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关键词： 膀胱癌   生物特性   维生素D结合蛋白   维生素D结合蛋白基因   siRNA   RNAi  

摘要： 研究背景： 膀胱癌是我国男性泌尿生殖系统中最常见的高度恶性肿瘤,根据美国2013年新发病例数最多的十大癌症估测,男性膀胱癌发病率排行第四,死亡率排行第八,其中病理类型膀胱移行细胞癌占90%以上。根据近年来我国部分城市肿瘤发病率报告,膀胱癌的发病率有增高的趋势。目前,膀胱镜检查及病理活检仍是膀胱癌诊断和随访的金标准,但此检查属侵入性,会给患者带来一定的痛苦和恐惧,同时临床应用上也会受到一定的限制,而尿细胞学检查为非侵人性,对诊断膀胱癌的特异性很高,但敏感性较低。由于缺乏特异性的肿瘤标志物,目前膀胱癌难以做到早期诊断,探索膀胱癌早期有效诊断的新方法已经成为临床上迫切需要解决的实际问题,并且一直是医学研究的热点与难点。近现代对于恶性肿瘤的研究表明,肿瘤的发生和发展为多因素、多阶段形成,其发生机制在于细胞内部基因结构和功能发生了异常改变,致使恶性肿瘤的生物学特性表现为肿瘤细胞的无限制增殖、浸润性的生长和多方向转移。在这个多阶段的癌变过程中,癌基因的激活还有抑癌基因的失活这两个过程被认为是最重要的分子学变化。其中两大机制在肿瘤的形成过程中发挥了不可忽略的作用：是在遗传学方面通过DNA核苷酸序列的改变而形成基因的突变；另一个是表观遗传学方面出现基因表达的变化,这种变化主要通过减数分裂遗传,并不改变有关基因DNA的序列,但通过DNA自身化学修饰的方式,从转录水平影响基因的表达,特别是蛋白的表达,因而调控DNA的功能,在肿瘤的形成过程中越来越受到重视。虽然在医学上的提高和监测膀胱癌的早期检出率仍然是一个巨大的挑战。而我们最近研究发现,维生素D结合蛋白(Vitamin-D Binding Protein,又称为DBP或GC蛋白,以下简称GC蛋白)可以作为一个新的尿源性标志物,在早期的膀胱尿路上皮癌的检测和监测中发挥重要的作用,并有可能成为将来早期诊断膀胱癌的重要方法。但维生素D结合蛋白在膀胱移行上皮癌细胞中的作用尚未被阐明,所以有必要对该蛋白在膀胱癌细胞中发挥的作用作进一步的研究和探讨。 实验目的： 本实验旨在1.研究GC蛋白在膀胱癌T24细胞株与正常膀胱粘膜上皮细胞中表达的差异；2.通过RNAi干扰的方法,沉默膀胱癌T24细胞GC基因,下调膀胱癌T24细胞GC蛋白的表达,并进一步研究其对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响。 方法： 第一部分：1.细胞培养：选取膀胱癌T24细胞株及正常膀胱粘膜上皮细胞作为对照组进行细胞培养,分为膀胱癌细胞组和正常膀胱粘膜上皮细胞组。2.分别对两组细胞提取总蛋白,应用免疫印迹法,经过蛋白电泳,转膜,封闭杂交及曝光检测GC蛋白在膀胱癌T24细胞株中的表达与该蛋白在正常膀胱粘膜上皮细胞株中表达的差异。 第二部分：1.细胞培养：选取膀胱癌T24细胞株分为GC-siRNA组作为实验组、阴性对照组、空白对照组共三组,其中GC-siRNA组应用RNAi的方法,用脂质体转染siRNA干扰片段,沉默膀胱癌T24细胞维生素D结合蛋白基因(简称GC基因)的表达；阴性对照组用脂质体转染阴性对照片段,不干扰GC基因的表达；空白对照组则不作转染处理。2.分别用荧光电镜观察GC-siRNA组及阴性对照组干扰片段的转染效率。3.分别提取三组细胞的总蛋白,以免疫印迹法经过电泳、转膜、封闭杂交、曝光分别检测对比三组细胞中GC蛋白的表达的差异,检测沉默GC基因后GC蛋白在实验组的下调情况。 第三部分：1.细胞培养：选取膀胱癌T24细胞株分为GC-siRNA组、阴性对照组、空白对照组共三组,其中GC-siRNA组应用RNAi的方法,用脂质体转染siRNA干扰片段,沉默GC基因的表达；阴性对照组用脂质体转染阴性对照片段,不干扰GC基因的表达；空白对照组则不作转染处理。2.分别对各组细胞运用MTT法检测细胞增殖的情况,运用Annexin-V-PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡状况,运用Transwell试验检测细胞迁移能力的变化,观察沉默GC基因对膀胱癌T24细胞生物特性的影响。 结果： 第一部分：GC蛋白在膀胱癌细胞T24细胞中呈高表达状态,较正常膀胱粘膜上皮细胞中的表达明显增高且有显著差异。 第二部分：应用脂质体转染siRNA干扰片段沉默GC基因后,明显下调人膀胱移行细胞癌T24细胞中GC蛋白的表达,GC-siRNA组中GC蛋白的表达明显较阴性对照组及空白对照组下降,有显著差异；阴性对照组与空白对照组间的比较无明显的差异。 第三部分：***实验结果显示各组的细胞增殖情况：GC-siRNA组分别与阴性对照组和空白对照组比较,膀胱癌T24细胞的增殖水平受到抑制,有显著差异,阴性对照组与空白对照组细胞增殖情况无明显差异；***-V-PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡情况显示：G

