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关键词： 眼科学   激光   细胞生物学   分子生物学  

摘要： 眼科的激光应用，主要指“眼底病”的激光治疗，尤其是Ⅲ、Ⅳ期的DR的激光治疗。其作用机制从微循环障碍的角度，提出一个细胞生物学与分子生物学的假说。

关键词： 诺贝尔医学奖   免疫学   国际   细胞生物学   免疫系统   研究成果  

摘要： 上一期本刊“热点评析”专栏发表了“免疫系统如何被激活和调控？”（见《中国细胞生物学学报》2011，33（12）：1104-6．），介绍了2011年诺贝尔医学奖的研究成果。

关键词： 聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP-1)   HaCaT细胞   生物学性状  

摘要： [目的]探讨人皮肤表皮细胞(HaCaT)聚-ADP核糖聚合酶-1基因(PARP-1)过表达后的生物学性状变化。[方法]设试验组、空载体对照组、正常HaCaT对照组,运用真核表达载体使PARP-1基因在HaCaT中过表达,在光学显微镜下观察转染重组子的试验组细胞、转染空质粒的对照组细胞及正常对照组细胞的形态学特征。绘制细胞生长曲线,并运用流式细胞技术分析细胞周期。以苯并芘(BaP)恶性转化的细胞作为阳性对照,采用软琼脂克隆形成试验对细胞的恶性程度进行鉴定。[结果]光镜下试验组细胞与空载体组细胞及正常对照组细胞相比,除体积稍有缩小外,其他形态学特征没有明显变化。3组细胞的生长曲线均呈相似的S型,但转染重组子细胞的生长速度加快。试验组、空载体组及正常细胞组的细胞周期分布为G1期(44.3%、78.1%、76.4%)、G2期(3.6%、13.3%、12.2%)和S期(52.1%、8.6%、11.4%)。正常对照细胞和空载体组分布相近,试验组S期明显增多;试验组细胞未见在双层软琼脂糖中生长出细胞集落,而阳性对照组细胞集落明显。[结论]PARP-1基因过表达后可以改变HaCaT细胞的生长速度,但并不影响细胞的恶性程度。

关键词： 多能性干细胞   诱导机制   重编程培养体系   骨形成蛋白   细胞生物学  

摘要： 诱导多能性干细胞的建立是再生医学和细胞生物学研究中具有里程碑意义的事件。然而诱导重编程效率的低下和培养条件的复杂性，严重阻碍了相关机制的研究。为了解决上述问题，本文从优化重编程培养体系入手，首先成功建立了一套高效的无血清重编程培养体系iSF1，该培养体系下四因子的重编程效率可从0.01％提高到0.5％。进一步地，我们针对更少因子的重编程进行了培养体系的优化，最终成功建立一套支持极高效率的成分确定的三因子重编程体系iCD1。在该体系下，三因子的重编程效率可在感染后第八天达到10％，同时也可有效支持两因子（OK和OS）和单因子Oct4及其它因子组合诱导的重编程。利用iCD1技术平台，我们首先发现重编程因子Klf4的功能是促进重编程早期细胞间充质上皮转化，该功能可以被骨形成蛋白有效替代。骨形成蛋白可通过促进细胞间充质上皮转化显著提高OS和O介导的重编程效率和速度。此外，我们还首次发现骨形成蛋白能通过Smad蛋白强烈抑制Jhdm1b介导的重编程过程，该发现表明BMP在重编程过程中的作用具有两面性。\n 综上所述，本研究极大完善并简化了重编程技术平台，并在体细胞重编程及细胞命运决定的关键机制上提供了新的观点和认识。

