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关键词： 细胞生物学   生命   山东大学   科学前沿   研究所   医学院   表观遗传学   密码  

摘要： 年终岁末,在渐行渐远的岁月更替中,表观遗传学的精彩还在继续演绎。一个新的发现可能创造一个全新的研究领域,一个新的发现可能彻底颠覆经典理论,每一位科学家都是这一领域的弄潮儿,他或推动着表观遗传学深刻地变革,或默默填补表观遗传学认知的鸿沟。2012年,点亮生命之光的是谁？奏响生命之歌的是谁？想必其中一定有他的名字。2012年,他的研究被《科技日报》列为一周（8月27日—9月2日）国际要闻报道（2012-09-03二版）;2012年,他的研究发表在影响因子高达25.9的《细胞—干细胞》上,

关键词： 卵巢肿瘤   RNA,小分子干扰   血蛋白质类   糖蛋白类   蛋白酶抑制蛋白质   类,分泌  

摘要： 目的探讨ITIH4基因表达下调对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞生物学功能的影响。方法设计4对ITIH4基因小分子干扰RNA（siRNA）片段，分别为ITIH4．546、ITIH4—795、ITIH4—917和ITIH4．1568，脂质体法瞬时转染ITIH4mRNA高表达的卵巢癌细胞系H08910pm细胞，荧光定量逆转录（RT）PCR技术检测转染后H08910pm细胞中ITIH4mRNA的表达，选择最佳沉默效应的siRNA干扰片段（即ITIH4—917），构建重组表达载体pGPU6／GFP／Neo—shRNA—ITIH4-917质粒，转染H08910pm细胞，氨基糖苷类抗生素（G418）筛选，获得稳定转染细胞系pGPU6／GFP／Neo—shRNA—ITIH4—917一H08910pm细胞，用于以下实验。实验分为3组，即重组表达载体pGPU6／GFP／Neo—shRNA—ITIH4—917质粒转染H08910pm细胞组（ITIH4—917转染组）、空载体pGPU6／GFP／Neo—shRNA质粒转染H08910pm细胞组（空载体组）、阴性对照载体pGPU6／GFP／Neo—shRNA—ITIH4一NC质粒转染H08910pm细胞组（阴性对照组），采用荧光定量RT—PCR技术和蛋白印迹法分别检测3组细胞中ITIH4mRNA和蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测3组细胞的增殖情况[以吸光度（A）值表示]，流式细胞仪检N3组细胞的细胞周期比例，体外集落形成实验检测3组细胞的集落形成情况，穿膜（transwell）小室体外侵袭实验检测3组细胞的体外迁移、侵袭能力（以A值表示）。结果荧光定量PCR技术检测显示，ITIH4—546、ITIH4—795、ITIH4-917和ITIH4—1568瞬时转染后，H08910pm细胞中ITIH4mRNA的表达水平分别为1．24±0．74、0．30±0．09、0．26±0．15和0．71±0．35，以ITIH4—917瞬时转染后H08910pm细胞中ITIH4mRNA表达水平最低，故选择ITIH4—917用于以下实验。荧光定量RT—PCR技术检测显示，ITIH4—917转染组细胞中ITIH4mRNA的相对拷贝数为0．34±0．10，明显低于空载体组（1．87±0．12，P=0．008）和阴性对照组（1．58±0．21，P=0．032）；蛋白印迹法检测显示，ITIH4-917转染组细胞中ITIH4蛋白的相对表达水平为0．51，明显低于空载体组（1．64，P=0．012）和阴性对照组（1．74，P=0．014）。MTF比色法检测显示，ITIH4—917转染组细胞的增殖速度明显快于空载体组和阴性对照组，分别比较，差异均有统计学意义（P=0．001）。流式细胞仪检测显示，ITIH4-917转染组细胞S＋G2／M期细胞的比例为54．2％，明显高于空载体组和阴性对照组（分别为26．3％和31．3％，P〈0．05）。体外集落形成实验检测显示，ITIH4—917转染组细胞的集落形成率为（55．7±0．7）％，明显高于空载体组[（29．7±0．9）％，P=0．037]和阴性对照组[（31．4±0．3）％，P=0．043]。体外迁移和侵袭能力实验显示，ITIH4．917转染组细胞的迁移能力为0．40±0．18，明显高于阴性对照组（0．30±0．03，P=0．031）和空载体组（0．25±0．03，P=0．028）；ITIH4—917转染组细胞的侵袭能力为1．31±0．34，虽高于阴性对照组的1．05±0．68和空载体组的1．14±0．08，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论采用siRNA干扰片段对卵巢癌细胞中ITIH4基因进行干扰，有效地抑制其ITIH4基因的表达，并使卵巢癌细胞的增殖速度加快、迁移能力增强。

