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关键词： 脂肪干细胞   细胞培养   维生素C   细胞生物学  

摘要： 目的：⑴探索一种体外高效分离、扩增、纯化人脂肪干细胞(Human adipose-derivedstem cells, hADSCs)的方法，并通过形态学、多向诱导分化能力及免疫表型进行鉴定，从而建立一套快速、高效、稳定的hADSCs培养体系。为hADSCs的后期研究提供充足的细胞来源。⑵研究维生素C(Vitamin C，Vc)对hADSCs体外增值的影响，并初步探索其相关机制。　　 方法：①收集3例健康人的腹部皮下脂肪组织，通过改进组织块贴壁法，从脂肪组织中分离出脂肪干细胞，进行体外的扩增、纯化及观察其形态特征;通过将分离的细胞进行成脂、成骨诱导分化后用油红O和Von Kossa染色定性鉴定;应用流式细胞仪检测所分离细胞的表面抗原。②将Vc作用hADSCs后，CCK-8细胞计数试剂盒检测不同时间的吸光度值并绘制生长曲线;流式细胞仪检测hADSCs细胞周期的改变和对H2O2介导的细胞凋亡的保护作用;间接免疫荧光和Western Blot检测P53和Cyclin D1基因表达的变化。所得数据使用SPSS17统计软件分析。　　 结果：⑴原代及传代的hADSCs均呈长梭形或多边形贴壁生长，生长能力旺盛。传代后的细胞较快贴壁，迅速进入生长期，5d左右即可进行下一次传代。随着代数的增加，其他非ADSCs细胞逐渐减少，传代至第3代细胞时，细胞已相对纯化。⑵经成脂和成骨诱导培养基培养后，油红O染色和Von Kossa染色阳性。⑶细胞表面抗原表达:CD44，CD105，CD29和CD13高表达。相比之下，CD34，CD31和CD106几乎没有表达。⑷CCK-8结果显示Vc可促进细胞增殖，且40μg/ml的浓度已有明显的促增殖作用(P＜0.05)。⑸流式细胞仪分析结果所示，40μg/ml的Vc作用hADSCs24h后，G1期的细胞比例呈下降趋势，S期和G2期的细胞比例呈上升趋势，各时相与对照组比较差异均有显著性(P＜0.01)。并且Vc能对H2O2诱导的hADSCs凋亡起到明显的保护作用(P＜0.05)。⑹激光共聚焦和蛋白免疫印迹结果显示，与对照组相比，P53的蛋白表达水平降低，差异有显著性（P＜0.05）。而Cyclin D1的蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。　　 结论：①建立了一种相对成熟的hADSCs的体外培养方法，细胞增殖迅速，状态良好，生物学性质稳定，无过多的非ADSCs的干扰;综合细胞形态、细胞表面抗原标志鉴定及成脂诱导和成骨诱导培养的结果可以确定培养细胞为hADSCs。②Vc对hADSCs的增殖作用与Vc的浓度有关，40μ/ml的Vc已有明显的促增殖作用。同时考虑Vc促进hADSCs的生长与P53的上调及Cyclin D1的下调有关。