关键词： 超氧化物歧化酶   间充质干细胞   腺病毒   急性辐射损伤   恒河猴  

摘要： 随着科学技术的高速发展，核能及核技术在工业、农业、医疗及军事等各领域的应用愈加广泛，拥有和正在发展核武器的国家越来越多，尤其是核电技术的开发和利用发展迅速。尽管人们在核能技术的开发和利用过程中注意了辐射安全与防护，但核与辐射突发事件仍常有发生，使受到高剂量电离辐射照射的人群发生急性放射病（acute radiation sickness，ARS）。根据受照射剂量大小和病程表现，把急性放射病大体分为骨髓型、肠型和脑型三种类型ARS，而骨髓型又分为轻、中、重和极重度四度。目前，对ARS患者的主要救治措施有抗放药、造血干细胞移植和综合对症支持治疗，这些措施可成功救治重度以下的ARS患者，但对于极重度骨髓型ARS没有行之有效的治疗方法，现有的医疗水平仅能延长患者的存活时间。极重度骨髓型ARS病情严重、治疗困难，骨髓造血功能衰竭、免疫功能丧失，全身多脏器损伤是患者的主要的致死原因。 众所周知，射线对机体造成的损伤主要有直接损伤和间接损伤两部分，直接损伤作用时间较短，损伤较快，主要导致机体内部分子结构的改变和生物活性的丧失，只能通过直接屏蔽的方法防护。间接损伤是一个复杂的过程，由于机体内含有大量的水（约占生物体干重的80%），射线作用于水分子后，引起水分子活化和自由基生成，然后通过自由基攻击机体内DNA分子中的碱基、核糖和磷酸二脂键造成碱基与核糖氧化、键断裂与蛋白质交联等多种类型的损伤，同时自由基还可通过一系列的反应破坏生物膜系统，从而使物质转运、能量转换、信息传递与识别等基本生物活动受到破坏，以上称之为间接损伤。机体内天然存在着一些清除自由基的酶类，例如：能分解H2O2的过氧化氢酶与过氧化物酶，催化O2-歧化反应的超氧化物歧化酶，清除羟基过氧化物的谷胱甘肽转硫酶等多种。但是这些酶类主要是清除内源性自由基，对于射线作用产生的大量外源性自由基作用相对较弱。虽然，这些自体的超氧化物歧化酶可通过清除自由基来抗辐射，但是，对于射线直接作用的脏器组织和辐射早期自由基对机体组织造成的损伤并没有良好的防治效果。寻找一种能够有效清除辐射早期产生的自由基同时能够对多组织脏器进行修复的新型治疗措施迫在眉睫。 骨髓间充质干细胞是来源于骨髓的一类非造血干细胞，可以在体外扩增并具有多向分化潜能，在特定诱导条件下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管、神经细胞与支持造血干细胞的基质等。已有多项研究证实，将骨髓间充质干细胞植入体内后，他们能够向多个受损组织部位归巢并分化成为相应的组织细胞，并且能够与各种病毒载体相结合，可进行多种基因的转染，它有望成为治疗急性放射病的新型细胞药物。 基于以上背景，本研究拟采用腺病毒表达载体，通过腺病毒载带胞外分泌型超氧化物歧化酶（extracellular superoxide dismutase,ECSOD）基因和报告基因EGFP转染恒河猴骨髓间充质干细胞，研究ECSOD对恒河猴骨髓间充质干细胞（rhesusmacaque bone marrow mesenchymal stem cells, R-BMSC）生物学性质的影响，旨在为极重度骨髓型急性放射病的临床救治提供实验依据。 首先，应用梯度密度离心法和贴壁培养法分离、培养并纯化R-BMSC，培养细胞呈纤维状贴壁生长。第三代R-BMSC用流式细胞仪检测其表面抗原，结果证明为非造血细胞，符合文献报道的间充质干细胞表面标志。通过成功诱导R-BMSC向成骨及成脂方向分化，证明了其具有多向分化的能力。 第二，应用gateway技术体外构建载带ECSOD和EGFP基因的腺病毒表达载体，在293细胞中包装并扩增，获得了活力较好的腺病毒。应用不同滴度腺病毒体外感染R-BMSC，然后应用荧光显微镜和流式细胞仪检测，发现感染效率可达到90%以上；用ELISA法检测感染后R-BMSC细胞培养上清液，可检测到有ECSOD蛋白的表达。 最后，研究了ECSOD基因转染对R-BMSC生物学性质的影响。通过流式细胞仪对转染了ECSOD基因的R-BMSC（MSC-ECSOD）细胞表型进行鉴定，结果显示MSC-ECSOD与未转染的R-BMSC的表型相似。进一步分析ECSOD基因转染对R-BMSC的分化潜能的影响，发现MSC-ECSOD成脂诱导14天后，用油红O染色可见有被染成红色的脂肪油滴；MSC-ECSOD成骨诱导17天后，茜素红染色可见被染成红色的骨结节。这些结果说明ECSOD转染对R-BMSC分化潜能没有影响。MTT法观察感染前后细胞增殖能力也没有统计学差异。 综上所述，本研究采用梯度密度离心和贴壁培养法培养的R-BMSC，具有与人骨髓间充质干细胞相似的生物学特性。并且成功鉴定了R-BMSC的表型和分化能力。用腺病毒载体体外感染R-BMSC，感染效率可达

