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关键词： 牙脱位   牙周膜   器官保存液   谷胱甘肽  

摘要： 背景 牙齿外伤为儿童和青少年常见的口腔颌面部损伤之一,其发生率为15-21%,而牙脱位(美国儿科牙学会将其定义为“牙齿完全从牙槽窝中移位”)是牙齿外伤中最严重的一种,约占恒牙外伤的16%。当牙脱位时,除了牙周膜(periodontal ligament, PDL)完全撕裂外,还伴有局部牙骨质、牙槽骨和附着组织的损伤以及牙髓坏死等。牙脱位若治疗不当则很容易造成牙齿缺失,影响到伤者的面容美观和咀嚼功能,更有甚者还有可能影响到青少年伤者的心理健康发育。 治疗牙脱位的最好方法是即刻再植,即刻再植不仅能迅速恢复PDL的营养支持,而且能最大化地维持牙根面牙周膜细胞(periodontal ligament cells, PDLC)的活性和增殖能力,提高功能性愈合(functional healing, FH)的几率,进而能最大限度的保存患牙,维护牙列的完整性和美观性。虽然即刻再植治疗脱位牙能得到最好的预后,但即刻再植通常很难实现。不过,对于不能即刻再植的脱位牙则应最大限度地保存残留在牙根面上的PDLC活性,来提高脱位牙延时再植的成功率。据报道,牙根面存留的有活性的PDLC随着体外干燥时间的延长而减少,脱位牙体外干燥2h后根面几乎找不到活细胞。Cvek等的调查研究显示脱位后干燥放置15min、20～40min和60min的牙齿再植后分别有13%、40%和100%的牙齿发生了置换性吸收,而造成再植牙失败的主要原因是牙根的炎症性吸收(inflammatory resorption, IR)和置换性吸收(replacement resorption, RR)。 Andreasen JO对影响再植牙形成FH的因素进行分析后发现,对形成FH有影响的因素由强至弱依次为牙根发育阶段、体外干燥放置时间、即刻再植和体外湿保存时间。再有,许多研究结果显示与缩短口外放置时间比较,用保存介质保存PDLC活性来预防脱位牙再植后的RR和IR则更为关键。 理想的脱位牙保存介质应具有生理性渗透压和pH值、能保存PDLC的活性、粘附力和增殖能力、以及容易获得且保质期长等特性。HBSS液(Hank's balanced salt solution)是美国牙髓医师学会推荐的最佳牙齿保存液,含有细胞生存所必需的营养物质,渗透压290-320mOsm/L,pH值7.2,适宜细胞生长。但是因为在药店里无售而一直没有被广泛使用。牛奶因为含细菌量低,并且含有少量细胞生长所需的营养物质和生长因子而被广泛接受,但是它的效果是否与HBSS液一样还存在争议,有报道认为它只能在3h内保存细胞活性。器官保存液ViaSpan(?)也被研究用做PDLC的保存介质,它能有效保存唇成纤维细胞活性至168h,且在ViaSpan(?)中保存6h和12h的狗牙再植后既未发生IR,也未发生RR。虽然ViaSpan(?)毙长时间地保存细胞活性,但因价格昂贵而不适于普遍使用。Buttke TM认为ViaSpan(?)含有的还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)能分解过氧化氢,保护PDLC免受氧化损伤；他的研究也证实在添加了100U/ml过氧化氢酶的HBSS液中保存过的狗脱位牙,再植后的根面吸收率显著低于未添加过氧化氢酶的HBSS液组。 德国Dentosafe(?)公司生产了一种名为牙科急救箱的脱位牙齿保存液,被瑞士和澳洲引进放在易发生牙外伤的高风险区——中小学校,体外实验表明这种牙齿保存液能在室温下保存PDLC活性和增殖能力至48h。有报道对使用了牙科急救箱的6颗脱位牙做了长期随访,保存时间为1-53h,这些牙齿再植后全部形成了牙周膜愈合。由此可见,选择适当的保存介质湿保存脱位牙,对于保存牙根面PDLC的活性,提高再植牙的FH是非常重要的。 目前我国对脱位牙齿保存液的研究甚少,也没有商业化的脱位牙齿保存液出售,本研究目的是以HBSS液为基础,将配制的改良HBSS液与HBSS液比较,探讨其保存人PDLC生物学活性的效果,进而为研究商业化脱位牙齿保存液提供初步实验依据。 第一章人PDLC的原代培养及细胞来源鉴定 目的：体外分离培养人PDLC,对细胞来源进行鉴定。 方法： 1、分离培养人PDLC门诊收集因正畸需要拔除的无龋坏及其它牙体、牙周组织疾病的上颌或下颌前磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织,采用酶消化联合组织块法培养。消化液由3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml中性蛋白酶以体积比1：1混合而成。 2、人PDLC来源鉴定通过免疫组织化学方法检测培养细胞的波形丝蛋白和角蛋白的表达,对细胞来源进行初步鉴定。 3、绘制人PDLC生长曲线用MTS试剂测定并绘制培养的人PDLC生长曲线。 结果： 1、形态学特征：原代培养第5d即可看到细胞从组织