关键词： 鼻咽癌   放疗抗拒   紫杉醇耐药   侵袭   转移   上皮-间质转化  

摘要： 目的：研究鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs放疗抗拒性、紫杉醇敏感性及侵袭转移能力,并在课题组前期研究基础上通过体外实验对上皮-间质转化(EMT)与鼻咽癌放疗抗拒细胞生物学特性的相关性进行初步探讨。 方法：一、以鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs及其亲本细胞CNE-2为研究对象,检测鼻咽癌放疗抗拒细胞生物学特性：(1)CCK-8法、克隆形成实验及流式细胞术检测鼻咽癌细胞放疗抗拒性；(2)CCK-8细胞毒性实验检测鼻咽癌细胞对紫杉醇敏感性；(3)划痕愈合实验及Transwell小室侵袭实验检测鼻咽癌细胞体外迁移及侵袭能力。 二、显微镜观察鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs形态学改变；Western Blot检测鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs及亲本细胞CNE-2上皮-间质转化分子标志物表达情况,及鼻咽癌放疗前及放疗后残留组织标本EMT分子标志物表达水平。 结果：一、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs较其亲本细胞具有更强的放疗抗拒性：CNE-2-Rs细胞在4Gy、6Gy和8Gy不同放射剂量下均表现出更高的生存率(P均<0.01)；给予同一放射剂量,CNE-2-Rs细胞在第2天便出现更高的生存率(P均<0.05),且差异随天数逐渐增大；克隆形成实验显示CNE-2-Rs细胞较亲本细胞形成的克隆更大、数目更多；流式细胞术结果表明,给予4Gy放射线照射,72小时后CNE-2-Rs细胞凋亡率明显低于CNE-2细胞(22.43±0.18%vs38.07±0.66%,P<0.001)；而CNE-2-Rs与亲本细胞在未照射时细胞周期分布无差异,但给予4Gy放射线照射,72h后CNE-2-Rs细胞较亲本细胞处于S期(28.78±1.72vs21.42±1.09,P<0.05)和G2期(37.34+3.68vs24.66±1.68,P<0.05)细胞比例增多,处于G1期细胞减少(33.88±5.38vs53.91±1.6,P<0.05)。 二、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs获得了更强的紫杉醇耐药性：CNE-2-Rs和CNE-2细胞的紫杉醇药物IC50分别为8.53±3.61×10-1及6.28±2.37x10-2(nM)(P<0.001),CNE-2-Rs细胞的紫杉醇耐药指数为13.57±1.58。 三、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs获得了更强的体外迁移及侵袭能力：划痕愈合实验结果显示,放疗抗拒CNE-2-Rs细胞划痕愈合能力明显增强；Transwell小室侵袭实验显示与亲本细胞CNE-2相比,CNE-2-Rs细胞穿过Transwell小室的细胞数更多(86±6vs26±8)(P<0.01)。 四、鼻咽癌放疗抗拒细胞CNE-2-Rs及放疗后残留组织发生EMT改变：(1)放射线照射后CNE-2细胞失去了原本多边形紧密相连的上皮细胞形态,细胞变长并伴有伪足形成,细胞连接疏松,呈现成纤维细胞样形态。提示与CNE-2相比,CNE-2-Rs细胞发生了典型的EMT形态学改变。(2)与CNE-2细胞相比,CNE-2-Rs细胞上皮细胞标志物E-cadherin明显下调,而间质细胞标志物Vimentin明显上调。(3)与放疗前的组织标本相比,放疗后鼻咽癌残留组织中上皮细胞标志物E-cadherin的表达显著下调,而相反间质细胞标志物Vimentin的表达则显著升高。 结论：鼻咽癌放疗抗拒CNE-2-Rs细胞较其亲本细胞获得了更强的放疗抗拒、紫杉醇耐药及体外运动侵袭能力。放射线照射筛选放疗抗拒细胞,使得最终获得的放疗抗拒CNE-2-Rs细胞发生了典型的EMT形态学及分子标志物改变。该研究结果提示EMT改变可能与鼻咽癌细胞放疗抗拒、侵袭转移及紫杉醇耐药三种恶性生物学行为进展密切相关,为今后从同一个视角研究鼻咽癌上述三种恶性生物学行为奠定了实验基础。