ISBN: (纸本)9787312029028

关键词： 肝细胞癌   细胞外信号调节激酶1(ERK1)   原癌基因c-myc  

摘要： 【研究背景及目的】 原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)是指由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤。肝细胞癌(以下简称肝癌)(hepatocellular carcinoma，HCC)是其中最常见的组织学类型，占肝脏肿瘤的80%0%。肝癌的全球发病率逐年增长，在所有恶性肿瘤中位列第五，而其死亡率为第三位。尽管近年来肝癌的诊治已取得较大进展，但其预后仍不理想，临床迫切需要寻找新的治疗方案。 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase cascades，MAPKs)是一类广泛存在于细胞内的高度保守的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的信号转导系统。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulation kinases，ERKs)是其重要成员之一，参与了包括肝细胞在内的多种细胞的增殖、分化、凋亡等病理生理过程。有研究表明，ERK信号转导通路在HCC中过度活化，且ERK通路活化的HCC患者相对ERK表达阴性的患者预后更差，因此，抑制ERK的表达可能成为治疗肝癌的新靶点。 本课题旨在探讨ERK1小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)对大鼠肝癌细胞株生物学特性的影响及其可能的作用机制。 【实验方法】 一、检测人肝癌标本及大鼠肝癌细胞株中ERK1的表达 (一)肝癌组织中ERK1表达 选择12例人肝癌手术切除标本，以癌旁肝组织做为对照，免疫组化法检测ERK1表达及定位情况。 在二乙基亚硝胺(diethylinitrosamine，DEN)诱导大鼠肝癌形成的过程中，取不同时间点大鼠肝组织，免疫组化法检测ERK表达及定位情况。 (二)大鼠肝癌细胞株中ERK1表达 培养大鼠肝癌细胞株RH-35及H4IIE，抽取总RNA，逆转录为cDNA，以正常大鼠原代肝细胞为对照，RT-PCR检测大鼠ERK1mRNA水平表达情况。 二、重组复制缺陷型腺病毒AdshERK1构建、鉴定及扩增 从pSuper质粒上双酶切得到ERK1shRNA目的片段，将目的片段与pShuttle-GFP-H1-neo质粒连接，获得穿梭质粒pShuttle-GFP-H1-shERK1，该质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后筛选获得pAdshERK1。Pac I酶酶切质粒pAdshERK1使其线性化后，转染293A细胞进行包装，获得腺病毒AdshERK1。以同样方法构建空白对照病毒AdshNC。用AdshERK1感染肝癌细胞H4IIE，Western blot方法检测细胞中ERK1蛋白水平表达。 扩增高效表达ERK1siRNA的腺病毒AdshERK1和对照病毒AdshNC，测定病毒滴度，-80℃冰箱中保存。 三、AdshERK1对大鼠肝癌细胞生物学效应的影响 (一)AdshERK1对肿瘤细胞生长的影响 1.细胞增殖实验 将大鼠肝癌细胞株RH-35、H4IIE分至96孔板，设置AdshERK1感染组、对照病毒AdshNC感染组和空白对照组。Cell counting kit8(CCK8)法检测细胞在波长为450nm时的光密度值(OD值)，连续检测6天，绘制生长曲线。 2.克隆形成实验 将感染腺病毒AdshERK1、AdshNC的RH-35、H4IIE细胞分至35mm细胞培养皿(400个细胞/皿)，当细胞分裂至肉眼可见的克隆时，用考马斯亮蓝染色，拍照并分析AdshERK1对肿瘤细胞克隆形成能力的影响。 3.流式细胞仪测定细胞周期 腺病毒AdshERK1、AdshNC感染大鼠肝癌细胞株RH-35、H4IIE，37℃CO2培养箱培养72h后，收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期变化。 (二)AdshERK1对肿瘤细胞转移能力的影响 1.划痕实验 将大鼠肝癌细胞RH-35、H4IIE分至35mm细胞培养皿，待细胞密度达95%后，用200ul枪头在细胞单层上划痕，PBS洗掉脱落细胞，用腺病毒AdshERK1、AdshNC分别感染细胞，显微镜下观察AdshERK1对细胞迁移能力的影响。 ***迁移实验 将RH-35、H4IIE细胞分至六孔板，分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后收集细胞种植于transwell小室，37℃CO2培养箱培养48h后，去除小室上层未迁移细胞，0.5%结晶紫溶液固定染色下层细胞，显微镜下观察，评估AdshERK1对肿瘤细胞迁移能力影响。 3.重组基底膜侵袭实验 将RH-35、H4IIE细胞分至六孔板，分别感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后收集细胞种植于包被有matrigel的transwell小室，37℃CO2培养箱培养48h后，去除小室上层未迁移细胞，结晶紫固定染色下层细胞，

