教学课程资源库 更多>>

关键词： 骨折愈合   成骨细胞   Smad1蛋白   细胞生物学  

摘要： 目的：⑴以C2C12成肌细胞为研究模型，就IRAK-4对成骨细胞分化BMP-Smad通道的影响做出初步研究，为后期深入研究炎症对骨折愈合的影响建立初步的实验参考和基础。⑵更深入了解炎症启动、级联反应瀑布及其对骨折愈合的影响机制，为感染性骨折的针对性治疗提供理论基础。　　 方法：C2C12细胞是骨骼肌组织中分离出的肌卫星细胞，在不同的培养条件下具有不同的分化潜能。文献报道C2C12细胞有分化为成骨细胞的潜力，是研究成骨细胞分化的理想细胞模型。C2C12细胞均以1×105个细胞/ml密度接种于6孔培养板中培养，随机分为3组，每组加入不同刺激物继续培养。(1)A组:空白组，细胞悬液中不加入任何刺激物;(2)B组:BMP-2组，在细胞悬液培养体系中加入1μg/ml BMP-2培养;(3)C组:BMP-2+IRAK-4siRNA转染组，在细胞悬液培养体系中加入1μg/ml BMP-2培养并用IRAK-4siRNA100pmol对细胞进行瞬时转染。分析各组成骨细胞分化ALP成骨活性，RT-PCR检测Smad1 mRNA表达水平，免疫组化和蛋白质印迹检测P-Smad1蛋白表达水平。　　 结果：成骨细胞分化ALP活性测定显示:B组的ALP活性显著高于对照组A组，C组又较B组显著升高，各组差别有统计学意义(P＜0.05，表1、图3、4)。细胞免疫组化结果:B组P-Smad1表达活性高于对照组A组，C组又显著高于B组（图5）。RT-PCR结果显示:各组Smad1 mRNA表达对比不具有显著性，无统计学意义（P＞0.05，表2、图6）。Western Blot结果:B组P-Smad1蛋白表达高于对照组A组，C组又显著高于B组（图7）。　　 结论：①C2C12成肌细胞加入不同刺激物联合培养建立IRAK-4对成骨细胞分化BMP-Smad通道的影响模型具有操作简单，易于控制，实验结果稳定，重复性好等优点。②BMP-2具有增强体外培养的C2C12细胞成骨效应表达的作用。③IRAK-4可抑制BMP-2诱导的C2C12细胞的成骨效应表达，其中成骨相关的蛋白Smad1的磷酸化水平被抑制可能是关键因素之一。