摘要： In response to infection or tissue dysfunction, immune cells develop into highly heterogeneous repertoires with diverse functions. Capturing the full spectrum of these functions requires analysis of large numbers of effector molecules from single cells. However, currently only 3–5 functional proteins can be measured from single cells. We developed a single cell functional proteomics approach that integrates a microchip platform with multiplex cell purification. This approach can quantitate 20 proteins from >5,000 phenotypically pure single cells simultaneously. With a 1-million fold miniaturization, the system can detect down to ∼100 molecules and requires only ∼104 cells. Single cell functional proteomic analysis finds broad applications in basic, translational and clinical studies. In the three studies conducted, it yielded critical insights for understanding clinical cancer immunotherapy, inflammatory bowel disease (IBD) mechanism and hematopoietic stem cell (HSC) biology. To study phenotypically defined cell populations, single cell barcode microchips were coupled with upstream multiplex cell purification based on up to 11 parameters. Statistical algorithms were developed to process and model the high dimensional readouts. This analysis evaluates rare cells and is versatile for various cells and proteins. (1) We conducted an immune monitoring study of a phase 2 cancer cellular immunotherapy clinical trial that used T-cell receptor (TCR) transgenic T cells as major therapeutics to treat metastatic melanoma. We evaluated the functional proteome of 4 antigen-specific, phenotypically defined T cell populations from peripheral blood of 3 patients across 8 time points. (2) Natural killer (NK) cells can play a protective role in chronic inflammation and their surface receptor—killer immunoglobulin-like receptor (KIR)—has been identified as a risk factor of IBD. We compared the functional behavior of NK cells that had differential KIR expressions. These NK cells were re

关键词： 人口老龄化   医疗知识体系   医疗思维模式   亚健康   疾病谱系   延缓衰老老年医学   中医治未病  

摘要： 中、西医在延缓老年以及应付老年病两个领域的对话,不一定是双方人在现场的对话,对话可以表现为互相从学术角度比较研究两方理论的一再延续。在长期至今的对话过程中,中医药界通常是罗列出古老历朝文献去解说中医药的实践,这些古文献同时也作为中医药现代化的理论来源与引申根据;而西方主流医学则趋向延续其传统以来采取对抗疗法的观念,并且善于引用已经深化到细胞或分子层次的实验室新知。如果采用跨学科综合分析的方法,游走于古老中医文献和现代生物化学、细胞生物学以及分子生物学的研究论文之间,还是可以发现到两种医疗思维模式确实互有差异,又其实都是从不同的方向建议人类如何解决所有血肉之躯都会遇上的共同难题。而当代中西医同处在走入人口老龄化的全球社会,双方未来的争议、对话或者互补空间,肯定是更多围绕着延缓衰老、老年医药与防病保健等相关课题。然而,当代医药研发与生产固然受到全球市场体系的商业利益驱动,陆续出现许多新成果,可是其中随之而来的负面后果也明显可见,一再为当代医药发展过程带出了许多相关人类医护权利的新议题,尤其牵涉到人类共享先进医药疗护的平等机会。因此,从中医的立场出发,确实有必要重视中医自古强调传承“仁心仁术”的仁道传统,除了注重探讨自身理论体系如何回应细胞生物学所带来的新知,甚至因而开出新路,还要考虑本身医疗知识体系的理论与实践如何从各种方向去支持人口老龄化的社会变迁,维护人类共享健康权利的福利。如果把中西医学相关延缓衰老的老年医学的对话视野提升到战略层次,放置在当代社会科学老龄社会研究的脉络去思考,还可以发现,中西医学相关延缓衰老和对治老年病的理论特征不止在决定着各自的医学思路与实践模式,两种医学各自在老年医学领域的持续发展也会冲击各种社会科学领域的现有理论。医学整体成就不仅会表现为医疗技术与相应的制度发展,也将可能给当前走向未来的老龄化社会带来超乎现有想象的改善或转变,可谓正在从医疗体系的自身进步去接近中华民族自古以来的“上医医国”理想。