关键词： 传统教学模式   启发式教学   多媒体辅助教学  

摘要： 本文基于医科学生人才素质培养的要求,提出了以学生发展为中心,要着力提高学生的学习兴趣,激发学生的主动思维和创新能力。本文指出要综合运用多媒体辅助教学及适当的双语教学,对传统的教学模式要进行继承与发展,医学细胞生物学的教学在理论中要注意讲授一些最新的科学发展情况,在实验教学环节中就加强培养学生的实验技能。本文对医学细胞生物学教学改革的相关方法进行了有益的探讨,对教学模式中诸多教学元素的优缺点进行了相应的阐述,取长补短,进一步深化医学细胞生物学教学改革,这对提高医学细胞生物学的教学效果有一定的促进作用。

关键词： 胎盘组织   脐带组织   骨髓源性间充质干细胞   生物学性状  

摘要： 目的：比较人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞（MSCs）的生物学性状。<br>　　方法：采用组织块贴壁培养法分离培养人胎盘、脐带源性基质细胞（SCs），采用密度梯度离心法分离培养人骨髓源性SC。采用流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD133、HLA-DR、vWF的表达及细胞周期。应用MTT法检测并比较三种SCs的增殖情况。应用免疫荧光技术检测并比较MRP1、ABCG2、P75NTR及Nestin在三种SCs的表达情况；在体外诱导三种SCs向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞方向分化，并通过特异性染色鉴定并比较其分化能力。<br>　　结果：采用组织块贴壁法能成功获得贴壁生长的成纤维样人胎盘、脐带源性SCs，采用密度梯度离心法能成功获得贴壁生长的骨髓源性SCs；流式细胞术分析结果示，人胎盘、脐带及骨髓源性SCs高表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD133、HLA-DR及vWF，细胞周期结果示，三种SCs大部分均处于G0/G1期，仅少数处于分裂期，但脐带源性SCs处于G0/G1期细胞最多，而处于S期细胞最少，处于G2M期细胞介于胎盘及骨髓源性SCs之间；免疫荧光示MRP1、ABCG2、P75NTR及Nestin在三种SCs中表达情况相似，即均为阳性表达，且荧光定位在细胞的胞浆；MTT检测结果显示，胎盘与脐带源性SCs增殖较快，两者增殖速率无差异。三种SCs经向脂肪细胞诱导后油红O染色阳性，但脐带源性SCs分化为脂肪细胞的数量多，着色深；向成骨细胞诱导后茜素红染色为阳性，向神经细胞诱导后，NSE表达阳性，但胎盘源性SCs分化为成骨细胞及神经细胞的数量多，着色深。<br>　　结论：（1）人胎盘、脐带组织中富含间充质干细胞。（2）人胎盘、脐带与骨髓源性MSCs均表达MRP1、ABCG2、P75NTR及Nestin，但骨髓源性MSCs中P75NTR的表达较弱。（3）人胎盘及脐带源性MSCs具有更强的增殖能力。（4）人胎盘、脐带及骨髓源性MSCs分化为特定细胞的潜能不同。