关键词： 胃腺癌   Lumican   增殖   迁移   侵袭   预后  

摘要： 肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展和转移的各个阶段中都起着至关重要的作用。其中细胞外基质蛋白是肿瘤微环境的重要组成部分,在肿瘤中常常发现基质蛋白有异常表达,其有助于肿瘤的进展和转移,近年来研究显示,Lumican的表达与许多恶性肿瘤的生长和转移相关,但其在肿瘤发生发展中的确切作用还不明确。因此我们探讨了SLRP家族成员Lumican在胃腺癌发生发展中的作用,从而进一步来理解Lumican与人类肿瘤的关系。应用RT-PCR、荧光定量PCR、免疫印迹及免疫组织化学技术,在mRNA及蛋白水平检测了Lumican在胃腺癌组织中的表达情况；应用慢病毒载体系统建立了Lumican过表达和特异性干扰细胞株,利用CCK-8实验,平板克隆及裸鼠皮下成瘤实验,分析了过表达或干扰Lumican表达对胃腺癌细胞生长的影响；Transwell及Matrigel胶穿实验,分析了其对胃腺癌细胞迁移和侵袭的影响；流式细胞术检测了Lumican表达上调或下调时胃腺癌细胞失巢凋亡率的改变,及Lumican上调时胃腺癌细胞周期的改变；免疫印迹技术和细胞免疫荧光检测了smad2、samd3及samd4的表达和活化。同时我们还构建了Lumcian重组蛋白pQE30-HLumican(分子量约40kDa)原核表达载体系统及V152-HLumican(分子量约55kDa)真核表达载体系统,利用CCK-8实验,分析了两种重组蛋白对胃腺癌细胞生长的影响；通过Transwell实验,分析了两种重组蛋白对胃腺癌细胞迁移能力的影响。流式细胞术检测了V152-HLumican重组蛋白对胃腺癌细胞失巢凋亡的影响；软琼脂克隆形成实验观察了其对胃腺癌细胞非锚定生长的影响；裸鼠皮下成瘤实验观察了其对胃腺癌细胞体内生长的影响。研究结果表明：胃腺癌组织中Lumican mRNA表达水平显著高于癌旁正常粘膜组织,差异有统计学意义(P<0.05)。胃腺癌组织中Lumcian主要以其分子量为55kDa大小的糖蛋白形式存在,40kDa大小的核心蛋白(core protein)也有少量表达。免疫组化结果显示Lumican蛋白在胃腺癌组织的表达率显著高于癌旁正常粘膜(91.67%比7.5%,P<0.01),其表达水平与胃腺癌患者的性别、年龄、肿瘤发生部位、Laren分型、是否为印戒细胞癌、脉管侵犯、癌栓无明显相关,差异无统计学意义(P>0.05)；而与胃腺癌的浸润深度(P<0.01)、有无淋巴结转移(P<0.01)、有无远处转移(P<0.05)、TNM分期(P<0.01)、肿瘤大小(P<0.05)和是否为早期胃腺癌(P<0.01)密切相关。Kaplan-Meier生存统计结果显示,Lumican表达强阳性、阳性、弱阳性和阴性患者的总体生存率分别为：48.17%、53.56%、68.48%和89.48%,随着其表达增强,生存率逐渐减小,差异有统计学意义(P<0.01)。Lumican过表达能够显著增强胃腺癌细胞内核心蛋白的表达,而其糖基化蛋白增强不明显；Lumican表达受干扰后,核心蛋白表达明显下降,而其糖基化蛋白下降不明显。Lumican过表达能够抑制胃腺癌细胞在体内外的生长,抑制胃腺癌细胞迁移和侵袭,增加失巢凋亡率,同时Lumican基因过表达能够减缓细胞周期进展,一定程度引起G1期的阻滞。Lumican表达受干扰后,胃腺癌细胞生长得到促进,迁移、侵袭和抗失巢凋亡能力增强。Lumcian可能通过抑制smad4的表达,及smad2和smad3的活化来调控胃腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和抗失巢凋亡。pQE3O-HLumican重组蛋白可抑制胃腺癌细胞的增殖及迁移。V152-HLumican重组蛋白可促进胃腺癌细胞的增殖及迁移,增强胃腺癌细胞的抗失巢凋亡能力。我们的研究结果发现Lumican核心蛋白及糖基化蛋白均在胃腺癌组织中高表达,Lumcian核心蛋白具有抑制胃腺癌细胞生长、迁移和侵袭的作用,而Lumican糖基化形式的蛋白可促进胃腺癌的增殖、迁移和侵袭的作用。Lumican及其糖基化修饰在胃腺癌发生发展中发挥着重要作用。