关键词： 新课改   PBL   细胞生物学   多元化教学模式  

摘要： 突破传统的高中生物学教学模式,确立以专业特点为主体、以学生实验结合为核心的教学理念,以课堂教学模式改革为突破口,开展"二段式多元化"教学模式的探索,促进学生主动学习的兴趣和综合能力的提高。

关键词： KISS1基因   肺癌   A549细胞   生物学作用   细胞增殖能力   NF-kBp65蛋白  

摘要： 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的生命及健康，其发病机制迄今尚不完全明确。肺癌的早期临床症状轻微，多数患者在确诊时已属中晚期，因而造成了大量的术后转移和复发，在相当长的时间内寻找与肺癌侵袭转移的相关因子仍然是人类面临的亟需解决的重大问题。KISS1是Lee等在1997年利用修饰递减杂交技术在黑色素瘤细胞株中发现的一种肿瘤转移抑制基因，编码一个由145个氨基酸组成的亲水性蛋白，其氨基酸位点上存在着具有Src癌蛋白SH-3区特征的PXXP，可抑制带有SH-3的各种因子，参与转移级联反应抑制多种肿瘤的浸润、转移。　　NF-κB是近年来发现的转录调控因子，转录因子NF-κB广泛存在于人的各种细胞中，调节从免疫系统、细胞生长到炎症等多个基因的表达，它的失调会导致包括肿瘤在内多种疾病的发生。NF-κB最常见的形式是由p50和p65组成的异源二聚体，NF-κB在细胞中与其阻抑物IκBα蛋白结合，以非活性形式存在于胞质中，当它被激活后，通过信号传导引起IκB的泛素化及蛋白酶体途径的降解，导致NF-κB-IκB复合物解体，解离的NF-κB进入到核内并暴露它的核识别位点，与特定靶基因结合而启动靶基因转录开放，调节多种基因的表达，在很多癌症中可以观察到NF-κB的异常，它通过转录调控激活一些与细胞增殖、血管新生、转移、肿瘤恶化、抑制细胞凋亡等有关基因的表达来参与肿瘤的发生和恶化过程。　　基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinase，MMPs)是一类具有降解细胞外基质和基底膜能力的蛋白水解酶，在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润、转移中起重要作用，在肿瘤演进等众多生理和病理过程中均发挥着重要的作用。研究发现，在许多肿瘤组织中，都发现有较高MMP9的表达，且其表达程度与肿瘤的侵袭性有关。　　目前研究表明KISS1、NF-κBp65和MMP9在多种肿瘤组织中均存在异常表达，并证实与肿瘤的侵袭和转移过程存在密切关系，但目前对三者的研究多数是在各自独立的层面上，且三者之间的关系及相互作用机制至今尚未完全阐明，在肺癌中三者结合起来研究尚无文献报道。多种肿瘤细胞KISS1处于低表达状态，通过基因修饰可以增加KISS1蛋白的表达，肿瘤细胞中KISS1过表达若能激活NF-κB信号通路，封锁NF-κB的核内转移，减少其与MMP-9启动子的结合，进而使MMP9转录水平下降，MMP-9蛋白合成减少，籍以降低对Ⅳ型胶原及层粘连蛋白等成份的降解，减少对基底膜完整性的破坏，从而抑制肿瘤细胞侵袭转移，这也成为本课题立题的切入点所在。　　本研究中，我们首先利用免疫组化技术、逆转录-PCR技术及免疫印迹技术测定人肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA及蛋白的表达情况及相互关系，旨在探讨三者在肺癌发生发展、侵袭和转移过程中的作用机制。随后利用基因扩增技术获得人KISS1基因cDNA序列，构建pEGFP-KISS1表达载体，并构建用于FRET实验的pECFP-KISS1及pEYFP-p65载体;将成功构建的pECFP-KISS1及pEYFP-p65载体转染到A549细胞中，利用激光共聚焦扫描显微镜进行基于感应发射法的FRET实验及全波段扫描FRET技术测定KISS1与NF-κBp65蛋白之间的相互作用;采用MTT实验、克隆形成实验、Transwell小室侵袭实验、逆转录-PCR技术及免疫印迹技术检测pEGFP-N1-KISS1载体转染后对KISS1、NF-κBp65和MMP9转录及翻译水平的调节及对肺癌细胞增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力的影响。　　本研究分为以下四个部分:　　第一部分KISS1在肺癌组织中的表达及意义　　方法:　　1.免疫组化检测35例肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的表达。　　***-PCR技术检测35例肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9mRNA的表达。　　3.免疫印迹技术检测35例肺癌及癌旁组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的表达。　　4.肺癌组织中KISS1、NF-κBp65和MMP9蛋白的相互关系。　　结果:　　1.免疫组化、逆转录PCR及免疫印迹结果显示KISS1在癌旁组织表达高于肺癌组织，差异有统计学意义(P＜0.05);NF-κBp65、MMP9在肺癌组织中高于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.05);***1和NF-κBp65、MMP9在肺癌组织中的表达呈负相关。　　第二部分KISS过表达载体及FRET实验相关载体的构建　　方法:　　1.应用基因扩增技术获得人KISS1基因cDNA序列，经酶切、回收并连接到真核载体pEGFP-N1，构建pEGFP-KISS1载体，　　2.应用基因扩增技术获得人KISS1及NF-κBp65基因cDNA序列，经酶

