关键词:
小分子水凝胶
腺病毒
肝细胞生长因子
骨髓
间质干细胞
摘要:
目的 观察小分子水凝胶(SMH)结合腺病毒(Ad)介导的肝细胞生长因子(HGF)基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)生物学特性的影响.方法 取第9代MSC株进行实验,分为普通培养下MSC对照组(MSC组)、普通培养下转染Ad-HGF的MSC组(Ad-HGF+MSC组)、在SMH中培养的转染Ad-HGF的MSC组(SMH+Ad-HGF+MSC组)、在SMH中培养的MSC组(SMH+MSC组).将Ad-HGF转染MSC,48 h后流式细胞仪检测转染率.采用实时定量PCR检测MSC组、Ad-HGF+MSC组、SMH+Ad-HGF+MSC组细胞转染48 h后的mRNA水平.采用ELISA法测定Ad-HGF+MSC、MSC、Ad-EGFP+MSC、SMH+Ad-HGF+MSC组细胞上清液中HGF蛋白的含量,持续至转染后23 d.普通显微镜观察比较MSC组、SMH+MSC组、Ad-HGF+MSC组、SMH+Ad-HGF+MSC组细胞在转染继续培养7d后的形态.MTT法检测各组细胞1~7d的生长情况,绘制生长曲线.流式细胞仪检测转染2周后各组细胞表面标志物和细胞周期.各组细胞在5-aza诱导24 h后继续培养3周,免疫荧光化学检测细胞向心肌样细胞分化的能力情况.结果 Ad-HGF转染MSC 48 h后,转染率为74.7%.转染后48 h,MSC组Ct值为14.99;SMH+Ad-HGF+MSC组Ct值为8.38;Ad-HGF+MSC组Ct值为8.51;转染两组均出现明确的HGF基因表达.Ad-HGF+MSC组、SMH+Ad-HGF+MSC两组上清中均有HGF蛋白分泌,Ad-HGF+MSC组转染后48 h含量达最高峰,为121 μg/L,持续至23 ***+Ad-HGF+MSC组HGF含量高峰在第3天,达118μg/L,持续至23 ***组、Ad-HGF+MSC组细胞均呈成纤维细胞样生长,而转染或未转染Ad-HGF的MSC细胞在SMH水凝胶中三维培养时,细胞多为棒状,一些成球形,细胞之间的分支连接紧密,有聚集生长的趋势.Ad-HGF+MSC组与MSC组细胞生长曲线相似,各时间点吸光度A值差异无统计学意义,生长趋势吻合.SMH+MSC组与SMH+Ad-HGF+MSC组细胞生长速度前4d与MSC、Ad-HGF+MSC组比较,吸光度A值差异均无统计学意义;4d后细胞的吸光度A值则较Ad-HGF+MSC组、MSC组细胞明显升高(均P<0.05).SMH培养的两组细胞生长趋势吻合,各时间点吸光度A值比较差异无统计学意义.2周后SMH+MSC、Ad-HGF+MSC、SMH+Ad-HGF+MSC、MSC组细胞的CD44、CD90、CD49的阳性表达率均较高,而CD45、CD34、CD31的阳性表达率均较低,相同抗原各组之间表达率差异均无统计学意义.4组细胞的G0-G1期、S期、G2-M期的细胞比例差异均无统计学意义.经5-aza诱导MSC 24 h后并继续培养3周,SMH+Ad-HGF+MSC、Ad-HGF+MSC、SMH+MSC组细胞cTnT阳性表达率较MSC组明显增高[(27.07±6.49)%、(21.43±6.75)%、(28.12±7.26)%比(20.09±4.17)%,均P<0.05],SMH+Ad-HGF+MSC组细胞cTnT阳性表达率较Ad-HGF+MSC、MSC组明显增高,而与SMH+MSC组差异无统计学意义.结论 SMH作为三维培养载体有利于细胞的生长增殖.MSC经Ad-HGF基因修饰后结合SMH培养并没有改变其细胞表面标志物及细胞周期.SMH结合Ad-HGF基因修饰有可能促进5-aza对MSC的诱导分化作用.