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关键词： 细胞生物学   Cell Sinaling Technology   学报   连续出版物   中华人民共和国  

摘要： 为了促进中国细胞生物学基础科学研究的发展,鼓励细胞生物学基础研究科研人才的储备及培养,美国Cell Signaling Tehnology暨赛信通(上海生物试剂有限公司)与《中国细胞生物学学报》联合推出"细胞生物

关键词： 镉染毒   肝胰腺   线粒体损伤   细胞生物学  

摘要： 本文采用显微技术和透射电镜技术,观察了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)在不同镉浓度和处理时间下肝胰腺组织细胞的病理学变化;利用TUNEL技术、比色法、电镜细胞化学技术、酶组织化学和激光共聚焦手段,检测了肝胰腺组织细胞中的凋亡率,caspase-3、caspase-8、caspase-9活性,琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和钙ATP酶(Ca2+-ATPase)的活性,细胞浆和线粒体内细胞色素c(cyt c)的含量,线粒体膜电位(Δψm)的变化;利用基因克隆、实时荧光定量PCR技术等手段,检测了热休克蛋白70(HSP70)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(CCO-Ⅰ)mRNA的表达,从机体对损伤应答的角度探讨了镉离子对肝胰腺组织的毒性作用机制。实验设对照组和五个镉离子浓度组(3.56,7.12,14.25,28.49和56.98 mg/L),进行体外染毒,处理时间为24,48,72和96h。本研究主要内容包括：　　⑴镉对河南华溪蟹肝胰腺组织细胞的形态学改变。肝胰腺组织发生细胞水肿、凋亡和坏死性凋亡,损伤程度随染毒时间延长和染毒浓度增加而加重。水肿的细胞在各染毒组中均有不同程度出现,表现为体积增大、胞浆淡染,严重时造成细胞死亡。染毒48和72 h时,光镜下可观察到较多的细胞凋亡,而在56.98 mg/L浓度组出现明显的细胞连续性中断、坏死及血淋巴细胞浸润。凋亡的细胞体积变小,胞浆嗜酸性增强,细胞核固缩、深染。同时,透射电镜观察到典型的凋亡小体:细胞核皱缩,染色质凝集在核膜下,胞浆中各细胞器基本消失,只留有少许线粒体。细胞核和线粒体出现明显损伤,线粒体肿胀、膜破裂、嵴变短变少,甚至消失,线粒体呈双层膜囊泡状改变。溶酶体数量增多,出现较多巨大的吞噬大量自身成份的自噬溶酶体。细胞衣和P/Ca颗粒随染毒浓度增加而逐渐消失。高镉浓度组中粗面内质网和高尔基复合体形态结构明显改变。　　⑵镉诱导河南华溪蟹肝胰腺组织出现细胞凋亡与线粒体损伤：镉染毒24h,随着浓度的增加凋亡指数明显增高,SDH、Δψm、线粒体内cyt c含量、Ca2+-ATPase活性逐渐增加。SDH与Δψm、线粒体内cyt c,Δψm与线粒体内cyt c含量,Ca2+-ATPase与Δψm之间有正相关关系。但是胞浆中cyt c含量无明显变化(p>0.05);镉染毒48 h,AI显著增加(p<0.05)。caspase-3、caspase-9、SDH活性、线粒体内cyt c含量、Δψm、Ca2+-ATPase活性随镉浓度的增加而显著增加(p<0.05),并在最高浓度组达到最大。caspase-3与caspase-9,caspase-3与AI、SDH的活性,线粒体内cyt c含量与Δψm,Δψm与SDH,SDH与Ca2+-ATPase,Ca2+-ATPase与线粒体内cyt c含量之间有正相关关系。胞浆中cyt c含量无明显变化(p>0.05);镉染毒72 h,AI显著增加(p<0.05)。caspase-3、caspase-9、SDH活性、Δψm、Ca2+-ATPase活性伴随染毒浓度的增加先增后降。电镜细胞化学技术显示,SDH主要位于线粒体嵴上,随染毒浓度增加其活性先增后降。线粒体内cyt c含量在56.98 mg/L组显著降低(p<0.05)。caspase-3和caspase-9的活力在3.56、7.12和14.25 mg/L浓度组显著增高(p<0.05),之后活性逐渐降低到对照组水平,二者之间存在正相关关系。但是,它们与AI没有相关性(p>0.05)。caspase-3、caspase-9与SDH,SDH与Δψm、Ca2+-ATPase之间存在正相关关系。Δψm在7.12 mg/L组显著性最高(p<0.05),而在56.98 mg/L组显著性最低(p<0.05)。此时,AI从28.49 mg/L组的23％骤增到56.98 mg/L组的32.9%,Ca2+-ATPase在3.56、7.12和14.25 mg/L组显著增加(p<0.05)。Δψm与Ca2+-ATPase、线粒体cyt c含量之间有正相关关系。可是,胞浆中cyt c含量虽然没有明显变化(p>0.05),但是随着浓度的增高有增多的趋势;镉染毒96 h,SDH活性、Δψm、线粒体内cyt c含量、Ca2+-ATPase活性随染毒浓度增加先增后降,且均在56.98 mg/L组受到显著抑制(p<0.05)。随镉浓度增加,AI显著增加(p<0.05),从28.49 mg/L组的45.5%骤增到56.98 mg/L组的64.4%。SDH与Δψm、线粒体内cyt c、Ca2+-ATPase活性,线粒体内cyt c含量与Δψm、Ca2+-ATPase活性,Δψm与Ca2+-ATPase活性之间有正相关