关键词： 中国特有   喜树   雌性不育   形态学   解剖学   超微结构   组织化学   Ca2+定位  

摘要： 喜树(Camptotheca acuminata Decne.)是中国特有的抗癌药用植物之一,是喜树碱及其衍生物提取的唯一来源树种。喜树花均为两性,其种子中喜树碱含量较高,在开花期,喜树雌性器官出现败育,落花现象严重,影响了喜树果实的产量。本文通过对喜树花发育过程进行研究,阐明喜树雌性不育发生的关键时期,观察雌性器官败育过程的形态解剖学特征,对关键败育时期雌性器官进行细胞学及组织学研究,比较可育与败育雌性器官中的钙离子分布,探讨雌性器官败育的原因及发生机制,为克服喜树雌性不育提供资料。 1.喜树雌性不育的形态学研究 以具抗癌活性物质树种喜树为研究对象,对喜树雌性不育形态学特征进行了体视显微镜观察,结果表明,喜树花均为两性花,雄蕊发育正常,雌蕊柱头有三种不同形态,即上位、中位和下位；柱头上位的小花,花柱伸长正常,柱头三裂,外翻,子房膨大,胚珠饱满,雌蕊可育；柱头中位的小花,柱头和花柱伸长缓慢,柱头外翻异常,雌蕊选择性败育；柱头下位的小花,花柱退化,柱头不露,胚珠萎缩,子房外形瘦长,室内中空,雌蕊败育。 2.喜树雌性不育的细胞学研究 结合形态学观察,通过石蜡切片发现柱头上位的小花,胚囊发育正常;柱头中位的小花,雌蕊选择性败育,局部子房细胞液泡化,胚珠退化,胚囊发育异常；柱头下位的小花,珠被细胞发育异常,大孢子母细胞未能减数分裂,胚珠萎缩,子房室内中空。喜树雌性器官的发育与其柱头在子房上的表现形态有着严格的对应关系,雌性不育发生于大孢子母细胞减数分裂前后,而且雌性不育是喜树花序掉落的内部原因之一 对喜树雌性不育的超微结构研究显示。柱头上位小花雌性器官细胞发育正常,柱头表面具乳突细胞,花柱细胞及胚珠细胞内部含有丰富的细胞器,膜结构完整,细胞核清晰；柱头下位小花雌性器官发育异常,柱头表面细胞壁加厚,部分花柱细胞及胚珠细胞出现凋亡,凋亡特征为细胞核皱缩,染色质凝聚且边缘化液泡化现象明显。喜树雌性器官内细胞死亡属于典型的细胞程序性死亡,而引起细胞凋亡的因素可能与营养及Ca2+有关。 为探明喜树雌性不育与营养物质的缺乏之间的关系,采用石蜡切片及组织化学染色方法,对雌性器官败育过程中的淀粉及蛋白质动态分布进行了研究,结果表明：上位柱头细胞及胚珠细胞中淀粉粒始终有分布,在大孢子母细胞减数分裂时期,淀粉粒集中积累在柱头内部细胞、珠心细胞、合点区、胎座及子房内壁细胞中,珠孔区细胞无淀粉粒分布；在成熟胚囊形成期,柱头细胞内部淀粉粒增多,胚囊内部也积累了大量淀粉颗粒。而下位柱头发育过程中淀粉粒分布较少,柱头表面无乳突状突起,在大孢子母细胞时期,胚珠细胞内部几乎无淀粉粒,包括珠心细胞、合点区细胞及子房细胞中均未观察到明显淀粉颗粒,胚珠发育后期出现解体,其内部无淀粉粒分布。相比起上位柱头胚珠,下位柱头胚珠细胞中蛋白质染色均较浅。下位柱头胚珠淀粉粒及蛋白质营养物质的缺乏,是导致大孢子母细胞未能减数分裂的重要因素之一 3.喜树雌性不育的Ca2+定位研究 采用超薄切片和焦锑酸钾沉淀钙法,结合透射电子显微镜技术,对喜树雌性器官败育过程中钙的动态分布进行研究,结果显示：可育雌蕊的柱头、花柱和胚珠中有大量钙颗粒,柱头细胞壁中有许多钙,而且从花柱上部至胚珠下部呈梯度分布现象,细胞内钙离子递增；败育雌蕊中柱头、花柱和胚珠仅有少量钙颗粒分布,花柱细胞中无明显的梯度分布现象,花柱靠珠孔端细胞出现凋亡,钙离子富集在细胞膜及细胞器膜上,细胞间隙中有大量钙颗粒。这表明钙离子的异常分布与喜树雌性败育密切相关,细胞中的钙重新分布启动或诱导了细胞发生程序性死亡,导致雌性器官结构被破坏。

关键词： 结肠癌   微小RNA   miR-139-5p   抑制   细胞   生物学功能  

