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关键词： 骨折愈合   成骨细胞   Smad1蛋白   细胞生物学  

摘要： 目的：⑴以C2C12成肌细胞为研究模型，就IRAK-4对成骨细胞分化BMP-Smad通道的影响做出初步研究，为后期深入研究炎症对骨折愈合的影响建立初步的实验参考和基础。⑵更深入了解炎症启动、级联反应瀑布及其对骨折愈合的影响机制，为感染性骨折的针对性治疗提供理论基础。<br>　　 方法：C2C12细胞是骨骼肌组织中分离出的肌卫星细胞，在不同的培养条件下具有不同的分化潜能。文献报道C2C12细胞有分化为成骨细胞的潜力，是研究成骨细胞分化的理想细胞模型。C2C12细胞均以1×105个细胞/ml密度接种于6孔培养板中培养，随机分为3组，每组加入不同刺激物继续培养。(1)A组:空白组，细胞悬液中不加入任何刺激物;(2)B组:BMP-2组，在细胞悬液培养体系中加入1μg/ml BMP-2培养;(3)C组:BMP-2+IRAK-4siRNA转染组，在细胞悬液培养体系中加入1μg/ml BMP-2培养并用IRAK-4siRNA100pmol对细胞进行瞬时转染。分析各组成骨细胞分化ALP成骨活性，RT-PCR检测Smad1 mRNA表达水平，免疫组化和蛋白质印迹检测P-Smad1蛋白表达水平。<br>　　 结果：成骨细胞分化ALP活性测定显示:B组的ALP活性显著高于对照组A组，C组又较B组显著升高，各组差别有统计学意义(P＜0.05，表1、图3、4)。细胞免疫组化结果:B组P-Smad1表达活性高于对照组A组，C组又显著高于B组（图5）。RT-PCR结果显示:各组Smad1 mRNA表达对比不具有显著性，无统计学意义（P＞0.05，表2、图6）。Western Blot结果:B组P-Smad1蛋白表达高于对照组A组，C组又显著高于B组（图7）。<br>　　 结论：①C2C12成肌细胞加入不同刺激物联合培养建立IRAK-4对成骨细胞分化BMP-Smad通道的影响模型具有操作简单，易于控制，实验结果稳定，重复性好等优点。②BMP-2具有增强体外培养的C2C12细胞成骨效应表达的作用。③IRAK-4可抑制BMP-2诱导的C2C12细胞的成骨效应表达，其中成骨相关的蛋白Smad1的磷酸化水平被抑制可能是关键因素之一。