关键词： 髁突软骨细胞   鼻中隔软骨细胞   软骨形成   生物学特性  

摘要： [目的]建立SD乳鼠髁突软骨细胞(mandibular condylar chondrocyte,mcc)和鼻中隔软骨细胞(nasal septal chondrocyte, nsc)原代培养模型,观察髁突软骨细胞和鼻中隔软骨细胞生物学特性的差异,为探讨髁突软骨和鼻中隔软骨的形成过程和在颌面部生长发育中的作用机制提供理论基础。 [方法]用机械分离和酶联消化法将出生1-3天SD乳鼠的髁突软骨细胞和鼻中隔软骨细胞在相同培养条件下进行原代培养,分别在培养第3天、5天、8天、15天在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞并观察两种软骨细胞外基质的合成。噻唑蓝(methyl hiazolyl tetraxolium, MTT)比色法绘制两种细胞的生长曲线。划痕实验观察两种细胞划痕24h后细胞迁移的能力。实时荧光定量PCR (real time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测上述四个时间点软骨细胞外基质中Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen, Col Ⅱ)和聚集蛋白多糖(aggrecan, AGG) mRNA的表达。 [结果]采用相同的消化方式及培养条件成功培养出原代髁突软骨细胞和鼻中隔软骨细胞,其形态学和生物学特性均符合软骨细胞特性。两种软骨细胞在第5天、8天、15天时进行Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色,染色结果均呈阳性,证实培养的细胞为所需的软骨细胞。两种软骨细胞染色阳性率分别随培养天数增加而逐渐增强；相同时间点,两种染色中鼻中隔软骨细胞阳性表达均高于髁突软骨细胞。MTT比色法检测出两种软骨细胞的生长曲线基本一致,鼻中隔软骨细胞的增殖能力较髁突软骨细胞强。两种软骨细胞划痕后24h观察到鼻中隔软骨细胞迁移至划痕处的数量明显较髁突软骨细胞多,说明鼻中隔软骨细胞的迁移能力强于髁突软骨细胞。两种软骨细胞在培养第3天、5天、8天、15天时对细胞外基质中的Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达进行检测,发现两种软骨细胞Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达量在前三个时间点均随细胞培养时间的增加而增高,第15天时Ⅱ型胶原、aggrecan mRNA的表达量下降；相同时间点鼻中隔软骨细胞合成Ⅱ型胶原、aggrecan的能力均高于髁突软骨细胞。 [结论]1.本实验采用相同的消化方式及培养条件成功建立了SD乳鼠髁突软骨细胞和鼻中隔软骨细胞的原代培养模型；2.鼻中隔软骨细胞的增殖和迁移能力均强于髁突软骨细胞；3.髁突软骨细胞和鼻中隔软骨细胞Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达变化与体内胚胎期软骨形成过程中Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达变化基本一致,鼻中隔软骨细胞Ⅱ型胶原和aggrecan的表达量多于髁突软骨细胞,提示这两种软骨细胞外基质的差异是导致两种软骨的功能特性及对局部生物力学的反应不同的原因之一。髁突软骨细胞和鼻中隔软骨细胞在增殖、迁移以及细胞外基质表达方面均存在差异,这些可能与髁突软骨和鼻中隔软骨形成机制和生长特性的不同密切相关。