摘要： 目的：结肠癌(Colon Cancer)是常见的消化道恶性肿瘤之一,它的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,在西方国家,结肠癌的发病率位于世界第二位,而在我国,它的发生率和死亡率则位于第四位,目前结肠癌在其早期诊断、早期治疗方面取得了一定的成效,但其预后及5年生存率仍很低。 本研究通过观察miR-139-5p的表达对结肠癌细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭和迁移的影响,初步探讨miR-139-5p在结肠癌发展过程中的作用,为结肠癌的早期筛查、基因的靶向治疗以及预后提供理论依据。 方法：通过RT-PCR (Real-time Polymerase Chain Reaction)分析了95对结肠癌和癌旁正常组织以及所有的7种人类结肠癌细胞中miR-139-5p的表达水平；采用瞬时转染的方法,将pre-miR-139-5p和pre-miR-Ctrl分别转染到结肠癌细胞株中,RT-PCR (Real-time Polymerase Chain Reaction)检测其转染效率；MTT法绘制出细胞生长曲线,Transwell法检测细胞的侵袭和迁移能力,流式细胞仪对转染的结肠癌细胞株进行凋亡和细胞周期分析；最后通过Western Blot和PCR的方法验证了与细胞侵袭、迁移及细胞凋亡相关基因的表达情况。采用T-T test方法对分别转染niR-139-5p和rniR-Ctrl的结肠癌细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡、及细胞周期方面进行检验和分析。 结果：1.通过实时定量PCR分析得出,与癌旁正常组织相比,miR-139-5p在结肠癌组织中表达是明显降低的(P<0.0001), miR-139-5p的表达下调与结肠癌的远处转移存在着明显的关联(P=0.031)。同时与正常结肠细胞相比,在人类的7种结肠癌细胞中miR-139-5p的表达沉默或者减少。这些揭示了miR-139-5p在结肠癌中可能是一个潜在的肿瘤抑制因子。 2.细胞生物学功能方面,通过细胞活力测定(MTT)和集落形成实验,miR-139-5p在结肠癌细胞株(DLD1, HCT116, SW1116)中的表达可以明显抑制结肠癌细胞的生长(P<0.0001,P=0.0002,P=0.0022)和集落的形成(P<0.05)。明显抑制结肠癌细胞的生长(P<0.0001,P=0.0002,P=0.0022)和集落的形成(P<0.05)。 3.此外,miR-139-5p在DLD1和SW1116中的表达可以抑制细胞的侵袭(P=0.0006,P=0.013)和迁移能力(P<0.0001),抑制基因VIM(SW1116,P=0.0088), MMP1(DLD1,P=0.0088), MMP7(DLD1P=0.0035, SW1116P=0.0031)和MMP9的表达。 4. miR-139-5p能够诱导结肠癌细胞DLD1和HCT116的凋亡(P<0.05),上调重要的凋亡相关基因cleaved caspase-8和PARP。同时,miR-139-5p能够引起结肠癌细胞周期G0/G1期阻滞(DLD1,HCT116),通过它可以促进G0/G1期重要的调控因子p21和p27的表达而得到证实(DLD1P=0.0082, P=0.0036, HCT116P=0.025)。 结论：***-139-5p在结肠癌组织和结肠癌细胞中的表达明显下调。 2. miR-139-5p通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等过程发挥类似抑癌作用；它通过调节细胞周期重要调控因子P21和P27的水平阻滞细胞周期；通过Caspase途径诱导细胞凋亡；通过调控基质金属蛋白酶,影响细胞迁移和侵袭。 3. miR-139-5p是一种新发现的在结肠癌的发生和发展中发挥着重要作用的MicroRNA,它可以抑制结肠癌细胞的增殖,细胞侵袭与转移,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡。因此,miR-139-5p在结肠癌的发生和发展中可能发挥着抑癌的作用。