关键词： γδT细胞   杀伤功能   TCRγδ   NKG2D   Vavl   PLC-γ1   Cbl-b  

摘要： γδT细胞能够以主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)非限制性方式识别多种肿瘤相关抗原,有效的杀伤肿瘤细胞,并能分泌干扰素(interferon, IFN)-γ等细胞因子。因此,γδT细胞已成为当前恶性肿瘤免疫治疗中一种很有前景的候选细胞。 γδT细胞表面除表达γ和δ链组成的T细胞受体(T cell receptor γδ, TCRγδ)外,还表达自然杀伤(natural killer, NK)细胞的重要功能受体NKG2D。这两种受体分子在γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤中发挥重要的作用。目前,大部分文献报导倾向于γδT细胞活化为TCRγδ依赖性的,而NKG2D仅起共刺激作用。然而,为什么单独的TCRγδ刺激即可活化γδT细胞,NKG2D的共刺激作用又是如何发挥的?只有进一步回答这些问题,才能澄清γδT细胞生物学效应(主要为细胞毒效应)的分子机制,尤其是信号转导机制。 鉴此,本研究主要针对以下三个科学问题展开：一是γδT细胞杀伤肿瘤细胞的主要效应途径是什么?二是TCRγδ和NKG2D在活化γδT细胞杀伤功能中的具体作用是什么?三是γδT细胞杀伤功能活化的调控机制是什么?本文分以下两部分就上述三个科学问题进行研究。 第一部分工作旨在进一步澄清γδT细胞杀伤肿瘤细胞的相关机理。首先,我们比较了穿孔素-颗粒酶和Fas-FasL两条途径在γδ T细胞杀伤肿瘤细胞中的贡献。我们选取了五种不同组织来源的肿瘤细胞作为γδT细胞杀伤途径研究的靶细胞,包括Daudi(人Burkkit淋巴瘤细胞)、G401(人肾癌Wilms细胞)、NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)、HR8348(人结直肠癌细胞)和MGC-803(人胃癌细胞)。流式细胞术检测结果表明,这五种不同组织来源的肿瘤细胞表面Fas受体呈现不同程度的表达：Daudi为5.14%、G401为7.24%、NCI-H556为44.10%、HR8348为69.40%以及MGC-803为82.30%。然后,对这五种Fas受体表达水平不同的肿瘤细胞进行穿孔素-颗粒酶途径及Fas-FasL途径的封闭实验。结果表明,封闭穿孔素-颗粒酶途径后,γδT细胞对这五种肿瘤细胞的杀伤能力均显著降低,而封闭Fas-FasL途径对γδT细胞杀伤能力无显著影响。随后的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)结果显示,穿孔素-颗粒酶途径封闭的γδT细胞与靶细胞共孵育后分泌IFN-γ的能力亦显著降低。而Fas-FasL途径封闭后,γδT细胞分泌IFN-y的能力无显著变化。以上结果表明γδT细胞杀伤肿瘤细胞的主要途径为穿孔素-颗粒酶途径。 随后,利用激活抗体包被的P815靶细胞杀伤体系,探讨了TCRγδ和NKG2D在活化γδT细胞杀伤功能中的作用,并分析了二者功能存在差异的原因。P815靶细胞杀伤实验结果表明,单独给予抗TCRγδ抗体刺激即可活化γδT细胞,杀伤抗体包被的P815靶细胞,并分泌IFN-γ;而单独的抗NKG2D抗体刺激却不能活化γδT细胞的杀伤功能,也不能引起IFN-γ的分泌。然而,抗NKG2D抗体可以增强抗TCRγδ抗体刺激所引起的γδT细胞的杀伤功能和分泌IFN-γ的能力。流式细胞术检测结果表明,抗TCRγδ抗体和抗NKG2D抗体均可引起γδT细胞的脱颗粒反应；激光共聚焦检测结果表明,单独的抗TCRγδ抗体刺激即可引起γδT细胞裂解性颗粒的极化,单独的抗NKG2D抗体刺激却不能。尽管如此,抗NKG2D抗体可以在某种程度上增强抗TCRγδ抗体所引起的裂解性颗粒极化。结合杀伤实验结果,提示引起γδT细胞裂解性颗粒极化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT细胞杀伤功能方面存在功能差异的主要原因。 第二部分研究工作旨在明确调控γδT细胞杀伤功能活化的相关信号通路。首先对γδT细胞杀伤功能相关的活化信号通路进行了研究,主要集中在Vavl信号通路、磷酸脂酶C-γ1(Phospholipase C-γ1, PLC-γ1)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, Erk)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信号通路等四条与αβ T细胞和NK细胞活化相关的信号通路。运用Western blot技术,证实了单独的抗TCRγδ抗体刺激即可显著性活化Vav1信号通路、PLC-γ1信号通路以及Erk信号通路；而单独给予抗NKG2D抗体刺激则无此作用