关键词： 瘢痕疙瘩   自分泌运动因子   成纤维细胞   生物学特征  

摘要： 目的：观察自分泌运动因子（autocrine motility factor，AMF）对体外培养的人真皮及瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性（包括细胞增殖、抗凋亡和迁移运动）的影响。 方法：对2011年11月至2012年6月间重庆医科大学附属第一、第二医院接受包皮切除术患者10例和接受瘢痕疙瘩切除术患者9例，分别取其切除部位的真皮和瘢痕疙瘩组织，提取两种组织的成纤维细胞。将培养的人真皮及瘢痕疙瘩成纤维细胞均分为AMF实验组和空白对照组。采用MTT法、流式细胞术和Transwell小室迁移运动模型分别检测两组细胞的增殖活性、细胞周期及细胞凋亡情况和细胞迁移运动能力。探讨AMF实验组和空白对照组之间成纤维细胞生物学活性特点和关系。 结果：经4-5周原代培养后，其中人真皮组织8例及瘢痕疙瘩组织4例成功培养出成纤维细胞。AMF实验组体外人真皮和瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力（0.709±0.028；0.800±0.018）均高于对照组（0.610±0.024；0.705±0.018）（t=9.13，p＜0.001；t=16.086，p＜0.001），细胞凋亡率（5.11±0.30；4.93±0.19）%均低于对照组（13.40±0.64；9.63±0.37）%（t=30.94，p＜0.001；t=26.221，p＜0.001），细胞运动迁移能力（71.9±4.5；161.2±5.3）高于对照组（50.2±5.9；122.7±4.6）（t=5.35，p＜0.001；t=15.668，p＜0.001）。空白对照组中，人瘢痕疙瘩成纤维细胞的抗凋亡能力和运动迁移能力均强于真皮成纤维细胞（p＜0.05）。 结论：人瘢痕疙瘩成纤维细胞的抗凋亡能力，运动迁移能力强于真皮成纤维细胞。AMF具有提高正常人体真皮及瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、运动迁移和抗凋亡能力的作用，提示该因子与瘢痕疙瘩的肿瘤学特征有密切关系，为进一步研究瘢痕疙瘩的发病机制和治疗靶点提供了新的思路和方向。

关键词： 生物医学   成纤维细胞   低温冻存   细胞生物学  

摘要： 目的：本实验针对人参总皂甙改善玻璃化法冻存成纤维细胞进行了实验研究，初步探讨人参总皂甙作为冷冻保护剂减少细胞在低温冻存中受到了损伤，以期为低温细胞冻存提供一个新的方式。同时通过对具有与肌腱细胞相似生物学性状的成纤维细胞的深低温冻存的研究，为寻找最佳组织工程化肌腱种子细胞及肌腱的深低温冻存液配方提供参考。\n 方法：在玻璃化液(10％二甲基亚砜+15％小牛血清+75％DMEM)中加入人参总皂甙使其浓度为0μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，75μg/ml，100μg/ml，依次为玻璃化液1、2、3、4、5，利用上述5种玻璃化液液氮冻存小鼠L929成纤维细胞30天后复苏，显微镜下观察细胞大体形态，电镜下观察细胞超微结构，对bax,bcl-2一对促凋亡与抑制凋亡蛋白的研究，以流式细胞仪分别检测玻璃化液及2、3、4、5及不含人参总皂甙的玻璃化液1冻存后的细胞凋亡率。玻璃化液冻存30天后解冻的细胞为实验组，未冻存的同代次的细胞对照组。\n 结果：人参总皂甙浓度为50ug/ml、75ug/ml、100ug/ml的玻璃化液3、4、5冻存—复苏后的细胞存活率分别为高于人参总皂甙浓度为0ug/ml的玻璃化液1冻存组，差别具有显著统计学意义(P＜0.01)，玻璃化液3、4、5冻存后细胞存活率组间比较无统计学意义(P＞0.05);玻璃化液3冻存—复苏后的小鼠L929细胞凋亡率比玻璃化液1冻存后复苏细胞的凋亡率低，具有统计学意义(P＜0.05);显微镜下观察到实验组细胞细胞形态大体完整，排列紧密。电镜下实验组细胞核仁明显，大而清晰，各细胞器的功能旺盛。\n 结论：通过对同肌腱细胞具有相似生物学活性的成纤维细胞研究发现人参总皂甙能提高玻璃化液冻存组织工程化肌腱种子细胞存活率;人参总皂甙能抑制玻璃化液冻存组织工程化肌腱种子细胞时细胞凋亡的发生;人参总皂甙能改善玻璃化液冻存组织工程化肌腱种子细胞效果。