关键词： 间充质干细胞   C3H10T1/2细胞   细胞间粘附分子1   实验性自身免疫性甲状腺炎  

摘要： 目的： 1.构建重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1,探讨细胞间粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)基因转染对小鼠间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)生物学特性的影响。为进一步研究ICAM-1是否影响MSCs对自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune Thyroiditis, AIT)体内治疗效果提供实验基础。 2.利用外源性甲状腺球蛋白免疫C57BL/6小鼠建立AIT的动物模型——实验性自身免疫性甲状腺炎(Experimental Autoimmune Thyroiditis, EAT),为下一步开展大规模体内实验提供稳定可靠的动物模型。 方法： 1.通过RT-PCR方法扩增获得小鼠脾细胞ICAM-1基因全长DNA,将其克隆至中间载体pMD19-T,行双酶切及DNA测序鉴定后,将ICAM-1基因连接至逆转录病毒载体MIGR1七,对重组载体MIGR1-ICAM-1进行双酶切、RT-PCR及DNA测序分析。 2.将获得的重组逆转录病毒质粒MIGR1-ICAM-1及空质粒MIGR1均加入包装质粒ECOS后分别转染人胚肾细胞(T293细胞),将获得携带ICAM-1基因的逆转录病毒MIGR1-ICAM-1及空载体逆转录病毒MIGR1,分别感染C3H10T1/2细胞,荧光倒置显微镜下观察荧光蛋白的表达, real-time PCR和流式细胞术检测ICAM-1在基因水平和蛋白水平的表达。同时检测三种细胞的形态、表型、生长特点及成脂成骨分化等一般生物学特性；并通过淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test, LTT)及混合淋巴细胞反应实验(Mixed lymphocyte reaction, MLR)检测三种细胞的免疫学特性。 3.建立EAT动物模型,将5周龄雌性C57BL/6小鼠于第0d和第14d用猪甲状腺免疫球蛋白(Porcine Thyroglobuli, PTg)及弗氏佐剂(Freund's adjuvant, FA)进行两次免疫；于实验第28d眼球取血,测血清甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin Antibody, TgAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(Antithyroid Peroxidase Antibodies,TPOAb)、甲状腺微粒体抗体(Thyroid microsomal Autoantibody, TMAb)水平,并分离甲状腺组织行HE染色及组织病分析。 结果： 1.对重组载体MIGR1-ICAM-1双酶切和RT-PCR电泳均显示获得1700bpICAM-1目的基因片段；DNA测序结果显示与基因文库中的小鼠ICAM-1基因序列完全相同,且插入方向正确,从而证实成功构建重组逆转录病毒载体MIGR1-ICAM-1。 2.逆转录病毒感染C3H10T1/2细胞后,荧光倒置显微镜下可见绝大部分细胞表达绿色荧光；real-time PCR和流式细胞术分别在转录水平(相对表达量1625.82+119.42)和蛋白水平(表达量90.3%)证实ICAM-1在C3H10T1/2细胞中均有高表达,从而证明获得稳定过表达ICAM-1的间充质干细胞系C3H10T1/2(C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC)。 3.进一步对过表达ICAM-1的C3H10T1/2细胞的生长特性、诱导分化能力及免疫学功能进行研究,结果表明,过表达ICAM-1可使C3H10T1/2细胞(29.18±2.47)%处于S期,且倍增时间缩短。在成脂诱导分化中,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC获得脂肪细胞数显著降低(12.18±3.83/孔),且脂滴变小；real-time PCR检测成脂分化关键转录因子C/EBPα和PPARy的表达均显著下调；同样,在成骨分化中,过表达ICAM-1可使C3H10T1/2成骨分化的碱性磷酸酶活性及矿化骨结节形成能力显著下降,关键转录因子Runx2和Osteocalcin在mRNA表达水平亦显著降低,提示过表达ICAM-1可显著降低MSCs的成脂和成骨分化能力。 4.利用淋巴母细胞转化实验(Lymphocyte transformation test, LTT)和混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction, MLR)对过表达ICAM-1的MSCs进行免疫功能检测,结果显示,在LTT体系中,当MSCs:T细胞分别为1：40和1：5时,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC与对照组C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分别为(1955.25±