关键词： 瘢痕疙瘩   自分泌运动因子   成纤维细胞   生物学特征  

摘要： 目的：观察自分泌运动因子（autocrine motility factor，AMF）对体外培养的人真皮及瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学特性（包括细胞增殖、抗凋亡和迁移运动）的影响。 方法：对2011年11月至2012年6月间重庆医科大学附属第一、第二医院接受包皮切除术患者10例和接受瘢痕疙瘩切除术患者9例，分别取其切除部位的真皮和瘢痕疙瘩组织，提取两种组织的成纤维细胞。将培养的人真皮及瘢痕疙瘩成纤维细胞均分为AMF实验组和空白对照组。采用MTT法、流式细胞术和Transwell小室迁移运动模型分别检测两组细胞的增殖活性、细胞周期及细胞凋亡情况和细胞迁移运动能力。探讨AMF实验组和空白对照组之间成纤维细胞生物学活性特点和关系。 结果：经4-5周原代培养后，其中人真皮组织8例及瘢痕疙瘩组织4例成功培养出成纤维细胞。AMF实验组体外人真皮和瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力（0.709±0.028；0.800±0.018）均高于对照组（0.610±0.024；0.705±0.018）（t=9.13，p＜0.001；t=16.086，p＜0.001），细胞凋亡率（5.11±0.30；4.93±0.19）%均低于对照组（13.40±0.64；9.63±0.37）%（t=30.94，p＜0.001；t=26.221，p＜0.001），细胞运动迁移能力（71.9±4.5；161.2±5.3）高于对照组（50.2±5.9；122.7±4.6）（t=5.35，p＜0.001；t=15.668，p＜0.001）。空白对照组中，人瘢痕疙瘩成纤维细胞的抗凋亡能力和运动迁移能力均强于真皮成纤维细胞（p＜0.05）。 结论：人瘢痕疙瘩成纤维细胞的抗凋亡能力，运动迁移能力强于真皮成纤维细胞。AMF具有提高正常人体真皮及瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、运动迁移和抗凋亡能力的作用，提示该因子与瘢痕疙瘩的肿瘤学特征有密切关系，为进一步研究瘢痕疙瘩的发病机制和治疗靶点提供了新的思路和方向。

关键词： SATB2   结直肠癌   干细胞相关基因   CD133   启动子   基因调控   miR202  

摘要： 在肿瘤的发生、发展过程中,肿瘤干细胞起着非常重要的作用。结直肠癌在我国是仅次于乳腺癌和肺癌、发病率位列第三的恶性肿瘤。因此,阐明结直肠癌干细胞的作用及其调控因素对于结直肠癌的临床治疗及预后判断都具有重要意义。SATB2是一种特异性的核基质结合蛋白,与SATB1同源,参与染色质重构和基因表达调控,与颅脑和骨骼的发育及干细胞分化相关。前期课题组发现,SATB2与干细胞相关基因存在相关关系,并预测到SATB2与部分干细胞相关基因启动子区域存在结合。SATB2对结直肠癌干细胞的影响及其机制仍不清楚,尚需进一步的研究。研究方法：***2干扰对结直肠癌细胞生物学特性的影响我们将包装有SATB2干扰质粒的病毒感染结直肠癌SW480细胞及DLD1细胞,运用CCK8、FN、平板克隆形成实验、Transwell小室及裸鼠皮下成瘤实验观察SATB2于扰对结直肠癌细胞系细胞生物学行为的影响。2. SATB2对结直肠癌细胞干性的影响及其机制肿瘤干细胞的特性包括肿瘤细胞的自我更新及其分化能力。我们应用条件性干细胞培养基进行肿瘤干细胞克隆球培养,观察SATB2干扰后细胞的自我更新能力的差异。通过Western Blot、免疫组织化学及细胞免疫荧光检测：SATB2干扰后细胞中干细胞标志物CD133的改变。用生物信息学软件预测SATB2与干细胞相关基因启动子区域的结合位点,应用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immune co-precipitation technology,Chip)验证SATB2与干细胞相关基因的启动子区域存在结合。3. SATB2参与miR202对Dicer调控中的作用生物信息学软件预测miR202的潜在靶标蛋白Dicer,并应用Western blot进行验证。在结直肠癌细胞中过表达SATB2,并通过QPCI检测细胞中miR202的改变。在结直肠癌细胞中过表达SATB2及与miR202模拟物共转染,用Western blot进行检测细胞中靶蛋白Dicer的改变。结果***2干扰对结直肠癌细胞生物学特性的影响FN实验结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的粘附能力明显增强,差异具有统计学意义(F=71.123,P=0.000);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=39.280,P=0.000)。CCK8法结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=6.301,P=0.000),SW480-5-C2细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=25.907,P=0.000);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的增殖能力明显增强,差异具有统计学意义(F=3.807,P=0.000),DLD1-5-C11细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=8.774,P=0.000)。细胞平板克隆形成实验结果显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的平板克隆形成明显增强,差异具有统计学意义(F=5.832,P=0.001),SW480-5-C2细胞的平板克隆形成明显减弱,差异具有统计学意义(t=3.216,P=0.015);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的平板克隆形成明显增强,差异具有统计学意义(F=24.066,P=0.000),DLD1-5-C11细胞的平板克隆形成明显减弱,差异具有统计学意义(t=2.650,P=0.045)。体外运动小室实验显示,与SW480-NC细胞相比,SW480-2、SW480-5细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(F= 32.281,P=0.000),SW480-5-C2细胞的迁移能力明显增强差异具有统计学意义(t=3.833,P=0.004);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-2、DLD1-5细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(F=28.901, P=0.000), DLD1-5-C11细胞的迁移能力明显增强,差异具有统计学意义(t=3.579,P=0.006)。裸鼠皮下成瘤实验显示,与SW480-NC细胞相比,***480-5-C8细胞的皮下成瘤能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=3.480,P=0.003);与DLD1-NC细胞相比,DLD1-5细胞的皮下成瘤能力明显增强,差异具有统计学意义(F=14.172,P=0.001);DLD1-5-C11细胞的皮下成瘤能力明显减弱,差异具有统计学意义(F=5.876,P=0.023)。2. SATB2对结直肠癌细胞干性的影响及其机制干细胞成球试验显示,与SW480-NC细胞相