关键词： SATB2   结直肠癌   干细胞相关基因   CD133   启动子   基因调控   miR202  

摘要： 在肿瘤的发生、发展过程中,肿瘤干细胞起着非常重要的作用。结直肠癌在我国是仅次于乳腺癌和肺癌、发病率位列第三的恶性肿瘤。因此,阐明结直肠癌干细胞的作用及其调控因素对于结直肠癌的临床治疗及预后判断都具有重要意义。SATB2是一种特异性的核基质结合蛋白,与SATB1同源,参与染色质重构和基因表达调控,与颅脑和骨骼的发育及干细胞分化相关。前期课题组发现,SATB2与干细胞相关基因存在相关关系,并预测到SATB2与部分干细胞相关基因启动子区域存在结合。SATB2对结直肠癌干细胞的影响及其机制仍不清楚,尚需进一步的研究。研究方法：***2干扰对结直肠癌细胞生物学特性的影响我们将包装有SATB2干扰质粒的病毒感染结直肠癌SW480细胞及DLD1细胞,运用CCK8、FN、平板克隆形成实验、Transwell小室及裸鼠皮下成瘤实验观察SATB2于扰对结直肠癌细胞系细胞生物学行为的影响。2. SATB2对结直肠癌细胞干性的影响及其机制肿瘤干细胞的特性包括肿瘤细胞的自我更新及其分化能力。我们应用条件性干细胞培养基进行肿瘤干细胞克隆球培养,观察SATB2干扰后细胞的自我更新能力的差异。通过Western Blot、免疫组织化学及细胞免疫荧光检测：SATB2干扰后细胞中干细胞标志物CD133的改变。用生物信息学软件预测SATB2与干细胞相关基因启动子区域的结合位点,应用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immune co-precipitation technology,Chip)验证SATB2与干细胞相关基因的启动子区域存在结合。3. SATB2参与miR202对Dicer调控中的作用生物信息学软件预测miR202的潜在靶标蛋白Dicer,并应用Western blot进行验证。在结直肠癌细胞中过表达SATB2,并通过QPCI检测细胞中miR202的改变。在结直肠癌细胞中过表达SATB2及与miR202模拟物共转染,用Western blot进行检测细胞中靶蛋白Dicer的改变。结果***2干扰对结直肠癌细胞生物学特性的影响FN实验结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的粘附能力明显增强,差异具有统计学意义(F=71.123,P=0.000);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=39.280,P=0.000)。CCK8法结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=6.301,P=0.000),SW480-5-C2细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=25.907,P=0.000);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=3.807,P=0.000),DLD1-5-C11细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=8.774,P=0.000)。细胞平板克隆形成实验结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的平板克隆形成明显增强,差异具有统计学意义(F=5.832,P=0.001),SW480-5-C2细胞的平板克隆形成明显减弱,差异具有统计学意义(t=3.216,P=0.015);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的平板克隆形成明显增强,差异具有统计学意义(F=24.066,P=0.000),DLD1-5-C11细胞的平板克隆形成明显减弱,差异具有统计学意义(t=2.650,P=0.045)。体外运动小室实验显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(F= 32.281,P=0.000),SW480-5-C2细胞的迁移能力明显增强差异具有统计学意义(t=3.833,P=0.004);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(F=28.901, P=0.000), DLD1-5-C11细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(t=3.579,P=0.006)。裸鼠皮下成瘤实验显示,与SW480-NC细胞相比,***480-5-C8细胞的皮下成瘤能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=3.480,P=0.003);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5细胞的皮下成瘤能力明显增强,差异具有统计学意义(F=14.172,P=0.001);DLD1-5-C11细胞的皮下成瘤能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=5.876,P=0.023)。2. SATB2对结直肠癌细胞干性的影响及其机制干细胞成球试验显示,与SW480-NC细胞相