关键词： 肝细胞癌   GPC3过表达   生物学功能   抑癌基因  

摘要： [目的]\n GPC3是一种膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在肝癌组织中有特异性的高表达。目前大多数学者主要通过抑制GPC3在肝癌细胞中的表达，检测肝细胞癌的生物学行为改变明显受到抑制，从而认为GPC3是作为一种促癌基因对肝癌细胞起作用。但是在间皮瘤、卵巢癌细胞系、乳腺癌和肺癌中发现GPC3是由于其启动子的过甲基化而造成蛋白表达缺失，提示GPC3可能发挥抑癌基因作用，而且在肝癌的研究中也发现类似现象。本课题选择高表达GPC3基因的huh-7细胞，通过上调GPC3的表达后检测huh-7细胞的生物学功能的变化，旨在进一步研究GPC3在肝癌中发挥抑癌基因的作用。\n [方法]\n 1、通过脂质体法将GPC3基因过表达真核表达质粒瞬间转染至Huh-7细胞。\n 2、应用荧光定量PCR和Western Blot检测GPC3mRNA和蛋白的表达，验证GPC3基因过表达。\n 3、采用Annexin V-FITC/PI双染经流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。\n 4、利用EDU检测细胞增殖。\n 5、运用Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。\n [结果]\n 1、构建基因GPC3 CDS克隆入真核表达载体pcDNA3.1+中的GPC3测序F为5\'GATTCAGCCTTGGACATCAATG3\'，与原始序列完全一致，表明已成功构建GPC3真核表达载体pcDNA3.1+，可以用于后续过表达实验。\n 2、GPC3真核表达载体pcDNA3.1+瞬时转染Huh-7细胞72h后荧光定量PCR和Western Blot检测显示GPC3mRNA和蛋白表达都明显高于对照组，表明成功上调Huh-7细胞的GPC3表达水平，可进行后续的细胞生物学行为研究实验。\n 3、在过表达Huh-7细胞组、Huh-7细胞组和NC组中，在G1期的细胞数分别为(49.77±2.08)％、（49.28±1.0）％和（50.29±1.52）％(P＞0.05);在G2期的细胞数分别为（7.92±1.0）％、(11.89±2.0)％和(12.49±0.58)％(P＜0.05);S期所占的细胞数分别为(42.31±3.06)％、(38.83±1.73)％和（37.22±2.0）％(P＜0.05);表明过表达GPC3将Huh-7细胞分裂周期阻滞在S期。\n 4、在过表达Huh-7细胞组、Huh-7细胞组和NC组中，细胞凋亡率分别为（23.71±0.01）％、（9.4±0.02）％和（9.19±0.01）％(P＜0.01);表明过表达GPC3后能够明显诱导Huh-7细胞的凋亡。\n 5、在过表达Huh-7细胞组、Huh-7细胞组和NC组中，瞬时转染GPC3过表达质粒48小时后，细胞增值率分别为（87.06±1.58）％、（90.12±1.93）％和（91.02±0.35）％（P＜0.05），提示GPC3过表达后可使Huh-7细胞的增殖降低。\n 6、在过表达Huh-7细胞组、Huh-7细胞组和NC组中，细胞迁移率分别为(14.03±0.92)％、（54.60±1.01）％和（32.87±0.29）％（P＜0.01），这说明过表达GPC3能够抑制Huh-7细胞的迁移。\n 7、在过表达Huh-7细胞组、Huh-7细胞组和NC组中，细胞侵袭分别为（4.93±0.38）％、（7.13±0.83）％和(10.53±0.06％)(P＜0.05)，表明过表达GPC3后Huh-7细胞的侵袭能力明显受到抑制。\n [结论]\n 将过表达GPC3真核表达载体pcDNA3.1+GPC3瞬时转染Huh-7细胞后，能够将Huh-7细胞分裂周期阻滞在S期，促进细胞的凋亡，抑制细胞增殖，并且能明显抑制细胞的迁移和侵袭能力，表明GPC3在Huh-7细胞中能够发挥抑癌基因作用。