关键词： 胶质瘤   miR-34c-3p   miR-34c-5p   Notch2   增殖   细胞周期   凋亡   靶基因  

摘要： 神经胶质瘤是始发于颅内的最常见恶性肿瘤，占所有恶性中枢神经系统肿瘤的78%，占颅内原发肿瘤的40%。当今世界胶质瘤的治疗仍然是神经外科领域最棘手的问题之一，目前，针对胶质瘤尚无有效的筛查或早期诊断方法，确诊时往往已为晚期，尽管近几十年来以手术为主的治疗手段有很大的进展，但是胶质瘤的生长速度快、边界不清、术后容易复发等特点都使胶质瘤的治疗效果难以令人满意，其预后尚不乐观，其中多形性胶质母细胞瘤的中位生存期仅为12-15个月，因此在手术切除肿瘤的同时必须寻找新的治疗方法辅助治疗才能使胶质瘤的治疗产生本质的进步。近年来，有关神经胶质瘤的诊断和治疗的研究已深入到了分子水平，涉及到胶质瘤发生，发展，尤其是演变过程的基因有多种。因此寻找与胶质瘤发生相关的致病基因，从基因水平上进行针对性防治可能成为有效治疗胶质瘤的根本途径。 miRNAs是一类长约22个核苷酸的内源性非编码单链小RNAs，通过与靶mRNA3’非编码区完全或非完全互补的结合而导致靶mRNA的降解或翻译过程的抑制，进而调控基因的表达，miRNAs能参与一系列重要的生物学行为,例如细胞分化、细胞增殖与凋亡、应激反应等，同时有报道miRNAs与人类癌症的发生、发展有密切关系，在肿瘤的发生过程中起到调控的枢纽作用，因此已经有专家预测，把miRNA作为肿瘤生物治疗的靶分子将比编码分子作为靶分子更加有效。miRNA将成为肿瘤生物治疗领域的一个新亮点，可能会给肿瘤的药物设计和进行针对性治疗提供一个新的平台。 已有文献报道miR-34参与p53和Notch信号通路的调控，具有肿瘤抑制的特性。在哺乳动物中，miR-34家族包括3类：miR-34a具有自己的转录本，而miR-34b和miR-34c则共享一个转录本。有报道称在胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌中miR-34a低表达或检测不到。亦有报道miR-34a在肺癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌和黑色素瘤的细胞系中处于失活状态。有人报道在恶性黑色素瘤、结肠直肠癌、口腔鳞状细胞癌中，由于CGP岛甲基化表现为miR-34b/c的失活。并且，miR-34a的低表达和非小细胞肺癌的高复发率相关，表明miR-34a能够作为对非小细胞肺癌判断预后的新的靶标。到目前为止，所有已发表的数据表明在恶性肿瘤中miR-34的失活是常有的事。但miR-34c作为miR-34家族中的一员，在胶质瘤中的表达及对肿瘤发生、发展起到的具体作用还未见报道。 本实验应用定量PCR方法对18例脑胶质瘤标本和5例脑组织标本分别进行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的检测，研究miR-34c-3p和miR-34c-5p在人类脑胶质瘤中的表达及临床意义。并应用LipofectamineTMRNAiMAX对人脑胶质瘤细胞株U251和U87进行转染，采用多种方法对转染后的胶质瘤细胞株的转染效率、细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、细胞周期、细胞凋亡等生物学特性进行检测，而后应用数据库检索miR-34c-3p和miR-34c-5p可能的下游靶基因，找到感兴趣的共同调控的靶基因Notch2，并采用westenblot实验方法及荧光素酶报告基因技术进行直接验证，探索miRNA-34c是否对靶基因Notch2有直接调控关系，进一步阐明作用机理，期望为胶质瘤的基因治疗找到有效可行的治疗靶点并为临床应用提供理论依据，为肿瘤的治疗提供一个新思路。本实验共分三个部分。 第一部分miRNA-34c在人脑胶质瘤中的表达研究 目的：探讨miRNA-34c在人脑胶质瘤组织中的表达情况 方法：应用定量PCR方法对18例WHO分级Ⅱ-Ⅳ级的福尔马林固定石蜡包埋的脑胶质瘤标本和外伤或脑出血患者内减压手术获得的5例脑组织标本分别进行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的检测，比较不同级别胶质瘤和正常脑组织中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达差异，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达和胶质瘤恶性程度的相关性。 结果：与正常脑组织相比，胶质瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达皆显著减少，而且miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达随着胶质瘤级别或恶性程度的增加分别减少，呈显著的负相关（miR-34c-3p的spearman相关系数=-0.856，P＜0.001；miR-34c-5p的spearman相关系数=-0.767，P＜0.01）。 结论：MiR-34c在人脑胶质瘤细胞中的表达显著降低，而且表达随着肿瘤分级或恶性程度的增高而减少，与胶质瘤级别的升高呈显著的负相关。MiR-34c在胶质瘤的进展中有重要的意义，可作为脑胶质瘤临床分级的重要指标。 第二部分上调miR-34c抑制胶质瘤