关键词： O-2A祖细胞   促红细胞生成素   星形胶质细胞   少突胶质细胞  

摘要： O-2A (oligodendrocytes-type2astrocytes)祖细胞为双潜能细胞,可分化成少突胶质细胞(oligodendrocytes, OLs)和2型星形胶质细胞(type2astrocytes, T2As)。分离纯化O-2A祖细胞,有助于深入了解其增殖与分化的细胞生物学特性,也可用于细胞移植治疗脱髓鞘疾病以及中枢神经系统疾病。目前主要通过恒温振荡与差速贴壁法分离纯化O-2A祖细胞,但在收集过程中,无法分离那些混合存在于1型星形胶质细胞(typel astrocytes, T1As)之间的O-2A祖细胞,随着TIAs的生长和消化传代而渐渐消失。本实验采用促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)处理混存于T1As之间的O-2A祖细胞,检测分析其生物学特性。 目的：研究EPO对混存于TIAs之间的O-2A祖细胞的增殖作用,探寻有效利用这些O-2A祖细胞的方法；观察EPO处理的O-2A祖细胞在增殖与分化等生物学特性的变化,为其是否能作为细胞移植治疗神经系统相关疾病的细胞来源提供依据。 方法：(1)取新生大鼠大脑皮层进行原代混合胶质细胞培养,用恒温振荡与差速贴壁的方法分离和纯化O-2A祖细胞。(2)对纯化收集O-2A祖细胞后混存于T1As之间的O-2A祖细胞,用含EPO (10U/ml)的DMEM/F12-10%NBCS培养,观察O-2A祖细胞的生长状态。(3)分别用三种条件培养基[①T1As条件培养基(A1CM);②EPO处理的TIAs条件培养基(EA1CM);③EPO处理上述TIAs之间有O-2A祖细胞混存的条件培养基(EACM)]培养O-2A祖细胞48h,MTT法检测各种条件培养基对O-2A祖细胞增殖活性的影响；将O-2A祖细胞加入未长满的TIAs中,探讨对O-2A祖细胞增殖的影响。(4)纯化经EPO处理后大量增殖的O-2A祖细胞,将其命名为EO-2A(erythropoietin-treated O-2A)祖细胞,免疫荧光染色法检测EO-2A祖细胞及其分化细胞的抗原表型；根据EO-2A祖细胞在增殖与分化培养基下的生长情况,绘制细胞生长曲线并统计分析所分化细胞的百分数。 结果：(1)以EPO处理3-5天后,混存于TIAs之间的O-2A祖细胞大量增殖,细胞折光性强。(2)A1CM对O-2A祖细胞具有增殖作用，EPO、EA1CM和EACM对O-2A祖细胞增殖无影响；经EPO处理72h后，与T1As接触的O-2A祖细胞大量增殖不分化，而与T1As不接触的O-2A祖细胞则分化成T2As。(3)与O-2A祖细胞相比，EO-2A祖细胞开始增殖与分化的时间延迟，分化成T2As的比率高，且细胞的突起更长；免疫荧光染色结果显示EO-2A祖细胞呈NG2和A2B5双阳性，其分化成熟的T2As呈GFAP和A2B5双阳性，其分化成熟的OLs呈GalC和MBP双阳性。 结论：上述结果表明，EPO能够使混存于T1As之间的O-2A祖细胞大量增殖，且这种增殖作用依赖于T1As与O-2A祖细胞的接触。与正常培养的O-2A祖细胞相比，EO-2A祖细胞的细胞突起更长，且更易于诱导分化为T2As。为其作为细胞移植治疗神经系统相关疾病的细胞来源提供依据。

关键词： 水牛脂肪干细胞   生物学特性   表面抗原   诱导分化   表观遗传修饰  