关键词： 癌症细胞   细胞代谢   基因表达   细胞生物学  

摘要： 同源异型蛋白Prox1(Prospero homeobox1)是果蝇Prospero蛋白在脊椎动物中的同源物，它在眼球、视网膜、肝、胰以及淋巴管等器官和细胞类型的形成过程中起着重要的作用。目前，对Prox1作用机制的了解还处在起步阶段。已有的研究结果显示Prox1能与核受体LRH-1、HNF4α相互作用并抑制靶基因如CYP7A1和SHP的表达，然而Prox1作为辅抑制因子的作用机制还不清楚。另有研究结果显示Prox1可能在肿瘤发生和转移以及胆汁酸代谢调控方面发挥作用。本研究分为两个部分：\n 第一部分：Prox1通过表观遗传机制辅抑制CYP7A1的转录。通过免疫共沉淀联合质谱分析技术鉴定与Prox1相关蛋白的方法研究Prox1介导的辅抑制作用的可能机制。实验结果发现表观遗传抑制性复合体LSD1/NuRD的各组分，尤其是其中具有酶活性的蛋白LSD1和HDAC2与Prox1存在相互作用，GST-Pulldown实验证明Prox1与LSD1存在直接相互作用。在HepG2细胞和小鼠肝脏细胞中，通过ChIP实验发现Prox1与LSD1和HDAC2共定位于CYP7A1的启动子区。并进而通过RNAi技术KnockdownHepG2细胞内源Prox1蛋白表达发现，Prox1可以招募LSD1和HDAC2到CYP7A1启动子区从而引起H3K4的去甲基化。随后用胆汁酸处理HepG2细胞，可以观察到明显的CYP7A1转录抑制，并导致Prox1和LSD1/NuRD复合物在CYP7A1启动子区募集增多，同时在启动子区发生H3K4的去甲基化和组蛋白H3/H4的去乙酰化。这些结果显示Prox1通过与LSD1的相互作用募集抑制性复合物LSD1/NuRD到CYP7A1启动子区并通过相应的表观遗传机制发挥辅抑制作用。并且这种Prox1介导的表观遗传方面的抑制作用可能参与了生理条件下胆汁酸负反馈调控CYP7A1的转录抑制过程。\n 第二部分：Prox1对Wnt信号通路传导的影响。Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育和肿瘤发生的过程中起着重要作用，我们通过在293T细胞和肝癌细胞株Huh7细胞中Wnt信号通路活性的启动子分析发现Prox1可以激活Wnt信号通路，并在初步探索中发现Prox1可能是通过抑制CDH1的蛋白表达水平从而导致β-catenin不能被锚定在细胞膜上进而入核激活Wnt信号通路。

关键词： 系统工作   科学家   免疫   人体   最新成果   科学中心   学术论文   细胞生物学  

摘要： 国际权威学术期刊《自然》在线发表了中科院上海生科院生物化学与细胞生物学研究所／国家蛋白质科学中心（上海）许琛琦研究员领导的研究组的最新成果，首次证明钙离子能改变脂分子功能来帮助T淋巴细胞（简称T细胞）活化，提高T细胞对外来抗原的敏感性，从而帮助机体清除病原体。这项新成果对治疗自身免疫病、慢性病毒感染、肿瘤等多种与T细胞相关的疾病有很好的指导意义。该论文也是新成立的国家蛋白质科学中心（上海）的第一篇学术论文。