关键词： p53上调凋亡调制物（PUMA）   定点突变   蛋白稳定性   细胞凋亡   Hela细胞  

摘要： p53上调凋亡调制物（p53upregulated modulator of apoptosis，PUMA）是一个具有强大促凋亡能力的BH3-only家族蛋白质基因。PUMA通常低表达，但PUMA在许多病理性应激因素可以通过一些转录因子（如p53、p73、E2F1和FOXO3a）上调其表达，借此诱导凋亡的反应。近两年研究发现一个新颖的调控机制：PUMA翻译后调控。转录体PUMA-α编码一个全长为193个氨基酸的蛋白，其中10号位丝氨酸是最重要的磷酸化位点。当10号位丝氨酸被丙氨酸取代可以减慢PUMA的降解、延长其半衰期、增加其稳定性、增强细胞凋亡的能力。 本课题旨在探讨针对PUMA蛋白10号位磷酸化位点突变的突变型与野生型PUMA蛋白对肿瘤细胞功能方面的差异及其可能的作用机制，为以后寻找更多PUMA蛋白翻译后调控机制梁奠定实验基础。目的： 观察突变型PUMA与野生型PUMA对肿瘤细胞生物学功能方面的差异，并探讨其诱导细胞凋亡的分子机制，此为深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻译后调节奠定实验基础。方法： 通过PCR方法从pCEP4-(HA)2-PUMA质粒中扩增PUMA基因，并克隆到pIRES2-EGFP载体上，构建PUMA真核表达载体pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA，利用定点突变技术构建pIRES2-EGFP-(HA)2-PUMA-T28G质粒，行PCR及测序鉴定；脂质体分别将两种质粒转染Hela细胞，RT-PCR检测PUMA的表达，Western blot检测突变型PUMA蛋白和标签蛋白的表达。 实验随机分为（1）空载质粒组（2）野生型PUMA组（3）突变型PUMA组，应用脂质体转染的方法分别将空载质粒、野生型PUMA质粒、突变型PUMA质粒转染Hela细胞中，转染24h及48h后用RT-PCR和Western blot方法检测各组PUMA表达情况；MTT及流式细胞术检测野生型PUMA与突变型PUMA对细胞增殖抑制和促凋亡作用；应用PI及Hoechst33342核染法观察野生型PUMA与突变型PUMA对细胞凋亡的形态学改变；野生型实验组和突变型实验组分别加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮后，Western blot方法检测PUMA蛋白的表达变化情况；RT-PCR方法检测PUMA及凋亡相关基因BAX、BCL-2的mRNA的表达变化；分光光度法检测细胞的Caspase-3活性变化。 结果： 经PCR及测序结果表明，正确构建野生型、突变型PUMA重组质粒，PUMA基因第10位氨基酸的第28～30位碱基由TCC突变为GCC，其他碱基均无突变。野生型、突变型PUMA重组质粒转染Hela细胞荧光显微镜观察到绿色荧光表达。Western blot和RT-PCR均检测出目的基因的高表达。提示PUMA基因及其定点突变载体均构建成功。 在相同转染效率的情况下，通过Western blot分析野生型PUMA组和突变型PUMA组的表达水平，结果表明突变型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一个更高的稳定状态。在表达野生型和突变的PUMA细胞中我们通过实时定量PCR测量出同等量的PUMA mRNA,表明并不是由于转染效率或不同的转录率导致的这种差异；接下来在转染24h后诱导表达野生型和突变型的PUMA细胞中均加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮，然后对PUMA蛋白的降解进行检测，结果表明，由于我们改变了PUMA蛋白的磷酸化位点，导致突变型PUMA蛋白降解延迟、半衰期延长,提示10号位丝氨酸磷酸化在决定PUMA降解率上具有重要的作用；野生型PUMA质粒、突变型PUMA质粒分别转染Hela细胞，在24、48小时后测定光密度值，结果发现细胞转染两种质粒后，细胞存活率随着时间的延长逐渐下降，且转染突变型PUMA质粒在24、48小时的存活率均比野生型PUMA质粒组低，差异有统计学意义(P<0.05)，这表明突变型PUMA对Hela细胞抑制增殖作用优于野生型PUMA；通过PI及Hoechst33342染色后评价细胞核型，计算被转染细胞中的早期和晚期凋亡细胞数。转染24h后，转染突变型PUMA组在GFP阳性细胞中有22.5%的细胞出现凋亡，空载体组只有11.8%，相比转染野生型PUMA组细胞中增加了约9.2%的细胞凋亡，差异有统计学意义(P<0.05)。而随着转染PUMA在细胞中表达时间的延长，48h后突变型PUMA组比转染野生型PUMA组细胞凋亡增加了约9.5%，差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术结果发现，随着PUMA转染时间的增加，野生型和突变型两组肿瘤细胞的凋亡率均逐渐升高，并且突变型组细胞比野生型组细胞的凋亡率增加更加明显，这与核染色结果相似。 转染突变型PUMA质粒作用Hela细胞，在0、6、12、

关键词： 膀胱肿瘤   TRPV2   钙离子通道   基因重组   真核载体   TRPV2   膀胱肿瘤   TRPV2   细胞增殖   基因治疗   迁移浸润  