关键词： Rap1GAP   增殖   分化   凋亡   侵袭   MMP-9   AML  

摘要： 目的和意义 Rap1GAP属于GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins, GAPs）家族，在Rap1这种小G蛋白GTP-GDP循环中起到重要作用。鸟苷酸交换蛋白（Guanine nucleotideexchange factors, GEPs）使Rap1由结合GDP的非活性状态转化为结合GTP的活性状态，而Rap1GTP的内在水解酶活性很低，需要GAPs加速GTP的水解，使活化的下游信号及时终止。Rap1（Ras-proximate1）是Ras家族中的一员，通过MEK/ERK途径影响细胞的增殖和分化；并调节integrins介导的细胞粘附和迁移，许多研究表明Rap1和肿瘤的关系密切，其上游调节分子也参与了肿瘤的发生发展。近年来在胰腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤的研究中发现，Rap1GAP在这些肿瘤中表达下调，并且和肿瘤细胞的增殖、迁移相关，Rap1GAP被认为有可能是一潜在的抑癌基因。本实验室的前期研究发现Rap1GAP可能在骨髓增生异常综合征（Myelodysplasticsyndromes, MDS）发病机制中起作用。本试验拟通过构建Rap1GAP慢病毒表达载体转染急性髓系白血病细胞株和动物体内模型来研究Rap1GAP对白血病细胞生物学特性的影响，探讨Rap1GAP在急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia, AML）发病机制中的作用。 方法 第一部分实时定量PCR检测AML患者、非恶性肿瘤血液病患者骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells, BMNCs）以及AML细胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）Rap1GAP mRNA表达水平，Western Blot检测Rap1GAP蛋白表达水平；用含有BamHI酶切位点的上下游引物将Rap1GAP cDNA克隆至含有黄绿色荧光蛋白（Flavovirens fluorescent protein, YFP）的慢病毒表达载体pRRL-Venus，磷酸钙共沉淀法在293T细胞中进行四质粒系统病毒包装，收集病毒颗粒转染HL-60和NB4细胞，流式分选YFP阳性细胞，有限稀释法筛选出高表达Rap1GAP单克隆阳性细胞株（H1、H2和N1、N2）；MTT法和体外集落培养检测Rap1GAP对细胞增殖能力影响；ATRA和TPA诱导HL-60细胞分化，ATRA诱导NB4细胞分化，24h、48h和72h进行NBT还原试验和流式检测细胞表面抗原CD11b，观察Rap1GAP对细胞分化能力影响；As2O3诱导HL-60和NB4细胞凋亡24h，荧光显微镜观察Rap1GAP对细胞凋亡能力影响；体外跨膜实验和明胶酶谱检测Rap1GAP对细胞体外侵袭力影响。 第二部分对4周龄的BALB/c裸鼠进行切脾、环磷酰胺腹腔注射及全身亚致死剂量辐照等预处理后随机分空白对照组（n=5）和实验组（HL-60组、空载体MOCK组、R1组、R2组，每组n=8）。空白对照组经尾静脉注射0.2ml IMDM，实验组经尾静脉接种1.2×10～7含不同细胞的IMDM液0.2ml，后在层流柜中无菌饲养观察至接种后60天。于裸鼠濒死前或死亡后即行解剖，留取骨髓涂片，瑞氏染色观察有无异常的白血病细胞；各脏器常规病理切片，观察异常白血病细胞在各脏器中的浸润情况；RT-PCR检测裸鼠各脏器中人白血病细胞Rap1GAP和MMP-9基因的表达。 结果 第一部分①在BMNCs中，AML患者Rap1GAP的mRNA表达水平低于非恶性肿瘤血液病患者（P<.05）。Rap1GAP在AML细胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）中转录和蛋白水平呈较低表达。②成功构建慢病毒表达载体pRRL-Venus-Rap1GAP，包装出高滴度病毒颗粒，流式检测转染靶细胞效率为80%-90%。RT-PCR和WesternBlot鉴定转染Rap1GAP cDNA的单克隆细胞株HL-60（H1、H2）和NB4（N1、N2）均有外源性Rap1GAP基因的整合和表达。单克隆细胞株H1、H2和N1、N2的Rap1GAP mRNA表达水平各增加16.2、17.3倍和17.5、19.3倍，Rap1GAP蛋白表达水平亦显著增高，Rap1-GTP蛋白显著降低。③细胞生长曲线和体外集落培养亦证实Rap1GAP不影响白血病细胞株HL-60和NB4细胞增殖能力，Western Blot未检测到ERK和p-ERK在Rap1GAP高表达细胞和空载体对照细胞之间的差异。④ATRA诱导HL-60分化过程中，H1和H2单克隆细胞组CD11b表达高于空载体转染对照组，CD11b表达为对照组1.4到2.1倍，24h时CD11b表达差异最为显著。NBT还原