关键词： 薄荷属   形态学   细胞生物学   生理学   分子多样性  

摘要： 薄荷是一种重要的多年生芳香草本植物。薄荷被广泛用于食品、香料等工业,薄荷还是重要的中医药材。本文开展薄荷新品种的区域性试验试种,摸清当前世界主栽品种在我国气候区的适应性,通过品种性比试验检验引进新品种和现有优良品种的适应性,为选出在适宜海南推广种植的高产高抗的抗逆品种提供充分的科学论证和数据支持。 本文从外部形态、细胞生物学、生理学、分子标记四个方面评价对我国薄荷属种质资源在海南的区域种植进行了研究,主要的研究结果如下: 1)薄荷属种质资源形态学多样性研究 对14个薄荷种质资源140份材料进行了形态学观察。对薄荷的花序类型、花序着生位置等18个性状进行了 R型聚类和Q型聚类。结果表明,性状间大部分是独立的,仅有少数表现出相关或者关系密切。通过Q型聚类品种数量性状的相似性在2.695-8.222之间,薄荷属植物形态学性状变异很大,可被分为8个类型。 2)薄荷属种质资源细胞生物学研究 利用光学显微镜对薄荷属的种质资源的叶表皮微形态进行了观测。研究表明,不同薄荷试材间的气孔大小、密度、腺毛及非腺毛分布密度存在一定的区别。用上述性状进行聚类,将薄荷种质资源分为5大类型。该方法将罗马薄荷单独聚为一类,这与形态分类和分子分类是相同的。根据结构的差异性决定抗旱性的不同,故可推断出凤梨薄荷的抗旱性最强,其次是美国薄荷、葡萄柚薄荷,抗旱性最弱的为普列薄荷,其次为巧克力薄荷。 3)薄荷属种质资源生理学研究 研究测定了不同薄荷品种间的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)3种酶活性,3种酶活性在不同薄荷试材间表现出一定的差异性。结果表明,罗马薄荷、香槟薄荷和凤梨薄荷的抗逆能力强,科西嘉薄荷、苏格兰薄荷抗逆能力弱。 4)薄荷属种质资源分子多样性研究 采用ISSR标记技术对我国14个薄荷居群进行了遗传多样性分析。12条ISSR标记引物共扩增出276条带多态性高达98.32%,表明14个薄荷种质资源间具有丰富的遗传多态性;UPGMA法聚类结果表明,在阈值0.65处,可将其分为3大类。在阈值为0.69处,又可分为6大类。其中薄荷(海南本地)与留兰香亲缘性较近,科西嘉薄荷分别与葡萄柚薄荷、美国薄荷亲缘关系最远。

关键词： 骨髓间充质干细胞   分离   分化   成骨细胞   纳米羟基磷灰石/赖氨酸二异氰酸酯-甘油聚合物   细胞生物学   黏附   增殖   骨形态发生蛋白2   骨缺损   组织学检查   修复  