关键词： 胃癌   EGFR   STAT3   VEGF   生物学行为  

摘要： 研究目的： 采用单克隆抗体阻断EGFR的激活,调节其下游调控基因STAT3的表达,进而抑制胃癌细胞对于淋巴生成相关因子(VEGF-C, VEGF-D)的表达。以证实单克隆EGFR抗体对于胃癌淋巴结转移发生发展的抑制作用,并分析EGFR/STAT3信号途径阻断对于何种分化程度的胃癌细胞生物学性质改变显著,对不同分化程度胃癌患者肿瘤的诊断、治疗和预后判断起指导作用。研究方法： 1.选取常见的不同分化程度人胃癌细胞株MKN-28(高分化)、SGC-7901(中分化)、MGC-803(低分化)及人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1(对照),进行细胞传代、培养； 2.流式细胞术及RT-PCR检测不同分化程度胃癌细胞株EGFR表达水平； 3.对于EGFR单克隆抗体(Nimotuzumab injection,商品名：泰新生)处理前后,免疫组化及RT-PCR法分别检测STAT3、p-STAT3、VEGF-C、VEGF-D在不同分化胃癌细胞株[MKN-28(高分化)、SGC-7901(中分化)、MGC-803(低分化)及人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1(对照)]中的蛋白及mRNA表达变化； 4.检测应用EGFR单克隆抗体(泰新生)处理前后不同分化程度胃癌细胞的细胞凋亡(流式细胞术检测)、细胞增殖(MTT法检测)、细胞侵袭(Transwell小室检测)、细胞周期(流式细胞术检测)方面的细胞生物学特性； 5.数据分析采用SPSS17.0统计软件进行处理,p<0.05作为差异有统计学意义。结果： 1.流式细胞术及RT-PCR检测结果均显示：人胃癌细胞株EGFR呈现高表达,不同胃癌细胞株EGFR的表达程度为MGC-803(低分化)>SGC-7901(中分化)>MKN-28(高分化),胃癌细胞分化程度越低,EGFR表达越强(p<0.05)。 2. EGFR的表达和STAT3、VEGF-C、VEGF-D的表达变化趋势同步,且表达有相关性。 3.胃癌细胞STAT3、p-STAT3、VEGF-C、VEGF-D mRNA及蛋白的表达,在EGFR单克隆抗体药物处理组较未行药物处理组显著减弱(p<0.05)。 4.单克隆EGFR抗体药物处理后,胃癌细胞增殖减慢、细胞凋亡加快、细胞侵袭性减弱、细胞周期停滞,药物处理前后有统计学差异(p<0.05)。 结论： 1.人胃癌细胞株EGFR高表达,胃癌细胞分化程度越低,EGFR的表达越强。 2.单克隆EGFR抗体抑制胃癌细胞STAT3、p-STAT3、VEGF-C、VEGF-D mRNA及蛋白的表达。 3.单克隆EGFR抗体抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡、降低胃癌细胞的侵袭性、使胃癌细胞周期停滞。 4. EGFR/STAT3信号传导途径阻断后,胃癌细胞分化程度越低,胃癌细胞生物学性质改变越显著。