关键词： Importazole   Fenretinide   多发性骨髓瘤   侧群细胞   NF-κB   细胞凋亡  

摘要： 【研究目的】 1.探讨入核受体抑制剂Importazole (IPZ)对多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)细胞生物学特性的影响及其可能的作用机制。 2.探讨维甲酸衍生物Fenretinide对MM侧群细胞生物学特性的影响及其可能的作用机制。 【研究方法】 一、入核受体抑制剂Importazole对多发性骨髓瘤细胞生物学特性的影响 1.通过免疫荧光技术观察骨髓瘤细胞系、原代细胞及正常人单个核细胞NF-κB、Importin β的表达和定位。 2.不同浓度IPZ处理骨髓瘤RPMI8226、NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11、原代细胞、正常人单个核细胞，用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法检测细胞的活力；流式细胞术测定细胞周期和细胞凋亡。Western blot(WB)法检测细胞核内NF-κB的蛋白表达。电泳迁移位移实验(electrophoretic mobility shiftassay,EMSA)检测核内NF-κB的DNA结合活性。RT-PCR检测NF-κB信号通路下游靶基因的变化。 3.干扰Importin β后WB检测干扰效率，免疫荧光观察NF-κB在细胞中的定位，流式细胞术检测细胞凋亡。 二、维甲酸衍生物Fenretinide对多发性骨髓瘤侧群细胞生物学特性的影响。 1．用不同浓度Fenretinide处理骨髓瘤RPMI8226、NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11、原代细胞、正常人单个核细胞，用MTT法检测细胞的活力，流式细胞术检测细胞凋亡。 2．基于侧群(side population, SP)细胞对核染料(Hoechst33342)的排斥反应，借助流式细胞仪检测Fenretinide、硼替佐米、地塞米松（单用及合用）处理后NCI-H929SP细胞比例的变化。 3．分选NCI-H929SP和主群(main population, MP)细胞，将分选后的SP和MP细胞分别予Fenretinide、硼替佐米、地塞米松（单用及合用）处理，用MTT法检测细胞的活力，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。 4．集落形成实验检测Fenretinide单用或与硼替佐米、地塞米松联合用药对SP细胞集落形成能力的影响。 5．检测Fenretinide对SP和MP细胞活性氧的影响。 【研究结果】 一、入核受体抑制剂Importazole对多发性骨髓瘤细胞的影响 1. Importin β在多发性骨髓瘤原代细胞中高表达。 2.干扰NCI-H929细胞Importin β表达后可抑制NF-κB入核并诱导细胞凋亡。 3. IPZ呈时间浓度依赖方式抑制骨髓瘤RPMI8226、NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11细胞增殖及诱导凋亡。 4.8μM IPZ分别作用RPMI8226和NCI-H929细胞24h，可以诱导S期细胞分别由(53.55±0.94)％、(52.42±1.16)％减少至(45.19±1.62)％、(42.27±1.02)％；明显抑制NF-κB入核进而影响其与DNA的结合活性。同样浓度IPZ作用于CD138+骨髓瘤原代细胞2h可即可抑制NF-κB入核，16h可显著诱导细胞凋亡。但对正常人骨髓单个核细胞的诱导凋亡作用并不明显，与不加药组对比，无统计学差异。 5. IPZ可抑制骨髓瘤原代细胞NF-κB信号通路下游靶基因BCL-2、C-IAP1、XIAP的表达。 二、维甲酸衍生物Fenretinide对多发性骨髓瘤侧群细胞的影响。 ***呈浓度依赖方式抑制RPMI8226、 NCI-H929、LP-1、SKO-007、KMS11细胞的增殖。 ***单用或与硼替佐米、地塞米松合用可明显降低NCI-H929SP细胞的比例(p<0.05)。 3．经分选后的SP细胞周期主要处于G0/G1期，而MP细胞主要处于S期与G2期。 4．硼替佐米、地塞米松单用与合用对骨髓瘤SP细胞无明显杀伤作用。Fenretinide单用或与硼替佐米、地塞米松合用可诱导SP细胞凋亡。 ***细胞的集落形成能力强于MP细胞，硼替佐米和地塞米松对NCI-H929SP细胞的集落形成能力影响不大，而Fenretinide及含Fenretinide的联合用药均可显著降低NCI-H929的SP细胞的集落形成能力。 ***通过促使细胞产生活性氧诱导细胞凋亡。 【研究结论】 1．入核受体抑制剂IPZ通过抑制P65入核，阻断激活的NF