关键词： 终板软骨细胞   Sox9   Ⅱ型胶原   蛋白聚糖   椎间盘退变  

摘要： 背景 椎间盘退行性变导致的椎间盘疾病是临床上引起患者颈腰部及四肢疼痛的常见原因,传统的保守及手术治疗效果往往不理想。如果能从椎间盘退变的初始环节进行人为的干预,阻断甚至逆转椎间盘退变,将会为椎间盘退变性疾病提供良好的治疗途径。目前多名学者已证实Sox9基因可调控Ⅱ型胶原及软骨的合成,是Ⅱ型胶原及软骨合成的一种关键因子。椎间盘组织是由中间的髓核、外围的纤维环和上下软骨终板组成,其中软骨终板是椎间盘的重要构成,在髓核的营养交换及椎间盘的应力缓冲保护等方面,它起重要作用,椎间盘的营养物质主要是由软骨终板弥散到髓核和内层纤维环组织的。有多名学者提出椎间盘退变的始动环节是由于软骨终板的退变,功能下降及钙化引起的。徐宏光等通过在体外建立大鼠终板软骨细胞自然退变模型,研究探讨了终板软骨细胞在自然退变的过程中Sox9基因的变化和作用,对终板软骨细胞的分化和发育起关键作用的Sox9mRNA的表达随着年龄的增长受到了明显的抑制,导致Ⅱ型胶原的mRNA表达下降,Ⅱ型胶原蛋白的合成和代谢发生紊乱。Ⅱ型胶原蛋白是维持软骨终板和椎间盘功能的重要成分,它的减少可以导致终板软骨细胞外基质成分和结构的变化,从而引起软骨终板发生退变。 随着细胞生物学、分子生物学和组织工程学的飞速发展,对IVDD的治疗有了新的手段,包括基因疗法、生长因子疗法、细胞疗法以及干细胞移植等,这些治疗方法统称为生物学治疗方法,生物学治疗方法大部分是针对椎间盘的治疗,阻断或逆转髓核、纤维环的退变,来达到治疗的目的,已有多名学者将Sox9基因转染到椎间盘髓核和纤维环组织中,观察其生物学效应,但尚无学者将外源性Sox9基因转染到终板软骨细胞并观察其生物学效应。本实验是通过将外源性Sox9基因转染到终板软骨细胞,观察其对蛋白聚糖和Ⅱ型胶原合成的影响。以达到减缓或阻断、甚至逆转椎间盘退变的目的,从椎间盘退变的始动环节延缓或阻止椎间盘的退变,为Sox9基因治疗软骨终板的退变提供理论依据。 目的 分离兔终板软骨细胞并体外培养；腺病毒体外转染终板软骨细胞,观察Sox9基因对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成的影响,进一步为椎间盘退变提供基因治疗方法,减缓椎间盘退变的时间和进程,从而为防治椎问盘退变提供一定的理论依据。 方法 采用第二代终板软骨细胞,随机分为三组,1、对照组：不做任何处理,2、空腺病毒组：转染不含Sox9的腺病毒,3、AdSox9基因转染组：转染AdSox9基因。腺病毒载体AdSox9成功感染了体外培养的兔终板软骨细胞,用RT-PCR技术检测病毒感染前后Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因1mRNA的表达的变化。 结果 腺病毒AdSox9成功感染终板软骨细胞后48h,RT-PCR结果显示对照组、空腺病毒组及AdSox9转染组均检测到了Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达,而AdSox9感染的终板软骨细胞组中,检测到了Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因]mRNA的显著表达。AdSox9转染组与对照组和空腺病毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),组间比较应用LSD-t检验,结果显示对照组和空腺病毒组比较无统计学意义,AdSox9转染组与空腺病毒组及对照组两两比较均有显著性差异(P<0.05),以上结果表明,重组腺病毒介导的Sox9基因显著增加了蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的mRNA的表达。 结论 Sox9基因有促进终板软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的能力；Sox9基因能够防治终板软骨细胞的退变,从而在始动环节为基因治疗椎间盘退变增加了新的理论依据。