关键词： 脂肪干细胞   颊脂垫   细胞培养   增殖潜能   成骨  

摘要： 目的 对不同来源的人脂肪干细胞(ASCs)进行体外增殖培养,对比其多种细胞生物学特征及增殖潜能。对人ASCs进行体外成骨分化诱导培养,对比研究两种来源的ASCs成骨活性的差异。探讨颊脂垫作为潜在的富含ASCs的供体,在骨组织工程领域,尤其是应用骨组织工程技术在口腔颌面外科骨缺损修复中的应用价值。 材料与方法 无菌条件下分别提取新鲜的超声乳化负压吸脂术所得腹部皮下脂肪和面部轮廓整形手术切取人颊脂垫脂肪各10ml,Ⅰ型胶原酶消化,离心后提取ASCs,原代培养14天时,对两组细胞进行消化,计数,此后每3天换液一次,达80%融合时传代。分别取两种来源生长良好的第5代ASCs,通过CCK-8试剂盒操作要求测定两组ASCs的增殖指数,以此检测两组ASCs增殖潜能的差别；并对其进行成骨培养,分别于3、7、14天,利用碱性磷酸酶试剂盒操作要求测定两组细胞的碱性磷酸酶活性,并从成骨培养第1天开始,连续7天测量其增殖指数,比较两组ASCs在经过成骨培养后其增殖潜能和成骨潜能有何差异。 数据均由作者采用SPSS13.0软件进行分析,以P<0.05为差异有显著性意义。 结果 1、人颊脂垫为特化脂肪组织,血管成分明显多于皮下脂肪。颊脂垫提取ASCs密度为(8.77±1.28)×104/ml,显著高于吸脂术来源者(6.00±0.47)×104ml; ASCs(?)中植入培养瓶中48h滞留期后可见少量的梭形细胞贴壁,细胞形态不一,核居中。从第3天开始,进入增殖期快速期,细胞培养至第7天,可见细胞以集落或散在的方式增长,两个不同部位的ASCs形态差异较小,均以梭形和多角型为主,但颊脂垫部位ASCs形态更加均一。细胞培养至第3代,开始表现快速增殖,颊脂垫来源ASCs形态较吸脂术来源者,形态更加均一且增殖更快。ASCs逐渐长满瓶壁,经传代培养逐渐转变为均一的多边形。 2、不同来源ASCs,其表面标志CD44均呈阳性表达,造血干细胞的标志CD34均呈阴性表达,结果显示,ASCs具有间充质干细胞的表型特征。 3、经成骨培养后,ASCs的增殖速度较未成骨培养前明显减慢,经成骨诱导后的两组ASCs相比,在前3天,诱导后的ASCs的增殖速度与未诱导时ASCs差异不大；4—7天时,颊脂垫部位成骨诱导的ASCs的增殖速度显著快于吸脂术来源的ASCs成骨诱导后的增殖速度。且P<0.05,两者有统计学差异。 4、人不同部位ASCs成骨培养3天后,碱性磷酸酶活性颊脂垫组为15.8±1.25u/100ml,吸脂术组为9.43±1.65u/100ml, ASCs成骨培养7天后,碱性磷酸酶活性颊脂垫组为33.84±7.44u/100ml,吸脂术组为18.66±3.70u/100m1,成骨培养14天时,碱性磷酸酶活性颊脂垫组为61.56±5.43u/100ml,吸脂术组为45.03±4.56u/100m1,所有结果经t检验,均具有统计学差异(P<0.05)。 结论 1、人颊脂垫部位来源的ASCs相比吸脂术来源的ASCs,单位体积组织内可提取的ASCs密度更高；且颊脂垫来源ASCs增殖活性高于吸脂术来源ASCs,且具有更高的成骨活性。 2、人颊脂垫脂肪易于获得,供区提取造成的损伤小,无明显术后并发症；并且颊脂垫组织的血管丰富,不同人群颊脂垫组织的大小是相似的,它们独立于体重和脂肪的分布,不会受到体重和脂肪分布的影响,是稳定可靠的ASCs组织来源。 3、颊脂垫有望成为未来口腔颌面部,乃至全身各处骨组织工程种子细胞的理想供源。