关键词： 血管发育   中枢神经系统   三维网络   神经退行性疾病   分子细胞生物学   细胞机制   阴阳   功能障碍  

摘要： 脑血管网络是一个高度复杂且精细的三维网络。脑血管发育的异常和功能障碍将影响中枢神经系统的组织代谢和气体交换,脑血管的异常与中风、神经退行性疾病等紧密相关。然而,由于重视程度的不足和技术手段的限制,人们对脑血管网络发育的机制仍知之甚少。中国科学院神经科学研究所杜久林组利用斑马鱼作为模式动物,运用活体共聚焦成像技术,结合计算机辅助图像处理和分子细胞生物学等手段,研究了脑血管网络的发育规律和机制。他们发现发育过程中脑血管网络存在大量的血管修剪,从而在结构上导致脑血管网络复杂度降低,在功能上促进动脉至静脉的血流效率。血管修剪在机制方面是由于血流变化引起了血管内皮细胞的迁移。这项研究揭示了血管修剪在脑血管网络发育中的重要作用,并阐明了一种新颖的导致血管修剪的细胞机制,这可能将引领血管发育领域对血管修剪的功能和机制进行更深入的研究。

关键词： PBL模式   生物技术专业   细胞生物学  

摘要： 细胞生物学是生物技术专业的基础课,发展迅速,且与其他生命科学交叉渗透,难于理解。为了激发学生的学习热情,提高学生分析问题和解决问题的能力,同时提高课堂教学质量,在细胞生物学的改革实践中,在传统教学的基础上,引入了PBL模式教学。实践证明PBL模式教学取得了较为满意的效果,同时也存在一些不足。

关键词： 机体衰老   核纤层蛋白   ROS水平   细胞生物学  

摘要： 目的：核纤层及核纤层蛋白能维持细胞的正常核形态及生物学功能。细胞中不能被加工或截短的核纤层蛋白堆积导致DNA损伤修复缺陷和衰老加速。核纤层蛋白及其结合蛋白正成为细胞衰老研究的重要对象。前期研究发现，A型核纤层蛋白前体(prelamin A)的特异性识别因子Narf(nuclear prelaminArecognition factor,Narf)在细胞中与prelaminA能较好地共定位于核纤层，Narf蛋白的C端386～456aa可能为相互结合的非必需区，过表达Narf后的初步结果显示衰老细胞增多。本文拟进一步用荧光共定位方法证明Narf蛋白的C端386～456aa区域对于与prelamin A结合是非必需;检测金属蛋白酶Zmpste24敲除小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)中Narf的定位;检测Zmpste24-/-和lamin A编码基因LMNA敲除（LMNA-/-）细胞中Narf的表达水平;探讨Narf过表达和干扰细胞中活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平的变化，以期揭示prelaminA堆积和缺失引起的细胞衰老是否通过Narf和ROS的改变来实现。\n 方法：构建N端(1-78aa)或C端(386-456aa)截短的Narf突变体融合表达载体pEGPP-N1-NarfBC和pEGPP-N1-NarfAB，与带有红色荧光标记的prelamin A共同转染人胚胎肾细胞（HEK293T），荧光显微镜下观察Narf的突变体与prelaminA的共定位情况;免疫荧光方法检测Narf在Zmpste24-/-MEFs中定位与对照相比是否发生改变;用Western blotting和qRT-PCR检测Zmpste24-/-和LMNA-/-MEFs中Narf的表达情况，并检测prelamin A，laminA及progerin过表达的HEK293T细胞中Narf的水平;在HEK293T中过表达或干扰Narf的表达，用酶标仪检测细胞中ROS水平，并用Western blotting检测细胞中超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)水平。\n 结果：C端386-456aa截短的Narf突变体主要集中分布在细胞核中，与prelamin A能共定位于核纤层，但共定位荧光偏弱。N端1-78aa缺失的Narf突变体与prelaminA完全不能共定位，前者主要分布于细胞质中，后者则集中于细胞核。原位杂交结果显示Zmpste24-/-MEFs中Narf分布于细胞核和细胞质中，而对照野生型细胞中Narf分布在细胞核中。Zmpste24-/-MEFs和prelamin A，lamin A及progerin过表达的HEK293T细胞中Narf的表达量均无明显变化，而LMNA-/-MEFs中Narf的表达量明显降低。Narf过表达细胞中ROS和SOD表达无显著改变，而Narf千扰细胞中ROS显著上升，SOD的表达水平相应升高。\n 结论：Narf的C端386-456aa区域是与prelamin A结合的非必需区，N端1-78aa则是Narf核定位及与prelaminA相互作用所必须的。细胞中prelamin A堆积影响Narf的定位，使部分Narf蛋白分布于细胞质中。Prelamin A，lamin A及progerin堆积均不影响Narf蛋白水平，而laminA基因缺失Narf蛋白水平明显降低，表明prelaminA和laminA的缺失可能影响了Narf因的表达，或者是影响Narf蛋白的降解。Narf过表达不影响细胞的氧化应激，但Narf下调细胞中ROS和SOD水平明显升高，说明Narf下调影响了细胞的氧化应激能力。结果表明prelamin A堆积细胞的衰老与Narf系不明显，而prelamin A缺失导致的衰老和氧化应激水平上调可能部分通过Narf的途径来实现。