摘要： 第一章兔骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及诱导分化成骨细胞 目的：探讨兔BMSCs的分离、培养、鉴定及向成骨细胞诱导分化的方法,探讨BMSCs在体外增殖,定向分化能力。 方法：取兔股骨的骨髓冲洗液,采用Percoll分离液密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离、培养、纯化兔BMSCs,光镜下观察传代细胞生长状况和形态变化;MTT法检测细胞增殖情况,绘制生长动力学曲线;HE染色形态观察和流式细胞仪抗体鉴定兔BMSCs表面标记物;体外诱导P3BMSCs向成骨细胞分化,对诱导分化为骨细胞进行Gomori钙钴法ALP染色和茜素红钙矿化结节染色鉴定向成骨分化的能力。 结果：所分离培养的细胞形态均一,沿胞体长轴生长,呈旋涡状、网状、梭状、放射状,形成较典型的BMSCs。P3BMSCs的生长曲线大致呈S型,第7-11天细胞处于高速增长期,细胞数量迅速增加;HE染色BMSCs形态呈长梭形或长三角形,细胞核浆比例大,核蓝染,胞浆丰富红染。流式检测细胞表面标记物显示BMSCsCD44表达百分率为98.63%,呈阳性,而CD45表达呈阴性。P3BMSCs在体外经成骨诱导3周后,Gomori钙钴法染色ALP呈阳性,胞浆显示有灰黑色颗粒或棕黑色或黑色沉淀。茜素红染色呈阳性,细胞间出现致密的圆形或者卵圆形矿化结节。 结论：应用Percoll分离液密度梯度离心法和贴壁筛选法结合能分离、培养出兔BMSCs,是一种比较理想获取兔BMSCs的方法;兔P3BMSCs纯度较高和良好的增殖能力,具有向成骨细胞定向分化的生物学特性,是组织工程理想的种子细胞,也为后续进行骨缺损修复实验奠定了坚实的基础。 第二章n-HA/n-LDIG复合材料的制备及与BMSCs体外复合培养的细胞生物学评价 目的：以赖氨酸盐,甘油及n-HA为主要原料,制备出一种新型n-HA/n-LDIG复合材料,分析其与BMSCs体外复合培养的生物相容性,探讨其作为组织工程支架的可行性。 方法：选择赖氨酸盐和甘油为原材料,通过有机合成、聚合反应、纳米化、超临界抗溶剂结晶、超声分散等技术制备出n-HA/n-LDIG复合材料。电镜观察其结构及计算孔隙率,细胞计数法检测细胞对复合材料的黏附能力,MTT法检测复合材料对细胞增殖的影响,ALP活性和钙含量测定观察复合材料对细胞分化的影响。 结果：n-HA/n-LDIG复合材料肉眼为白色散在,为比较均匀的粉状固体。扫描电镜可见类似天然松质骨的三维孔洞网络结构,透射电镜可见排列不规则的晶须和空穴。共培养从2h至10h,随时间细胞的黏附率有所增加,其中6h时细胞黏附率明显高于4h时,8h时明显高于6h时,其差异均有统计学意义(P<0.05)。MTT实验结果显示共培养第2天到第16天,细胞在复合材料上数量随时间而增加,特别是从第6天开始复合材料上的细胞数量迅速增加,细胞处于对数生长期,12天后过渡到生长平台期,增殖缓慢。从第4天开始,黏附细胞的ALP相对活性和钙相对含量迅速上升;第8天时ALP相对活性和钙相对含量明显高于第4天时,第12天明显高于第8天时,其差异均有统计学意义(P<0.05);12天后ALP相对活性和钙相对含量增加不明显,差异无统计学意义。 结论：制备的n-HA/n-LDIG复合材料具备适宜的孔隙率和孔径,组成性质相似于天然骨结构,具有良好的生物学特性,是一种新型的纳米骨修复材料。n-HA/n-LDIG复合材料具备良好的细胞相容性,能为成骨细胞在其表面生长、增殖、分泌基质提供良好的微环境,是一种良好的骨修复替代材料,为其作为骨的快速修复和骨组织工程支架材料奠定了基础。 第三章BMP-2和BMSCs结合n-HA/n-LDIG复合材料修复兔桡骨缺损的实验研究 目的：构建兔桡骨缺损模型,探讨BMP-2和BMSCs结合n-HA/n-LDIG复合材料修复兔桡骨缺损的效果。 方法：取新西兰大白兔构建兔桡骨缺损模型,实验组植入BMP-2和BMSCs结合n-HA/n-LDIG复合材料,对照组植入BMSCs结合n-HA/n-LDIG复合材料,空白组不植入任何材料。分别于2、4、8、12周随机处死家兔,进行动物大体观察,X线检查和Lane-Sandhu放射学评分观察骨缺损处愈合情况,通过组织学检查和Lane-Sandhu组织学评分观察骨缺损处的修复情况。 结果：所有实验动物桡骨骨缺损模型构建均成功,未见皮下和肌肉组织充血、水肿、渗出及感染等现象。从大体观察,X线检查和组织学检查等发现随着时间的延长,实验组修复效果优于对照组,对照组优于空白组。实验组术后3、6、9周新生骨所占骨缺损面积百分比,Lane-Sandhu放射学评分,新生骨所占骨缺损面积百分比及Lane-Sandhu组织学评分均明显高于对照组,对照组均明显高于空白组,其差异均具有统计学意义(P<0.05)。 结论：BMP-2明