关键词： 水牛脂肪干细胞   生物学特性   表面抗原   诱导分化   表观遗传修饰  

摘要： 本研究从水牛腹股沟处脂肪组织中,通过胶原酶消化法分离出水牛脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),观察原代及传代后细胞形态。将分离得到的细胞用低糖-DMEM(Dulbecco,s modified Eagle，s medium low glucose,LG-DMEM)和 α-MEM(α modified Eagle's medium)培养和传代,进行生长曲线的评定,建立一种适合水牛ASCs分离和培养的方法。利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法检测水牛ASCs多能性相关基因表达情况,选择适当抗体,利用流式细胞技术,检测水牛ASCs多种表面抗原的表达情况,将水牛ASCs体外诱导分化(成脂、成骨、成软骨)后进行相关检测,初步探索水牛ASCs的诱导分化能力。利用实时荧光定量PCR(quantitive real time PCR,qRT-PCR)的方法检测水牛ASCs表观遗传修饰情况,探索水牛ASCs作为供体细胞并提高核移植效率的可行性。研究取得如下结果。(1)分离所得的原代ASCs细胞比血红细胞较大,在显微镜下呈单细胞悬液状态,接种4h后开始贴壁,48h后细胞呈现梭型或多边形。7-8d后细胞生长汇合并停止生长,呈长梭型、多角形-成纤维细胞样,体外培养10代细胞核型正常,表达多能性相关基因如Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc和klf4,表明具有ASCs一般的生物学特性。细胞生长曲线的测定结果发现,LG-DMEM更适用于水牛ASCs的扩增培养,细胞倍增时间(population doubling time,PDT)平均为 2.071d。(2)利用流式细胞技术对水牛ASCs多种表面抗原表达情况进行了检测。结果显示,水牛ASCs表达间充质干细胞的表面标记如CD13、CD29、CD44,而造血干细胞的表面标记如CD45、CD31呈阴性。水牛ASCs经诱导后可成为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞,且表达这些细胞的相关特异性基因,说明水牛ASCs具有多向分化的能力。(3)通过qRT-PCR方法检测了不同代数水牛ASCs与水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibr,oblasts,BFF)中 HDAC1、Dnmtl 的表达情况,比较了水牛ASCs的DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平与BFF的差异。结果显示,所测不同代数的水牛ASCs的Dnmtl表达量极显著低于BFF(p<0.01);在HDAC1表达量上,P2、P5、P9及P11水牛ASCs显著低于P4代BFF(p<0.05),但P4和P7代水牛ASCs与BFF并无明显差异(P>0.05)。这结果表明,水牛ASCs具有较高的组蛋白乙酰化及较低的DNA甲基化水平,可能比BFF在核移植后更易于细胞核的重编程。上述结果表明,胶原酶分离法可分离得到水牛ASCs,且具有ASCs一般的生物学特性;LG-DMEM较a-MEM更适合用于水牛ASCs的扩增培养;水牛ASCs可以表达多能性相关基因如Oct4、Sox2、c-Myc、Nanog和klf4,以及间充质干细胞标记抗原(CD13,CD29,CD44),但不表达造血干细胞的表面抗原(CD31、CD45),且具有成脂、成骨、成软骨的多向分化潜能;水牛ASCs的HDAC1(除P4、P7代)、Dnmtl表达量均显著低于BFF,说明水牛ASCs具有较高的组蛋白乙酰化及较低的DNA甲基化水平,可能较BFF 更适合作为核移植供体细胞。