关键词： 机械牵张力   人主动脉平滑肌细胞   miR-21   增殖与凋亡   AP-1   机械牵张力   表型转化   miR-145   平滑肌细胞  

摘要： 研究背景 血管长期暴露于搏动性血流的作用下,后者产生的机械生物力对于正常的血管结构和功能的维持具有关键作用。血管中的搏动性血流主要产生两种形式的机械生物力,分别是平行于血管长轴的剪切力(shear stress)和垂直于血管长轴的机械牵张力(stretch stress).内皮细胞衬于血管最里面,直接与血流接触,因此剪切力主要作用于血管内皮细胞。而牵张力主要是由于心脏周期性搏动引起的血管扩张产生的,因此作用于血管各层细胞,但血管平滑肌细胞(VSMCs)是其主要的靶细胞。 大量的体内外研究证实,机械牵张力调节血管平滑肌细胞的增殖、凋亡、迁移以及表型等生物学功能。一般认为,在正常情况下牵张力(9%～12%elongation)抑制平滑肌细胞的增殖、凋亡等功能,对于维持血管平衡具有重要调节作用,而在高血压、动脉粥样硬化等病理情况下,异常增高的牵张力(>15%elongation)则促进平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡等功能,诱导正常的血管结构改变和功能失调。近年来国内外学者对机械牵张力调控平滑肌细胞生物学功能的分子机制做了深入研究,认为细胞表面具有力学信号感受作用的各种分子可以将胞外的机械信号转化为胞内的化学信号,通过激活一系列的信号通路和转录因子,调节各种基因的表达,从而诱导细胞生物学功能改变。但是目前对这一机械信号转导过程中的诸多机制尚不清楚,比如细胞表面是否存在特异性的力学信号感受分子,细胞内各信号分子之间的相互作用模式,以及在转录水平之外的基因表达调节机制等。进一步深入了解牵张力调节细胞功能的分子机制,对于寻找新的高血压、冠心病等心血管疾病干预靶点具有重要的意义。 microRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小RNA分子,通过抑制靶基因的翻译或促进nRNA的降解在转录后水平负调控基因表达。研究证实,miRNAs在心血管系统的正常发育以及多种病理过程中发挥重要的调节作用。最近的研究发现,miRNAs也参与机械生物力调节血管细胞的生物学效应,与静止培养相比,剪切力诱导多个内皮细胞niRNAs表达改变,其中miR-19a与niR-23b在剪切力调控细胞周期中发挥关键作用,miR-92a介导剪切力对内皮细胞NO的水平的调控。但是关于牵张力对血管细胞miRNAs表达的影响,以及后者在牵张力介导的细胞生物学功能中的作用目前还不清楚。miR-21是近年广泛研究的一种miRNA,其在多种实体肿瘤细胞中表达升高,具有显著的促进细胞增殖、抑制细胞凋亡作用。此外,miR-21在血管细胞中也有丰富表达,并且在损伤血管中表达上调,促进新生内膜的形成。新近的研究发现,miR-21在内皮细胞中的表达受到剪切力的调节,并且不同形式的剪切力对miR-21表达的影响是不同的,miR-21分别在剪切力介导的内皮炎症、NO生成中发挥重要调控作用。miR-21在血管平滑肌细胞中的表达丰度明显高于内皮细胞中,鉴于miR-21在细胞增殖、凋亡调节中的作用以及机械牵张力对平滑肌细胞生物学功能的影响,我们推测牵张力可能通过调节miR-21在血管平滑肌细胞中的水平影响细胞功能。目前对miRNAs的研究多集中在其生物学效应方面,而对miRNAs本身的表达调控机制知之甚少,miR-21基因位于蛋白编码基因之间,具有独立的启动子区域,研究发现AP-1,NF-κB等转录因子可能参与miR-21表达调控,但是在牵张力的作用下,参与调节miR-21表达的转录因子尚不明确。深入了解miRNAs的表达调控机制有利于系统的认识牵张力调节血管平滑肌细胞功能的分子机制,因此,在本研究中我们也初步探讨牵张力调节miR-21表达的上游分子机制。 研究目的 1.在体外细胞水平,明确牵张力对血管平滑肌细胞miR-21表达的影响。 2.明确miR-21在牵张力介导的血管平滑肌细胞增殖与凋亡中的作用。 3.明确牵张力调节血管平滑肌细胞miR-21表达的分子机制。 研究方法1.入主动脉平滑肌细胞(HASMCs)培养 HASMCs细胞株购自美国ScienCell公司,细胞生长至完全融合后,吸去培养基,用PBS冲洗细胞一遍以去除残留的血清,然后加入适量预热的0.25%胰蛋白酶,在显微镜下观察到细胞细胞变圆后,吸去胰酶,加入新的平滑肌细胞完全培养基吹打均匀,转入新的细胞培养瓶放入含5%CO2的37℃细胞培养箱中继续培养。 2.机械牵张力干预体外培养的HASMCs 接种HASMCs至铺有Ⅰ型鼠尾胶原的Flexcell6孔板中(105细胞/孔),待细胞生长至80%～90%融合时,利用无血清培养基诱导培养24小时后,更换新的完全培养基或无血清培养基,使用Flexcell-5000细胞牵张力仪给予HASMCs不同强度的牵张力刺激,分