摘要： 本研究从水牛腹股沟处脂肪组织中,通过胶原酶消化法分离出水牛脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),观察原代及传代后细胞形态。将分离得到的细胞用低糖-DMEM(Dulbecco,s modified Eagle，s medium low glucose,LG-DMEM)和 α-MEM(α modified Eagle's medium)培养和传代,进行生长曲线的评定,建立一种适合水牛ASCs分离和培养的方法。利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法检测水牛ASCs多能性相关基因表达情况,选择适当抗体,利用流式细胞技术,检测水牛ASCs多种表面抗原的表达情况,将水牛ASCs体外诱导分化(成脂、成骨、成软骨)后进行相关检测,初步探索水牛ASCs的诱导分化能力。利用实时荧光定量PCR(quantitive real time PCR,qRT-PCR)的方法检测水牛ASCs表观遗传修饰情况,探索水牛ASCs作为供体细胞并提高核移植效率的可行性。研究取得如下结果。(1)分离所得的原代ASCs细胞比血红细胞较大,在显微镜下呈单细胞悬液状态,接种4h后开始贴壁,48h后细胞呈现梭型或多边形。7-8d后细胞生长汇合并停止生长,呈长梭型、多角形-成纤维细胞样,体外培养10代细胞核型正常,表达多能性相关基因如Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc和klf4,表明具有ASCs一般的生物学特性。细胞生长曲线的测定结果发现,LG-DMEM更适用于水牛ASCs的扩增培养,细胞倍增时间(population doubling time,PDT)平均为 2.071d。(2)利用流式细胞技术对水牛ASCs多种表面抗原表达情况进行了检测。结果显示,水牛ASCs表达间充质干细胞的表面标记如CD13、CD29、CD44,而造血干细胞的表面标记如CD45、CD31呈阴性。水牛ASCs经诱导后可成为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞,且表达这些细胞的相关特异性基因,说明水牛ASCs具有多向分化的能力。(3)通过qRT-PCR方法检测了不同代数水牛ASCs与水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibr,oblasts,BFF)中 HDAC1、Dnmtl 的表达情况,比较了水牛ASCs的DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平与BFF的差异。结果显示,所测不同代数的水牛ASCs的Dnmtl表达量极显著低于BFF(p<0.01);在HDAC1表达量上,P2、P5、P9及P11水牛ASCs显著低于P4代BFF(p<0.05),但P4和P7代水牛ASCs与BFF并无明显差异(P>0.05)。这结果表明,水牛ASCs具有较高的组蛋白乙酰化及较低的DNA甲基化水平,可能比BFF在核移植后更易于细胞核的重编程。上述结果表明,胶原酶分离法可分离得到水牛ASCs,且具有ASCs一般的生物学特性;LG-DMEM较a-MEM更适合用于水牛ASCs的扩增培养;水牛ASCs可以表达多能性相关基因如Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog和klf4,以及间充质干细胞标记抗原(CD13,CD29,CD44),但不表达造血干细胞的表面抗原(CD31、CD45),且具有成脂、成骨、成软骨的多向分化潜能;水牛ASCs的HDAC1(除P4、P7代)、Dnmtl表达量均显著低于BFF,说明水牛ASCs具有较高的组蛋白乙酰化及较低的DNA甲基化水平,可能较BFF 更适合作为核移植供体细胞。