关键词： MDR   Hedgehog信号通路   JNK信号通路   EMT   Gαi   Gβγ  

摘要： 多药耐药(multidrug resistance, MDR)的发生是导致肿瘤化疗失败的主要原因。研究表明肿瘤多药耐药细胞不仅具有对化疗药物耐药的生物学特性,其相对化疗敏感的肿瘤细胞具有更强的转移能力。 Hedgehog(Hh)是一种高度保守的信号通路,在诸多生物种类的胚胎发育、组织稳态的维持中发挥着重要作用。Hh信号通路的异常活化与多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究还发现Hh信号通路能促进多药耐药的发生。Hh信号通路的关键信号转导分子Smo具有与G蛋白偶联受体类似的结构,提示其可能具有GPCR样的信号转导特征。有研究证实在C18果蝇细胞、Sf9细胞及NIH3T3细胞中,Smo能够与Gai偶联,并激活下游转录因子Gli。但是,Gαi在Hh信号通路转导中的作用仍存在很大争议,尚存诸多亟待阐明之处。 借助细胞、分子生物学手段,本论文首先以多药耐药细胞K562/A02、 KB/VCR及其对应的亲本细胞K562、KB为研究对象,阐述了在肿瘤耐药细胞中Smo的GPCR样信号转导特征。我们发现在以自分泌激活方式导致的异常Hh信号通路活性的肿瘤耐药细胞K562/A02、KB/VCR中,Smo能够通过Gαi激活Hh信号通路中转录因子Gli,以维持K562/A02、KB/VCR的耐药性状；更重要的是,我们的实验结果证实Gβγ亚基与Gαi分离后,能通过JNK激活转录因子Gli的活性,进而维持肿瘤耐药细胞的耐药性状。我们的这些结果进一步在借助Smo异常激活突变体(SmoAl)而人为(artificial)激活Hh通路活性的化疗敏感细胞KB、K562中再现,从而充分阐明了在肿瘤耐药细胞中Smo的GPCR样信号转导特征：Smo能通过偶联Gai,激活转录因子Gli的活性,进而促进多药耐药的发生；而且,Smo能通过Gpy-JNK信号轴激活转录因子Gli的活性,从而促使肿瘤耐药的发生。 MDR细胞具有异常的转移能力,但是MDR细胞如何获得异常转移能力的机制尚不明确。研究表明MDR的发生可能与上皮间质转换(epithelial mesenchymal transition, EMT)有着某种关联。在第一部分工作中,我们证实JNK能被smoothened-Gβγ信号轴激活,并能促进肿瘤耐药细胞对化疗药物的耐药。因此,我们进一步探讨了JNK信号通路是否能通过调控EMT,从而影响MDR细胞的转移能力及可能的机制。我们发现相对其亲本细胞,KB/VCR耐药细胞呈现出典型的间质细胞特征的形态；伴有上皮标志物E-cadherin减少,问质标志物N-cadherin、Vimentin表达增多,并具有显著增强的转移能力；我们进一步发现并证实JNK-c-Jun信号通路参与维持肿瘤耐药细胞的间质细胞特性及异常的转移能力；JNK信号通路通过调控Snail、 twist1的表达维持MDR细胞的间质细胞特性。 本论文的工作充分阐明了肿瘤耐药细胞中Smo介导的GPCR样信号转导特征；以及发现了JNK信号通路通过调控Snail、twist1的表达维持MDR细胞的间质细胞特性。因此,本论文的工作为研发靶向Smo及其下游关键信号分子的分子靶向抗肿瘤药物、以及从Hh信号通路角度干预肿瘤多药耐药细胞的耐药、转移能力供了理论依据。