摘要： 膀胱肿瘤是人类最常见的肿瘤之一,也是威胁人类健康导致人类死亡的重要原因之一。局限性的膀胱肿瘤对于人体的健康影响还是比较有限,但是膀胱肿瘤的快速生长导致的营养消耗,以及邻近组织的侵犯以及远处转移最终导致了患者的死亡。目前膀胱肿瘤的治疗手段是以手术治疗手段为主,辅助以放化疗及免疫调节治疗,但其治疗效果不能令人满意。寻求新的治疗成为目前膀胱肿瘤的预防与治疗的新思路,基因治疗成为目前的研究热点之一。TRPV2离子通道被证实可能与膀胱肿瘤的发生发展有密切关系,为此本实验为了探讨TRPV2对于膀胱肿瘤细胞株的体外影响,从而明确TRPV2基因作为膀胱肿瘤治疗的靶点的可能性。 本实验分为三个部分：(1)TRPV2在膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞株中的表达；(2)大鼠TRPV2真核表达载体的构建和鉴定；(3)TRPV2对5637、EJ细胞增殖和迁移的影响的研究。 第一部分：TRPV2在膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞中的表达 目的：检测TRPV2在膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞中的表达。 方法：常规细胞培养后,提取膀胱肿瘤细胞系5637,T24,EJ细胞的总RNA和总蛋白,分别通过RT-PCR和western blot检测TRPV2在上述细胞中的mRNA和蛋白水平的表达。 结果：5637,T24,EJ细胞RT-PCR和western blot在目的位置都检测到对应的条带,并且转录和翻译水平的条带辉度基本一致。T24、EJ细胞的条带辉度值明显高于5637细胞的辉度值。 结论：膀胱肿瘤细胞株5637,T24及EJ细胞的TRPV2在mRNA和蛋白水平都有表达。TRPV2在恶性度较高分化较差的膀胱肿瘤细胞株中表达量较高,而在分化相对较好恶性程度低的膀胱肿瘤细胞株的表达量较低。 第二部分：大鼠TRPV2真核表达载体的构建和鉴定 目的：构建含全长基因的TRPV2真核表达载体质粒。 方法：根据基因文库GenBank数据库中提供的大鼠源性的TRPV2的mRNA序列,设计全长目的序列的引物,通过双酶切将产物连入pcDNA3.1+质粒,构建重组质粒。基因测序鉴定重组质粒的碱基序列,和数据库提供的目的基因序列比对。 结果：酶切和基因测序表明获得了和预期大小一致,序列相同的基因片段,碱基序列通过测序和比对和基因文库提供的碱基序列一致。 结论：成功构建基于真核表达载体pcDNA3.1+重组质粒。 第三部分：TRPV2对膀胱肿瘤细胞株5637和EJ细胞增殖及迁移侵袭的影响 目的：探讨TRPV2离子通道对膀胱肿瘤细胞株5637和EJ细胞增殖及迁移侵袭的影响。 方法：分别将人膀胱癌EJ细胞株常规分为空白质粒对照组、正常细胞阴性对照组和sh-RNA干扰组；5637细胞组分为空白质粒对照组,正常细胞阴性对照组和TRPV2过表达质粒转染组进行实验。用lipofectamine2000介导针对TRPV2的sh-RNA转染EJ细胞,过表达TRPV2质粒转染5637细胞。经细胞筛选出单克隆阳性细胞后,采用Western blot检测TRPV2蛋白表达的变化鉴定基因的转染效率。流式细胞仪检测上述细胞生长周期,MTT法检测细胞生长曲线,划痕法检测细胞迁移侵袭能力,transwell法检测细胞的浸润能力。 结果：成功转染并且筛选出sh-RNA干扰TRPV2的EJ细胞和TRPV2转染的5637重组细胞。细胞仪分析检测发现经过干扰TRPV2后的EJ细胞的细胞周期的G1期(63.21%±5.6%)明显高于正常细胞组(47.34%±4.43%)和空质粒转染组细胞(49.3±4.86%)(P<0.05),差异有统计学意义。而细胞生长曲线结果显示三组不同处理的EJ细胞数目在第3天开始出现差异,发现含干扰质粒的细胞组的OD显著低于空白质粒组和正常细胞组的测量值(P<0.05)。而流失细胞术细胞周期分析TRPV2转染的5637细胞(60.36±5.89%)；空质粒转染的5637细胞(57.32±5.89%)；正常的5637细胞(59.04±3.72%),无明显的统计学差异(P>0.05)。三种细胞的一周内的生长曲线也无明显差异。划痕实验结果证实sh-RNA-TRPV2组的EJ细胞的迁移能力明显低于正常细胞组和空白质粒转染组(P<0.05),而过表达TRPV2质粒组转染的5637迁移能力明显高于正常细胞组和空白质粒转染组(P<0.05)。Transwell结果发现sh-RNA-TRPV2组的EJ细胞的穿膜细胞数(55.5±9.75)明显少于于正常细胞组(102.2±8.74)和空白质粒转染组(108.5±11.89)(P<0.05),而过表达TRPV2质粒组转染的5637穿膜细胞数(86.31±