关键词： 医学   细胞生物学   高等职业教育   医学遗传学  

ISBN: (纸本)9787030370013

摘要： 本书共15章，包括细胞生物学知识、遗传学和各类遗传病的基础知识、群体中的基因、肿瘤遗传学、药物与遗传等。

关键词： CCD   RUNX2基因   牙囊细胞   生物学特性  

摘要： 前言 牙囊在牙齿萌出过程中有着至关重要的作用,萌出从本质上来说是发育中的牙齿在牙槽骨中的迁移,其骨内阶段涉及到骨吸收形成萌出通道、根分叉区的骨形成、牙根生长以及基底部骨沉积将萌出中的牙齿移动到萌出通道上,这些事件均由牙囊调控。研究证实牙齿萌出相关分子基因及其产物定位在牙囊中,如CSF-1、c-fos、RUNX2,调控着牙齿萌出所需的成骨-破骨过程。有证据表明成骨细胞特异性转录因子RUNX2在牙囊持续高表达,并在分子层面上调控牙齿的萌出,然而其具体机制仍需要进一步探索。 颅骨锁骨发育不良(CCD)是一种少见的遗传性疾病(MM119600),多为常染色体显性遗传。CCD表现为全身骨骼和牙齿发育不良,口腔表现为乳牙滞留、恒牙迟萌以及多生牙。RUNX2是CCD患者的致病基因,其杂合突变、基因插入、缺失等是造成CCD的重要原因。 本研究以RUNX2基因突变对于未萌牙牙囊细胞(human dental follicle cells,HDFC)生物学特性的影响为切入点,通过分析RUNX2基因突变时牙囊细胞生物学特性的改变及对破骨相关基因表达的影响,探讨RUNX2通过调控牙囊内基因的表达而参与牙齿萌出的可能作用。以下从CCD病例的收集、牙囊细胞的分离鉴定及生物学特性的变化三部分简要概括本研究的内容如下。 第一章颅骨锁骨发-育育不良综合症患者的临床资料收集和突变检测 目的：收集CCD病例,获取RUNX2基因突变患者牙囊组织,为后续实验打下基础。 方法：对具有相关临床症状的先证者详细采集病史,明确单发或家族聚集倾向;利用×线检查全面了解患者及其父母的全身骨骼发育情况;详细进行口腔检查,记录恒牙萌出及乳牙迟萌以及埋藏牙、多生牙等典型临床症状;综合上述临床资料,明确诊断。取CCD患者及其姐姐的静脉血,抽提基因组DNA,1%琼脂糖电泳检查抽取的DNA质量,用核酸及蛋白定量仪对其进行定量,PCR扩增RUNX2的序列,纯化PCR产物,进行双向直接测序,对RUNX2基因测序结果进行核酸序列同源性比较分析(Blastn),分析突变位点;结果：收集到一例CCD患者,具有明显的临床特征,符合临床诊断。RUNX2基因测序结果核酸序列同源性比较分析(Blastn)发现在Exon2上发现插入TG碱基突变,突变型为c.30910insTG。患者姐姐及父母无明显CCD临床表现,患者姐姐基因组DNA未发现RUNX2突变位点,为散发病例。 结论：发现RUNX2基因c.30910insTG突变位点为该患者的致病基因突变位点,而且该位点为首次检出的新的突变位点。 第二章RUNX2+/m人牙囊细胞的分离培养和鉴定 目的：建立携带RUNX2基因突变位点c.30910insTG的人牙囊细胞体外培养体系RUNX2+/m HDFC。 