关键词： miR-371-5p   SOX2   SOX17   结直肠癌  

摘要： 研究背景和目的 结直肠癌是被确诊的第三常见肿瘤,在男性和女性肿瘤相关死因中居第三位,其在中国是第4位最常见的恶性肿瘤。随着生活水平的提高,发病率呈逐年上升和年轻化趋势。但是,其早期的症状往往不被人们所发现,确诊时,病人多已处于进展期。因此,识别有效的结直肠癌相关分子,研究其功能特点,不仅有利于很好的理解结直肠癌发生发展机制,而且也为临床诊断及治疗提供了新的靶点。 microRNA对基因的转录后表达调控是21世纪的一个突破性科学发现,大量事实显示microRNA与肿瘤的发生及转移相关,通过抑制其靶基因的表达,发挥着“癌基因”或“抑癌基因”的作用。miR-371-5p,又称miR-371a-5p,是我们通过结直肠癌microRNA芯片筛选出的一个新的与肿瘤相关的microRNA,属于基因间microRNA,编码基因位于chr19：54,290,929-54,290,995,全长67bp.与基因内microRNA不同之处在于,其表达无宿主基因依赖而独立的受自身启动子活性状态的调控。目前为止,未见对miR-371-5p功能的研究,只是在尤文肉瘤,前列腺癌,胃癌的筛查或靶向治疗中有文献提到了miR-371-5p[3-5]。 本研究将从miR-371-5p在人结直肠癌中的生物学作用入手,分析其下游作用靶基因及上游调控分子,并结合临床标本分析其表达与临床病理的关系。本研究不仅助于理解结直肠癌进展的分子机制,还为临床诊断及治疗提供了新的靶点。 研究方法 ***-371-5p在结直肠癌中生物学特性的研究 1)利用结直肠癌组织microRNA芯片挑选出几个与结直肠相关的microRNA,并选取8种结直肠癌细胞株,利用real-time RT-PCR检测候选microRNAs的表达。 2)利用阳离子脂质体法,将商品化的miR-371-5p inhibitor瞬时转染至结直肠癌细胞株SW480和HCT116中,通过体外增殖及侵袭实验研究miR-371-5p在结直肠癌中的作用,确定miR-371-5p为研究对象。 3)设计并构建慢病毒载体,a、miR-371过表达载体进行病毒包装后将之感染至结直肠癌细胞株SW620和LoVo中,b、miR-371-5p/shRNA稳定干扰载体进行病毒包装后,将之感染至结直肠癌细胞株HCT116和SW480中；用有限稀释法筛选并获得稳定的细胞株,并行real-time RT-PCR检测miR-371-5p的表达。 4)利用CCK8法、平板克隆形成、流式细胞仪和体外侵袭实验,检测过表达miR-371或稳定干扰miR-371-5p后对体外结直肠癌细胞增殖、侵袭能力的影响。 5)利用整体可视化动物模型,检测过表达miR-371或稳定干扰miR-371-5p后对裸鼠皮下成瘤和转移能力的影响。 6)从南方医院普外科收集77对新鲜结直肠癌组织及远端正常组织,利用实时荧光定量PCR检测miR-371-5p的表达情况及与临床病理的联系。 ***-371-5p靶基因的筛选及验证 1)以miR-371-5p为检索词,在***、TargetScan、miRDB和DIANA-microT-CDS四个数据库进行靶基因的预测,将4个数据库得分前50的预测结果取交集,即预测得到的可信度和准确性较高的靶基因。 2)利用萤光素酶报告系统检测miR-371-5p与筛选出的靶基因的结合情况,确定与microRNA直接作用的靶基因。 3)利用real-time RT-PCR和Western blot方法,检测miR-371-5p和其靶基因在8种结直肠癌细胞株中的表达情况,并进行相关性分析；并检测了过表达或干扰miR-371-5p后靶基因的变化情况。 4)将miR-371-5p稳定干扰细胞中干扰靶基因SOX2的表达,通过体外实验观察其对miR-371-5p在结直肠癌中生物学活性的逆转作用。 ***-371-5p表达调控的探讨及其影响因素的排除 1)利用甲基转移酶抑制剂氮杂胞嘧啶(5'AZC)及染料木素(Genistein),处理结直肠细胞株,与对照组比较miR-371-5p的表达情况。 2)利用UCSC-Ensembl查找miR-371-5p茎环上游启动子序列并利用Methyprimer分析其启动子区域的CpG岛,通过在线软件PromotorScan预测其启动子区域,Consite在线软件预测与miR-371-5p启动子区域相互作用的转录因子。 3)结合文献报道及软件分析结果,初定与miR-371-5p启动子区域相互作用的转录因子,利用real-time RT-PCR检测转录因子及miR-371-5p在结直肠癌细胞

关键词： RNA干扰   前列腺癌   细胞生物学   基因序列  

摘要： 目的:研究小RNA干扰PRL-3基因对人前列腺癌PC-3细胞侵袭力及增值能力的影响。　　 方法:针对PRL-3基因序列特异性，人工合成特异性的siRNA(siRNA-1，5'UGUGUUUGUAGCUCACCUCTT3';siRNA-2,5' UAACGCAGCACCGGGUCUUTT3';siRNA-3,5' AGGUCCUCAAUGAAGGUGCTT3';siRNA-4,5' AGUCUUCCACUACCUUGCCTT3').作用于人前列腺癌PC-3细胞，采用Lipofectamin2000试剂转染PC-3细胞。实验分为空白对照组(blank组);siRNA oligo干扰组（干扰组1、2、3、4）;转染试剂对照组(Mock组);阴性对照组(NC)。采用western blot检测特异性siRNA转染人前列腺癌PC-3细胞24及48小时后PRL-3蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR检测特异性siRNA转染人前列腺癌PC-3细胞24及48小时后PRL-3 mRNA的表达。挑选出特异性最强的两条siRNA序列（干扰组2和3）转染人前列腺癌PC-3细胞，检测细胞的侵袭力(Transwell侵袭实验)和增殖能力(CCK-8法)。　　 结果:Western blot结果显示靶向PRL-3基因的siRNA转染细胞24小时及48小时后，与对照组相比较，特异siRNA转染组（siRNA-1，5'UGUGUUUGUAGCUCACCUCTT3';siRNA-2,5'UAACGCAGCACCGGGUCUUTT3';siRNA-3,5'AGGUCCUCAAUGAAGGUGCTT3';siRNA-4，5'AGUCUUCCACUACCUUGCCTT3'）细胞中PRL-3蛋白表达均明显降低。并且，转染48小时后PRL-3蛋白表达下调最明显。实时荧光定量PCR结果显示，靶向PRL-3基因的siRNA转染组细胞24小时及48小时PRL-3 mRNA的表达量均降低，且在48小时达到最低。各特异转染组中PRL-3 mRNA表达与对照组相比，均有显著性差异。依据western blot和实时荧光定量PCR检测结果，挑选两条特异性最好的siRNA（干扰组2、3）来研究RNA干扰PRL-3基因对人前列腺癌PC-3细胞侵袭力及增值能力的影响。Transwell侵袭实验结果显示特异siRNA干扰组穿膜细胞数明显减少，与对照组相比较具有显著差异;CCK-8实验结果显示特异转染组的细胞增殖力与对照组相比，无显著性差异。　　 结论:RNA干扰PRL-3基因可降低人前列腺癌PC-3细胞的侵袭力，但是对其增值能力作用不明显。PRL-3有望成为治疗前列腺癌的一个靶点。