关键词： 急性呼吸窘迫综合征   全氟化碳   脂多糖   A549   细胞生物学  

摘要： 【目的】从细胞生物学角度研究全氟化碳（PFC）对脂多糖（LPS）诱导A549细胞损伤的保护作用，为临床应用PFC治疗急性呼吸窘迫综合征（ARDS）提供理论依据。 【方法】常规传代培养人肺泡上皮样细胞A549，将其分为四组：①对照组：不作任何干预；②PFC（全氟辛烷）组：按10%体积比（PFC：培养液）加入全氟辛烷；③LPS组：干预时按100μg/ml的浓度加入LPS；④PFC+LPS组（共培养组）：按上述浓度同时加入PFC和LPS。检测以下四个方面：（1）不同组A549细胞给予相应处理后24h、48h及72h于倒置显微镜下观察形态学变化并拍照记录；（2）A549细胞按一定细胞数铺板，每组3个复孔，加药后每天应用细胞计数法计数各组细胞数目，共6天，绘制细胞生长曲线；（3）待细胞生长至融合状态时应用无菌枪头于融合单层细胞上划痕，其后按不同分组加药处理并同时换用含1%胎牛血清的培养液，以给药时刻为零时，分别于0h、24h及48h倒置显微镜下观察划痕愈合情况并拍照记录，imageJ(NIHImage1.55)软件计算各组划痕愈合面积百分比及划痕边缘细胞核间距；（4）A549细胞常规传代培养，按不同分组给药的同时换用含1%胎牛血清的培养液，24h后应用流式细胞术检测凋亡。 【结果】（1）细胞形态学显示LPS组较其它三组细胞明显稀疏，皱缩明显，部分细胞呈圆形，生长状态变差；其余三组细胞形态饱满，排列紧密，生长状态良好。（2）细胞生长曲线显示LPS组细胞增殖受抑制，LPS组与其余各组细胞数目的差异从加药后第四天开始均达到了统计学显著性（P＜0.05）。（3）划痕愈合实验显示LPS组48小时修复面积百分比：25.3±2.1%，对照组：42.8±0.9%，PFC组：37.0±2.9%，LPS+PFC组：33.2±3.9%。LPS组与其余各组相比差异均达到了统计学显著性（P＜0.05）。划痕边缘细胞核间距：LPS组：20.7±2.53um，对照组：25.2±3.91um，PFC组：24.9±3.53um，LPS+PFC组：24.5±2.98um。LPS组与其它各组相比差异均达到了统计学显著性（P＜0.05）。（4）流式细胞术检测A549细胞凋亡表明，对照组、LPS组、PFC组及LPS+PFC组的细胞凋亡率分别为：5.33±2.55%、35.76±5.15%、5.22±2.57%及13.39±4.34%；与对照组和PFC组比较，LPS作用于A549细胞24h后，细胞的凋亡率显著升高（P＜0.01）；与对照组比较，全氟化碳组细胞凋亡率的差异无统计学意义；与LPS组比较，共培养组干预24h后，A549细胞的凋亡率显著降低（P＜0.01）。 【结论】（1）PFC能够显著改善LPS对A549细胞形态及生长状态的不良影响。（2）PFC能够显著改善LPS对A549细胞增殖的抑制作用。（3）PFC能够显著改善LPS对A549细胞划痕愈合能力的抑制作用，且此改善作用与其对A549细胞迁移能力的保护作用相关。（4）PFC能够显著减少LPS诱导的A549细胞凋亡。