关键词： 乳腺癌   PTEN基因   MDA-MB-231细胞   生物学性状   侵袭能力   病理特征  

摘要： 目的:乳腺癌是我国女性常见的一种恶性肿瘤，抑癌基因的缺失或表达失调是乳腺癌发生、发展和侵袭转移的重要原因之一，PTEN在乳腺发育及乳腺癌发生中起重要作用，本研究目的在于探讨PTEN基因在乳腺癌细胞中的表达及对细胞生物学行为特性的影响，对于在基因水平上进行乳腺癌的诊断、治疗及预后判断具有重要的临床意义。　　方法:选择PTEN正常表达的细胞株MDA-MB-231(M231)，使用ShRNA方法沉默PTEN的表达，构建成PTEN低表达的M231细胞株(M231-3001)及对照组细胞(M231-scramble)，通过RT-PCR、Western-blot分析目的基因的表达抑制、通过CCK-8法、细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验等方法检测PTEN基因沉默后，M231乳腺癌细胞株、迁移及侵袭能力的改变。　　结果:与对照组(scramble-shRNA)相比，M231-3001细胞株的PTEN mNA和蛋白的表达都明显降低，PTEN-shRNA3001可明显地沉默PTEN基因的表达，从而构建成PTEN低表达的M231细胞株(M231-3001)，而且M231-3001细胞株相对于M231-Scr细胞株增生、繁殖力增强，同时迁移和侵袭能力增加。　　结论:PTEN基因表达降低可促进细胞增生、繁殖和存活;促进细胞迁移和侵袭，有利于癌细胞的发生和发展。因此，PTEN基因具有抑癌作用，PTEN基因的缺失有利于癌细胞的发生和发展，可以作为评价乳腺癌患者的进展、转移等预后的指标之一。

关键词： small molecules   stem cells   self-renewal   differentiation  

摘要： Stem cells, including both pluripotent stem cells and multipotent somatic stem cells, hold great potential for interrogating the mechanisms of tissue development, homeostasis and pathology, and for treating numerous devastating diseases. Establishment of in vitro platforms to faithfully maintain and precisely manipulate stem cell fates is essential to understand the basic mechanisms of stem cell biology, and to translate stem cells into regenerative medicine. Chemical approaches have recently provided a number of small molecules that can be used to control cell self-renewal, lineage differentiation, reprogramming and regeneration. These chemical modulators have been proven to be versatile tools for probing stem cell biology and manipulating cell fates toward desired outcomes. Ultimately, this strategy is promising to be a new frontier for drug development aimed at endogenous stem cell modulation.