关键词： Id基因   子宫内膜癌   RNA干扰   腺病毒   增殖   侵袭   迁移   粘附  

摘要： [研究背景] 分化抑制因子(inhibitor of DNA differentiation, Id) Id蛋白可与碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix)转录因子作用,形成非活性异二聚体,阻止bHLH与靶基因DNA上的E启动子结合,间接地抑制分化相关基因的表达,影响肿瘤细胞的生长、血管形成、侵袭及转移能力,其中Id1/Id3具有许多重叠效益,在促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移方面具有协同作用,被认为是与肿瘤侵袭性相关的上游调控基因。 近年来,基因治疗、靶向治疗作为肿瘤治疗的新生代模式日益受到重视。但目前对于子宫内膜癌的治疗还没有发现特有效的特异性标志物,对于生长转移的分子机理也缺乏一定的了解。关于Id1/Id3基因与子宫内膜癌发生、发展及侵袭转移的关系还没有相关研究。我们希望借此研究子宫内膜癌生物学行为的发生、发展及浸润转移机制,寻找一种新的治疗策略。 [研究目的] 检测Id1/Id3在子宫内膜癌组织中的表达情况。利用RNA干扰技术构建Id1/Id3双敲低腺病毒并感染人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B和RL-952,通过观察Idl/Id3双敲低后,对MMP2, CXCR4和P21在基因水平和蛋白水平的影响,推测Idl/Id3与P21、MMP2和CXCR4的关系,以及是否参与它们介导的细胞存活、细胞增殖或趋化相关信号转导通路,研究子宫内膜癌细胞的浸润、增生及转移的机制。重点探讨双敲低Idl/Id3基因对子宫内膜癌细胞增殖能力、侵袭能力、迁移能力及粘附能力的影响,阐明Idl/Id3基因在子宫内膜癌生长转移中的生物学作用,检验干扰Idl/Id3是否可以有效治疗子宫内膜癌,为临床诊断和治疗提供理论依据。 [研究方法] 1. Western blot检测Id1、Id3在子宫内膜癌组织内表达： 将随机挑选的南方医科大学南方医院妇产科2011年6月-2011年10月住院手术的4例子宫内膜癌患者新鲜组织及相应的癌旁组织提取全蛋白,根据BCA蛋白定量试剂盒进行定量,测定其在562nm处的吸收值(A562)。计算各浓度蛋白标准的平均吸光度,绘制标准曲线,计算回归方程。提取的总蛋白,加入2xSDS蛋白上样缓冲液(按1：1比例),100℃煮沸5min,-20℃保存备用。Western blot方法检测后观察凝胶图像,应用Adobe Photoshop图像软件扫描Western blot凝胶图片,得到相应灰度值,观察4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中的Idl/Id3的表达。 2. qRT-PCR检测不同腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC-1-B和RL-952细胞株后Id1、Id3、MNP2、CXCR4. P21mRNA水平： 实验将两株细胞各分为未处理细胞组(简写control)、空白病毒组(vector)、启动子病毒组(promoter)、Id1/Id3双敲低组(RNAi)。对四组细胞进行提取RNA、去基因组、纯度检测和电泳检测、逆转录及定量PCR操作。采用△△CT法对荧光定量PCR结果进行定量分析,计算Idl/Id3双敲低后MMP2、CXCR4、P21的表达抑制率。 3. Western blot检测不同腺病毒载体感染子宫内膜癌HEC-1-B和RL-952细胞株后Idl、Id3、MMP2、CXCR4、P21蛋白表达量： 对每株细胞的各四组细胞提取全蛋白,具体步骤同前。4.噻唑蓝(MTT)比色实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞增殖能力的影响： 对RL-952及HEC-1-B细胞株各四组细胞加入MTT后,以空白对照孔调零,酶联免疫监测仪上490nm测定各孔光吸收值(D值)。各组取三孔平均值,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。 5.移行小室(Transwell)侵袭实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞侵袭能力的影响,一般随机选取6个高倍视野计数穿过膜的细胞数。 6.细胞划痕实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞迁移能力的影响：按0h,6h,12h,24h,48h取样,以未处理的细胞为对照,拍照后使用phoshop的标尺测量致伤区域的像素。7.细胞粘附实验检测不同重组腺病毒载体感染子宫内膜癌细胞株RL-952和HEC-1-B后对细胞粘附能力的影响：细胞拍照后经过MTS法处理,每小组做6个复孔。 8.统计学处理 采用SPSS14.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,4例子宫内膜癌组织及相应的癌旁组织中Id1/Id3表达的比较采用两独立样本t检验,其余实验组间比较采用ANOV