关键词： 脱氢表雄酮   原代大鼠睾丸间质细胞   细胞增殖   线粒体功能   睾酮   信号通路  

摘要： 脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)作为胆固醇代谢途径中的重要中间产物,是机体中各种类固醇激素合成的重要前体。已有研究表明,DHEA在调节机体神经系统、免疫系统、骨质代谢、脂肪代谢等方面都发挥着重要作用。目前,大多数学者认为,DHEA主要是在外周靶组织/靶细胞中转化为睾酮或雌二醇而发挥其特有的生物学功能。睾丸间质细胞分布于睾丸曲精小管间的疏松结缔组织,其主要功能是合成和分泌睾酮,血浆睾酮的95%由睾丸间质细胞分泌。本实验室前期研究结果表明,外源性添加DHEA可促进不同生理期实验大鼠血清中睾酮和雌二醇的分泌；在TM-3细胞(小鼠睾丸间质细胞系)上证实,DHEA处理可显著抑制TM-3细胞的增殖,但却能够显著增强TM-3细胞线粒体的功能；同时发现DHEA在TM-3细胞内主要向睾酮和雌二醇进行转化,但其具体机制还不是很清楚。因此,本试验在分离、纯化和鉴定原代大鼠睾丸间质细胞的基础之上,探讨DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞增殖、细胞周期、线粒体膜电位等生物学特性的影响；在证实DHEA影响原代大鼠睾丸间质细胞合成睾酮的基础之上,重点从蛋白水平上检测DHEA对类固醇激素合成过程中代谢关键酶表达的影响,继而探讨MAPK-ERK信号通路以及核转录因子CREB在调节原代大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮中的作用。研究旨在揭示DHEA对特定靶细胞的生物学特性的影响,并从信号转导通路的角度深入阐明其调节靶细胞合成类固醇激素的作用机制,以期为深入阐明DHEA的生物学功能提供理论基础和实验依据。 1DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞增殖特性的影响 本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象,探讨DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞增殖以及细胞周期的影响。以含DHEA终浓度分别为0mol/L.1μmol/L.50μmol/L和100μmol/L的培养液孵育细胞24h后,分别采用倒置相差显微镜观察和EdU法检测DHEA对细胞增殖的影响；流式细胞术检测不同浓度的DHEA处理6h、12h、24h和48h后,其对原代大鼠睾丸间质细胞周期的影响：Real-time PCR检测DHEA处理细胞24h后,细胞周期相关因子***2和CyclinB mRNA表达水平的变化。结果表明,倒置相差显微镜下可观察到DHEA具有明显抑制细胞增殖的作用；EdU法检测进一步证实,50μmol/L和100μmol/L DHEA处理能够抑制细胞增殖。与对照组相比,100μmol/L DHEA处理12h-48h,可显著升高原代大鼠睾丸间质细胞中S期细胞的比例、降低G2/M期细胞比例(P<0.01)；50μmoyL DHEA处理48h,可显著升高S期细胞的比例,降低G2/M期细胞比例(P<0.01)。与对照组相比,100μmol/L DHEA处理可显著降低原代大鼠睾丸间质细胞中CyclinA和CDK2mRNA的表达水平(P<0.05),但不同浓度的DHEA处理对CyclinB mRNA的表达均未达到统计学上的显著影响(P>0.05)。提示,DHEA处理可显著抑制原代大鼠睾丸间质细胞增殖,其主要机制是DHEA可显著抑制细胞周期相关因子CyclinA和CDK2mRNA的表达水平,致使原代大鼠睾丸间质细胞滞留于S期,从而抑制细胞的增殖。 2DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞线粒体功能的影响 本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象,探讨DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞线粒体结构和功能的影响。用不同浓度DHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞后,分别采用MTT法检测细胞活力、透射电镜观察细胞线粒体形态及数目、流式细胞术检测线粒体膜电位(△Ψm)、试剂盒法测定琥珀酸脱氢酶(SDH)活性变化。结果显示,与对照组相比,0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L.50μmol/L,100μmol/L和200μmol/L DHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞24h-48h,不同浓度的DHEA处理均可极显著提高细胞的活力(P<0.01)。1μmol/L,50μmol/L和100μmol/L DHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞48h,细胞线粒体形态和数目与对照组相比均无显著性变化(P>0.05)。与对照组相比,不同浓度的DHEA处理均可降低原代大鼠睾丸间质细胞线粒体的膜电位；其中100μmol/L DHEA处理可极显著降低细胞线粒体膜电位(P<0.01)。1μmol/L DHEA处理对胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性并无显著影响(P>0.05),但50μmol/L和100μmol/L DHEA处理可极显著提高胞内SDH的活性(P<0.01)。结果提示,DHEA处理可降低原代大鼠睾丸间质细胞线粒体的膜电位而使其通透性增加,同时其可通过提高SDH的活性而增强自身氧化代谢水平,从而显著提高原

