢病毒包装及滴度测定 用脂质体Lipofectamine2000分别包裹携带有目的基因的hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四种目的质粒和辅助质粒，共转染293FT细胞，分别产生含有表达hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP基因的四种慢病毒颗粒，计数荧光克隆数目，并计算病毒滴度。 2、干细胞稳定转染和筛选 将获得的四种慢病毒颗粒分别转染小鼠ES细胞，48小时后于荧光显微镜下观察转染效果。将转染成功的细胞进行传代扩增并进行挑克隆纯化，RT-PCR进一步检测目的基因表达情况。 3、ES细胞生物学活性的评价 观察获得的四种转基因小鼠ES细胞的形态、荧光表达强度。MTT法测定各组ES细胞OD值，流式细胞仪分析细胞凋亡率。 结果： 1、hHCN4-hTbx3慢病毒颗粒的构建 四质粒转染293FT细胞后，根据荧光显微镜观察结果表明成功构建hHCN4-hTbx3-eGFP、hHCN4-eGFP、hTbx3-eGFP、eGFP四种慢病毒颗粒。病毒滴度测定结果分别为4.7×10～7TU/ml、5.2×10～7TU/ml、4.5×10～7TU/ml、6.7×10～7TU/ml。 2、转基因ES细胞相关基因的表达检测 四种慢病毒转染后的ES细胞挑克隆纯化后荧光表达正常，RT-PCR示目的基因表达良好。 3、ES细胞形态、凋亡等变化 四种转染小鼠ES细胞中，含hHCN4-eGFP及eGFP细胞形态良好，荧光率较高，含hTbx3-eGFP和hHCN4-hTbx3-eGFP细胞状态相对差，荧光虽然明显，但表达不强，培养上清可见漂浮的死细胞。进一步的MTT和流式细胞仪（AnnexinV-PE）检测示hTbx3-eGFP、 hHCN4-hTbx3两组细胞生长速度明显减慢，凋亡率显著增高（P<0.05）。 结论： 1.成功构建出HCN4-Tbx3基因的慢病毒颗粒。 2. HCN4及Tbx3基因成功在干细胞中过表达。 3. Tbx3对干细胞增殖无促进作用。

关键词： 实验   教材   细胞生物学   高等学校  

ISBN: (纸本)9787030348869

摘要： 本书在目录编排上全面系统地反映细胞生物学实验技术体系。将每项技术的基本原理、实验准备、细胞培养、检测手段、注意事项、实验技巧等融为一体，理论与实践紧密结合，符合学生的正常思维，使学习者较容易地掌握各项技术，既使用于教学，又可指导实验研究，有较强的可操作性和重复性。在文字叙述上力求通俗易懂，插图清晰简明，便于自学，强调实用性。增补近期新发展的实验研究技术，注重对读者基本实验操作技能的培训和实验室工作...