关键词： 动态生化信号   Y型微流控剪切装置   剪切流   细胞生物学   信号传输  

摘要： 细胞微环境中除了微流体流动引起的动态变化的剪应力外，还包含多种浓度随时间变化的生化因子，即动态生化信号，这些动态生物力学和生化信号对细胞功能和细胞行为起重要的调控作用。近年来,微流控芯片技术成为离体构建细胞微环境用以研究细胞与微环境相互作用的重要实验技术平台。但现有的大多数研究将细胞暴露于恒定浓度的生化环境中，仅能为细胞加载单一的生物力学或生化信号，并且忽略了微通道传输特性对动态生化信号传输的影响，导致无法实现对离体细胞生物力学或生化动态微环境的精确控制。\n 基于流体力学和微流控芯片技术，本文设计了一种流量法控制两种动态生化信号快速切换刺激的Y型微流控剪切装置。该装置能对离体培养的细胞精确加载剪应力和不同动态生化信号的组合切换刺激用于细胞生物学分析。将Y型微流控剪切装置的混合通道看作信号传输系统，考虑微通道内定常流和单向振荡流流速分布、Taylor-Aris弥散、分子横向扩散、通道尺寸等因素的影响，系统分析了混合微通道的传输特性和动态生化信号在混合微通道内的传输规律。\n 在定常流情况下，利用分离变量法求解混合微通道内动态生化信号传输的Taylor-Aris弥散控制方程，得到了混合微通道信号系统传递函数和截止频率的解析表达式。数值计算结果表明混合微通道信号系统具有低通滤波特性，其截止频率是由微通道高度日、流体动力粘度μ、分子扩散系数D、传输距离z和剪应力τw决定的函数。\n 在单向振荡流情况下，用数值仿真方法分析了振荡流频率、振荡流幅度、平均流量和传输距离对微通道内动态生化信号传输的影响。结果表明，振荡流频率接近于生化信号频率时，振荡流对生化信号传输有明显的非线性调制作用;增大振荡幅度将加剧生化信号的非线性失真程度。摄动分析结果表明，振荡流与动态生化信号的非线性相互作用是导致振荡流与定常流中生化信号传输产生差异的根本原因。\n 本文工作有助于理解动态生化信号在动态微环境中的传输规律，同时也为运用微流控芯片技术离体构建动态的细胞微环境时相关微通道传输系统的优化提供了一定的理论依据。

关键词： 生长因子抑制剂   胰岛素依赖型   糖尿病性黄斑水肿   糖尿病小鼠   行业   表皮生长因子   细胞生物学   视力损害  

摘要： 胰岛素联合生长因子抑制剂可减少糖尿病小鼠的视力损害 在2002年12月17日的美国细胞生物学学会年会上，克利夫兰医学中心的研究人员发言指出，胰岛素和一种表皮生长因子betacellulin（BTc）抑制剂联合应用，可以限制胰岛素依赖型糖尿病小鼠糖尿病性黄斑水肿的病变发展，但是需要在糖尿病患者中进一步实证。