关键词： 医学   医学院校   教材   细胞生物学  

ISBN: (纸本)9787030380401

摘要： 本书共15章，内容包括绪论、细胞生物学研究方法、细胞的分子基础、细胞膜及物质跨膜运输、细胞的内膜系统、细胞核、细胞骨架、线粒体、细胞连接与细胞外基质、细胞信号转导、细胞增殖、细胞分化、细胞衰老与死亡、干细胞、细胞工程等。

关键词： 细胞低氧   间充质基质细胞/细胞学   细胞分化   细胞增殖   细胞运动   综述  

摘要： 机体内间充质干细胞（MSC）处于相对低氧环境（体积分数为1％～7％）与常氧环境（体积分数为20％）时表现出不同的生物学特性。低氧诱导因子1α（HIF-1α）作为低氧环境下的主要转录调控因子，广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、糖酵解及血管生成等方面的调控。近年来发现，HIF-1α在对MSC存活、分化及迁移的调控中起重要作用。MSC处于低氧环境时，通过对HIF-1α及其下游基因的调控，可提高MSC的存活率，促进其成软骨分化，抑制成脂分化，增强迁移能力，但对成骨分化能力的影响仍存在争议。不同组织来源、氧体积分数及诱导培养条件等均会对MSC的生物学特性造成影响。因此不同实验结果的比较应在统一的实验条件基础上进行。拟从低氧对MSC的增殖、凋亡、分化及迁移的影响作一综述。

关键词： 肝脏移植   排斥反应   RNA干扰   细胞生物学  

摘要： 本文对干预供肝CⅡTA与MyD88基因表达抑制大鼠肝移植排斥反应进行了实验研究。本研究分为三个部分：　　 第一部分：纳米载体HGPAEs的制备及检测。　　 目的：制备纳米载体组氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)并观察其体内应用的安全性与有效性。　　 方法：制备纳米载体组氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)，并对其进行性能测试;设置生理盐水组、纳米载体组和纳米载体质粒组，经门静脉注射体内转染大鼠肝脏，采取转染后第一天和第三天肝脏标本和静脉血，应用全波长酶标仪检测方法评价体内肝脏转染效果，并检测大鼠肝肾功能变化。　　 结果：成功制备了纳米载体组氨酸接枝聚（β-氨基酯）(HGPAEs)，经验证其具有作为基因载体的必备条件;第一天和第三天纳米载体质粒组的增强型绿荧光蛋白荧光强度均显著强于生理盐水对照组和纳米载体组(P＜0.01)，纳米载体质粒组第三天荧光强度强于第一天(P＜0.01);转染术后第一天，与正常值比较，各组ALT、AST均显著升高(P＜0.01)，但各组间比较无明显差异(P＞0.05)，转染术后第三天，各组生化指标均趋于正常。　　 结论：纳米载体组氨酸接枝聚（β-氨基酯）制备简便，是一种安全高效的基因载体;以纳米载体为介导经门静脉注射的方法可使shRNA质粒在体内肝脏获得高效转染。　　 第二部分：纳米载体介导沉默基因CⅡ TA和MyD88表达的体内研究。　　 目的：观察RNA干扰对免疫识别相关基因CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88表达的抑制效果。　　 方法：设置生理盐水对照组、纳米载体组、纳米载体pHK-shRNA组和纳米载体pCⅡ TA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组、纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组三个干预组，通过门静脉注射方法体内转染大鼠肝脏，转染后第三天取肝脏，以荧光定量PCR和western blot分别检测肝脏转染后CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88基因mRNA和蛋白水平的表达变化。　　 结果：荧光实时定量PCR和western blot检测显示纳米载体pCⅡ TA-shRNA组和纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组CⅡ TA和MHCⅡ基因mRNA和蛋白表达均较生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组显著降低(P＜0.01);纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组MyD88基因mRNA和蛋白表达较生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组也有显著降低(P＜0.01);而纳米载体组、纳米载体pHK-shRNA组与生理盐水组之间CⅡ TA、MHCⅡ和MyD88基因无论mRNA还是蛋白表达均无显著性差异(P＞0.05)。　　 结论：以纳米载体(HGPAEs)为介导经门静脉注射的方法，应用针对CⅡ TA和MyD88的shRNA质粒转染大鼠肝脏，可显著抑制肝脏CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因表达。　　 第三部分：干预供体移植物抑制大鼠肝移植排斥反应的研究。　　 目的：观察抑制供体肝脏CⅡ TA和MyD88基因的表达对高应答大鼠原位肝移植模型移植排斥反应的影响，探讨其抗排斥机制。　　 方法：建立高应答大鼠原位肝移植模型;设置生理盐水组、纳米载体组、pHK-shRNA纳米载体组、纳米载体pCⅡ TA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组，各组采用经门静脉注射的方法干预供体大鼠肝脏，干预后3天取肝脏进行肝移植，每组各12只大鼠，于移植术后第5天随机选取6只大鼠取静脉血和移植肝脏，病理切片确定排斥反应分级，分别采用荧光定量PCR和western blot检测肝脏中CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88基因在mRNA和蛋白水平的表达变化，流式细胞术检测血中CD4/CD8细胞比例， ELISA法检测血清IL-2和IFN-γ浓度，并检测肝功能，其余6只用于观察存活期。　　 结果：稳定建立高应答大鼠原位肝移植模型;与生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组相比，纳米载体pCⅡ TA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pCⅡ TA-pMyD88-shRNA组大鼠存活时间明显延长（中位生存期16天、14天和21天vs10天、9天和8天，P＜0.01），排斥反应病理分级明显降低(P＜0.01)，CⅡ TA、MHC-Ⅱ和MyD88的mRNA转录水平和蛋白表达量均明显降低(P＜0.01)，血液CD4/CD8细胞比例显著降低(P＜0.01)，血清IL-2和IFN-γ浓度显著降低(P＜0.01)，AST、ALT和TBIL也显著降低(P＜0.01)。　　 结论：高应答大鼠原位肝移植模型是研究肝移植排斥反应的理想动物