关键词： 心室重建   生物补片   血管再生   细胞生物学  

摘要： 目的：大量的动物实验已经证实，应用组织生物工程补片进行左室重建手术，能够达到改善心脏功能的目的。然而，目前仍有两个因素限制了该方法进一步临床应用的实现。包括组织生物支架本身物理性质上的不足，以及老年种子细胞的组织修复功能下降。本研究希望通过化学方法完成对胶原组织支架的改性，在增加其物理强度和抗变形能力的同时，将两种细胞因子VEGF和bFGF共价结合在胶原支架上，以增加其生物学调节能力。同时，系统的观察并分析细胞因子共价结合组织生物补片对种植的老年骨髓间充质干细胞功能的调节作用。\n 方法：用EDC+Sulfo-NHS化学胶联法处理胶原支架，同时将两种细胞因子VEGF和bFGF共价结合于其上。应用扫描电子显微镜对细胞因子共价结合前后胶原支架的超微结构进行评估。应用酶联免疫吸附试验检测细胞因子共价结合的效率及释放情况。获取年轻（50±8岁，n=4）或年老（74.5±7.4岁，n=4）患者的骨髓间充质干细胞，体外培养至第3代时，种植于普通或细胞因子优化组织生物补片上。应用生物力学检测系统评估细胞因子共价结合前后及年轻或年老细胞种植前后，组织生物补片生物力学的变化;应用MTT法和BrdU法检测年轻或年老细胞在普通或细胞因子优化的组织生物补片上的增殖情况及能力;应用RealTime PCR以及免疫荧光染色法检测年轻或年老细胞在普通或细胞因子优化的组织生物补片上的分化情况;应用Real Time PCR，免疫荧光染色以及Western Blot法分别从RNA水平和蛋白水平检测年轻或年老细胞在普通或细胞因子优化的组织生物补片上种植培养后衰老基因的表达变化。\n 结果：应用EDC+Sulfo-NHS化学交联法能够将细胞因子（VEGF和bFGF）共价结合在胶原支架上，结合效率高(VEGF:42％; bFGF:24％)，且能够实现细胞因子的缓慢、持续释放，显著提高了细胞因子的作用时间（28日以上）。电镜结果显示，EDC+Sulfo-NHS处理，及细胞因子的共价结合并不影响胶原支架的原始三维多孔结构(P＞0.05)。在普通补片上，年轻细胞显示了明显优势的增殖状态和能力，而细胞因子优化的组织生物补片能够显著提高老年细胞的增殖能力(P＜0.01)，延缓其分化的趋势，使其功能接近于年轻细胞的状态。衰老基因检测结果显示，细胞因子优化的组织生物补片能够显著降低老年细胞衰老基因的表达(P＜0.01)，改变其衰老的表型，呈现高效的“年轻化”作用。\n 结论：EDC+Sulfo-NHS化学胶联法能够成功的将细胞因子共价结合在胶原支架上，同时在不改变胶原支架的超微结构的基础上显著提高胶原支架的机械强度和抗变形能力。VEGF和bFGF优化的组织补片能够显著改善种植其上的老年骨髓间充质干细胞的老化状态，使其呈现年轻细胞的状态和修复能力。