关键词： 胃肿瘤   KAI1基因   抑癌基因   基因转染   ARTN   血管内皮生长因子   侵袭转移   临床  

摘要： 目的： 研究KAI1基因对胃癌细胞增殖、侵袭转移等生物学特性的作用及其机制，探讨它的表达与胃癌临床病理特征的关系。同时检测ARTN、VEGF的表达，寻找它们与胃癌临床病理特征以及与KAI1之间的关系，明确它们的临床价值。 方法： 用基因转染法将KAI1基因转入人胃癌细胞中，用RT-PCR法检测转染后的KAI1mRNA表达，用MTT法检测细胞增殖活性，用Transwell小室法检测细胞迁移能力及侵袭能力。应用免疫组织化学S-P方法，检测胃癌标本中KAI1蛋白、ARTN、VEGF蛋白，同时结合患者的相关临床病理指标用PEMS3.1统计软件进行统计学分析。 结果： RT-PCR结果显示KAI1基因转染的胃癌细胞的KAI1mRNA表达明显提高，MTT法检测细胞增殖能力、Transwell小室法检测细胞迁移能力和侵袭能力均明显下降。KAI1蛋白在胃癌组织中的阳性率为23.3%,与分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)，ARTN蛋白表达与胃癌患者的肿瘤浸润程度、TNM分期及淋巴结转移有密切关系(P<0.05)，且ARTN蛋白与VEGF蛋白表达呈正相关，均与KAI1蛋白表达呈负相关。 结论： KAI1基因可抑制胃癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力，与胃癌的分化、浸润深度、转移及临床分期有关，可用来评估胃癌的临床分期和指导其治疗，对胃癌的发生发展起到了重要作用。胃癌组织中ARTN蛋白表达与肿瘤的侵袭转移密切相关，与VEGF蛋白表达呈正相关，均与KAI1蛋白的表达呈负相关，可以作为临床评价胃癌进展和患者预后的指标之一。

关键词： Olig2基因   羊膜上皮细胞   少突胶质细胞   细胞生物学  

摘要： 目的：观察Olig2基因过表达rAECs向少突胶质细胞分化情况。　　方法：从妊娠14～16d的SD大鼠胎盘中剥离羊膜，用胰蛋白酶消化法进行大鼠羊膜上皮细胞原代培养，使用Nestin、CD29和CD44等抗体通过免疫细胞化学和流式细胞术对细胞进行生物学鉴定。以新生大鼠脊髓组织中提取的总RNA为模版，采用RT-PCR方法获得目的基因片段。通过公司构建Olig2质粒并进行测序验证。使用脂质体法将重组体pEGFP-N1-Olig2转染rAECs，利用免疫细胞化学法检测转染后rAECs中Olig2蛋白和少突胶质细胞蛋白4(oligodendrocyte4，O4)的表达水平，结果采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据以“均数±标准差”(means±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-Way-ANOVA)，多个实验组和一个对照组比较采用最小显著差法(LSD)。P≤0.05表示差异有统计学意义。　　结果：1.培养的大鼠羊膜上皮细胞表达神经前体细胞特异性蛋白Nestin和骨髓间充质干细胞表面标记蛋白CD29和CD44，但是未成熟神经元标记蛋白β-Ⅲ-tublin、星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)以及造血干细胞表面标记蛋白CD34表达阴性。2.成功构建过表达重组体pEGFP-N1-Olig2，测序分析证实了序列的正确性。3.免疫荧光细胞化学证实pEGFP-N1-Olig2成功转染rAECs;与对照组比较Olig2和少突胶质细胞标记蛋白O4阳性表达细胞增多，差异有统计学意义(P＜0.01)。　　结论：Olig2过表达rAECs可向少突胶质细胞分化，为进一步的细胞移植治疗脊髓损伤引起脱髓鞘病变提供理想种子细胞。