关键词： 义齿种植   细胞生长   成骨分化   细胞生物学  

摘要： 目的：观察体外条件下高糖和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF)对人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stemcells，hMSCs)成骨分化的影响。\n 方法：使用人骨髓间充质干细胞在两种葡萄糖浓度即5.5mmol/L（对照组）和25mmol/L（实验组）葡萄糖浓度下培养6天，使用cck-8法测定各组细胞增殖情况;hMSC在两种糖浓度的成骨诱导液下进行成骨诱导28天，使用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒定量检测碱性磷酸酶的活性，茜素红染色钙结节及用5％SDS-HCI脱色后测量茜素红的吸光度值进行钙结节半定量检测，对比各组细胞成骨分化能力;在两种葡萄糖浓度的成骨诱导液中加入10ng/ml bFGF，通过RT-PCR检测技术检测各组细胞骨钙素(OCN)骨桥蛋白(OPN)基因表达差异。\n 结果：cck-8检测结果显示，细胞接种后第1、2天实验组和对照组的细胞数量相当，第2-4天进入对数生长期，实验组细胞生长速度较慢，有早进入平台期的趋势，且进入平台期后细胞数量下降快;实验组ALP浓度显著低于对照组;茜素红钙结节染色结果显示实验组细胞形成漩涡状形态和产生钙结节的时间都略晚于对照组，且最后形成的结节总数少于对照组，经5％SDS-HCI脱色后测量茜素红的吸光度值实验组显著低于对照组;RT-PCR检测成骨相关基因的表达结果显示，25mmol/L组OCN、OPN的基因表达量低于5.5mmol/L组(P＜0.05），当加入bFGF后，25mmol/L组的OCN、OPN的表达量仍低于5.5mmol/L，但与未添加bFGF的同葡萄糖组比较表达量增加。\n 结论：高糖使hMSC增殖能力下降，在成骨分化的过程中ALP活性降低，成骨相关基因OCN、OPN表达量下降，证明了高糖对hMSC成骨分化具有抑制作用，当加入bFGF后，改善了高糖对hMSC的抑制作用，提示糖尿病条件下高糖的存在是导致hMSC成骨分化能力下降的不利因素，同时初步证明bFGF参与了成骨分化的过程，从而在糖尿病患者种植义齿骨结合形成相关机制方面进行初步的探讨。