关键词： CCD   RUNX2基因   牙囊细胞   生物学特性  

摘要： 前言 牙囊在牙齿萌出过程中有着至关重要的作用,萌出从本质上来说是发育中的牙齿在牙槽骨中的迁移,其骨内阶段涉及到骨吸收形成萌出通道、根分叉区的骨形成、牙根生长以及基底部骨沉积将萌出中的牙齿移动到萌出通道上,这些事件均由牙囊调控。研究证实牙齿萌出相关分子基因及其产物定位在牙囊中,如CSF-1、c-fos、RUNX2,调控着牙齿萌出所需的成骨-破骨过程。有证据表明成骨细胞特异性转录因子RUNX2在牙囊持续高表达,并在分子层面上调控牙齿的萌出,然而其具体机制仍需要进一步探索。 颅骨锁骨发育不良（CCD）是一种少见的遗传性疾病（MM119600）,多为常染色体显性遗传。CCD表现为全身骨骼和牙齿发育不良,口腔表现为乳牙滞留、恒牙迟萌以及多生牙。RUNX2是CCD患者的致病基因,其杂合突变、基因插入、缺失等是造成CCD的重要原因。 本研究以RUNX2基因突变对于未萌牙牙囊细胞（human dental follicle cells,HDFC）生物学特性的影响为切入点,通过分析RUNX2基因突变时牙囊细胞生物学特性的改变及对破骨相关基因表达的影响,探讨RUNX2通过调控牙囊内基因的表达而参与牙齿萌出的可能作用。以下从CCD病例的收集、牙囊细胞的分离鉴定及生物学特性的变化三部分简要概括本研究的内容如下。 第一章颅骨锁骨发-育育不良综合症患者的临床资料收集和突变检测 目的：收集CCD病例,获取RUNX2基因突变患者牙囊组织,为后续实验打下基础。 方法：对具有相关临床症状的先证者详细采集病史,明确单发或家族聚集倾向；利用×线检查全面了解患者及其父母的全身骨骼发育情况；详细进行口腔检查,记录恒牙萌出及乳牙迟萌以及埋藏牙、多生牙等典型临床症状；综合上述临床资料,明确诊断。取CCD患者及其姐姐的静脉血,抽提基因组DNA,1%琼脂糖电泳检查抽取的DNA质量,用核酸及蛋白定量仪对其进行定量,PCR扩增RUNX2的序列,纯化PCR产物,进行双向直接测序,对RUNX2基因测序结果进行核酸序列同源性比较分析（Blastn）,分析突变位点； 结果：收集到一例CCD患者,具有明显的临床特征,符合临床诊断。RUNX2基因测序结果核酸序列同源性比较分析（Blastn）发现在Exon2上发现插入TG碱基突变,突变型为c.309310insTG。患者姐姐及父母无明显CCD临床表现,患者姐姐基因组DNA未发现RUNX2突变位点,为散发病例。 结论：发现RUNX2基因c.309310insTG突变位点为该患者的致病基因突变位点,而且该位点为首次检出的新的突变位点。 第二章RUNX2+/m人牙囊细胞的分离培养和鉴定 目的：建立携带RUNX2基因突变位点c.309310insTG的人牙囊细胞体外培养体系RUNX2+/m HDFC。 方法：选取CCD患者埋伏恒牙的牙囊作为实验组（RUNX2+/m）,要求恒牙上方没有滞留乳,牙囊完整；对照组：牙位、年龄、性别与实验组匹配的正常人埋伏恒牙牙囊,牙囊完整。运用组织块法对两组牙囊进行体外原代、传代培养,第3代细胞制备细胞爬片进行波形丝蛋白和角蛋白免疫细胞化学染色鉴定其细胞来源。选取CCD患者（RUNX2+/m）及正常对照组（RUNX2+/+）第3代牙囊细胞（DFCs）,使用Trizol一步法分别提取细胞内总RNA,紫外分光光度计测量所抽提的RNA浓度和纯度,反转录成cDNA, PCR扩增RUNX2序列,测序并行BLAST核酸序列同源性比较分析,验证全血基因组测序结果。取两组细胞cDNA,用SYBR Green实时定量PCR法检测RUNX2基因mRNA表达量,计算相对表达量。裂解两组牙囊细胞,BCA法行总蛋白定量,变性蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,半干法转膜,封闭、杂交,ECL化学发光及图像采集分析,计算灰度值。 结果：组织块法成功体外培养人牙囊细胞,细胞呈长梭形、纺锤形、不规则三角形,随着培养时间的增加,细胞增殖呈放射状,实验组和对照组原代牙囊细胞生长状况和形态相似。经差速消化法传代排除上皮细胞的混杂,到第2代时已不见上皮细胞存在。免疫细胞化学检测示两组牙囊细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。所提取基因组DNA的浓度均约为10μg/ml,大小约20Kb,OD260/OD280>1.8,获得的基因组DNA的浓度、长度、纯度可以满足PCR反应要求。基因8个外显子的PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,在Marker的相应大小处均有相应条带。实验组患者的RUNX2基因测序结果核酸序列同源性比较分析（Blastn）发现在Exon2上发现插入TG碱基突变,突变型为c.309一310insTG。该突变导致第104位的谷氨酸GAG（W）移码突变为色氨酸TGG（W）,并在第

关键词： 医学遗传学  

ISBN: (纸本)9787030370013

摘要： 本书共15章，包括细胞生物学知识、遗传学和各类遗传病的基础知识、群体中的基因、肿瘤遗传学、药物与遗传等。

关键词： 细胞生物学   教学改革  

摘要： 细胞生物学课程具有综合性、抽象性、复杂性和知识更新快的特点。细胞生物学课程组始终以现代化教育理念为指导,不断对细胞生物学课程教学的内容、方法、手段和教学模式等方面进行改革,以适应社会经济发展对复合型、创新性人才的需求。

关键词： 肝癌   Sonichedgehog信号通路   Smo基因   siRNA RNAi  

摘要： 肝癌是世界常见恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocelluarcarcinoma，HCC)是最主要的类型，其特点是侵袭力强、易转移、预后差，它由多种基因参与，涉及多条信号通路。在我国，肝癌发病率极高，约占全世界的42.5%。自20世纪90年代以来，我国肝癌死亡率为20～40/10万，高居癌症死亡率的第2位，且5年生存率极低。大量实验证明，肝癌的发生是由多种基因参与，涉及多条信号通路的多步骤、多阶段的发生过程，但目前发病机制尚不清楚。且对于肝癌的早期诊断及治疗也缺乏有效的手段。通过对肝癌相关的基因研究，不仅可以进一步明确肝癌的发生机制，以及提供新的靶向生物治疗肝癌。近年来，研究发现很多在胚胎发育、组织分化过程中起调控作用的信号通路同样在肿瘤发生的过程中发挥着重要的作用，其中包括Sonichedgehog信号通路、EGFR信号通路、TGF-β信号通路、Wnt信号通路等。这些通路的发现和研究，为肿瘤发生机制的研究及新的治疗途径提供了新方向。 Smoothened(Smo)蛋白是Sonichedgehog信号通路中的信息转换器，能够把细胞外的SHh信号转换成细胞内的Glil信号，从而启动细胞核内基因的转录，对Sonichedgehog信号通路具有激活作用。正常组织和细胞中，Smo不表达或低表达，维持细胞正常代谢需要。当Smo过表达时，可异常激活Hedgehog通路，产生大量促癌因子，使细胞发生转化和恶变。研究表明，Smo在一些人类肿瘤，如恶性胶质瘤、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、基底细胞癌等组织中高表达。有学者认为，Smo有望成为肿瘤基因治疗的新靶点和早期诊断、评估预后的新指标。 本课题拟应用Westernblot及半定量RT-PCR技术，旨在观察Smo基因在肝癌HepG2细胞中的表达及其对肝癌HepG2细胞影响的作用。RT-PCR及Westemblot检测肝癌HepG2细胞中Smo基因的表达；利用RNAi技术siRNA脂质体介导转染肝癌HepG2细胞，MTT法和流式细胞仪检测肝癌HepG2细胞smomRNA被降解后对细胞的影响。探讨Smo基因在肝癌细胞增殖和凋亡过程中的作用。目的：探讨Smo基因在肝癌细胞增殖和凋亡过程中的作用及与肝癌的关系，为Smo基因在Sonichedgehog信号通路上能否靶向治疗肝癌提供实验依据。 材料和方法： 1.细胞来源：本实验所使用的人肝癌HepG2细胞株由安徽医科大学老师赠与。试剂：Trizol（总RNA提取试剂异硫氰酸胍)、FSK-100(RT-PCR试剂盒)、兔抗人Smo浓缩型多克隆抗体（一抗）、Annexin-V凋亡检测试剂盒、辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体(二抗)、MTT等。主要设备：C02恒温孵育箱、PCR扩增仪、流式细胞仪、转印电印电泳槽、DYY-B型电泳仪。 2.实验方法：(1)细胞培养:HepG2细胞在培养基(含1.0mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸和1.5克/升碳酸氢钠的EMEM，添加10%胎牛血清。)于37℃、5％CO2孵箱中培养，实验所用细胞均处于对数生长期。（2）RT-PCR检测肝癌HepG2细胞SmomRNA的表达（3）Westernblot检测HepG2细胞Smo蛋白的表达（4）siRNA序列的设计与合成：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3，及1对非特异性siRNA（5）细胞转染及siRNA筛选：分成A、B、C、D、E五组：A组为转染特异性siRNA-1组，B组为转染特异性siRNA-2组、C组为转染特异性siRNA-3组，D组为阳性对照组(转染非特异性siRNA)，E组为阴性对照组(转染时只加Lipofectamine，不加任何siRNA)，每组设6个重复孔。(6)RNAi技术分别将SmosiRNA转染入各组人肝癌HepG2细胞内；(7)RT-PCR技术检测转染48小时后各组细胞的SmomRNA表达，比较3组特异组表达的效果，筛选出抑制最有效的siRNA，后继实验中均以该特异性siRNA转染的细胞为实验组；(8)再将HepG2细胞分成实验组、阳性对照组、阴性对照组，每组设6个重复孔进行转染；（9）噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡率；（10）统计学方法分析：数据采用SPSSl8．0软件进行统计分析。 结果： l、Westernblot及半定量RT-PCR结果显示发现人肝癌HepG2细胞内有Smo蛋白及SmomRNA的高表达。 2、按照分组，转染48h后，RT-PCR结果显示：siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组及阳性对照组与阴性对照组的HepG2细胞的SmomRNA表达水平有显著性差异(F=382.0，P<0．001)，s

关键词： Stem Cells   Adult Stem Cells   Wound Healing   Transforming Growth Factor beta   Biological Science Disciplines   superfamily   ambient environment   Microenvironments   cytology   perturbation  

摘要： To rejuvenate tissues and/or repair wounds, stem cells must receive extrinsic signals from their surrounding environment and integrate them with their intrinsic abilities to self-renew and differentiate to make tissues. Increasing evidence suggests that the superfamily of transforming growth factor-beta s (TGF-beta s) constitute integral components in the intercellular crosstalk between stem cells and their microenvironment. In this review, we summarize recent advances in our understanding of TGF-beta superfamily functions in embryonic and adult stem cells. We discuss how these pathways help to define the physiological environment where stem cells reside, and how perturbations in the signaling circuitry contribute to cancers.