方法：选取CCD患者埋伏恒牙的牙囊作为实验组(RUNX2+/m),要求恒牙上方没有滞留乳,牙囊完整;对照组：牙位、年龄、性别与实验组匹配的正常人埋伏恒牙牙囊,牙囊完整。运用组织块法对两组牙囊进行体外原代、传代培养,第3代细胞制备细胞爬片进行波形丝蛋白和角蛋白免疫细胞化学染色鉴定其细胞来源。选取CCD患者(RUNX2+/m)及正常对照组(RUNX2+/+)第3代牙囊细胞(DFCs),使用Trizol一步法分别提取细胞内总RNA,紫外分光光度计测量所抽提的RNA浓度和纯度,反转录成cDNA, PCR扩增RUNX2序列,测序并行BLAST核酸序列同源性比较分析,验证全血基因组测序结果。取两组细胞cDNA,用SYBR Green实时定量PCR法检测RUNX2基因mRNA表达量,计算相对表达量。裂解两组牙囊细胞,BCA法行总蛋白定量,变性蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,半干法转膜,封闭、杂交,ECL化学发光及图像采集分析,计算灰度值。 结果：组织块法成功体外培养人牙囊细胞,细胞呈长梭形、纺锤形、不规则三角形,随着培养时间的增加,细胞增殖呈放射状,实验组和对照组原代牙囊细胞生长状况和形态相似。经差速消化法传代排除上皮细胞的混杂,到第2代时已不见上皮细胞存在。免疫细胞化学检测示两组牙囊细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。所提取基因组DNA的浓度均约为10μg/ml,大小约20Kb,OD260/OD280>1.8,获得的基因组DNA的浓度、长度、纯度可以满足PCR反应要求。基因8个外显子的PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,在Marker的相应大小处均有相应条带。实验组患者的RUNX2基因测序结果核酸序列同源性比较分析(Blastn)发现在Exon2上发现插入TG碱基突变,突变型为c.309一310insTG。该突变导致第104位的谷氨酸GAG(W)移码突变为色氨酸TGG(W),并在第144位提前产生TAG终止密码子,使RUNX2蛋白翻译中止,引起c端部分氨基酸丢

关键词： 妊娠期糖尿病   过氧化物酶体增殖物激活受体γ   糖代谢   脂代谢   细胞外作用  

摘要： 第一部分PPARγ蛋白在GDM孕妇及正常妊娠孕妇外周血、新生儿脐血及羊水中的表达 目的：通过检测GDM孕妇及正常妊娠孕妇外周血、新生儿脐血及羊水中PPARγ蛋白的表达,了解PPARγ是否在人体液组织内表达,并比较其在GDM孕妇与正常妊娠孕妇的体外表达有无差异。 方法：选取在复旦大学附属妇产科医院产科2012年10-11月足月妊娠行选择性剖宫产的GDM孕妇和正常妊娠孕妇各30例,孕38-41周期间选择性剖宫产手术时采集孕妇外周血、新生儿脐血及羊水。ELLSA方法检测GDM孕妇及正常妊娠孕妇外周血、新生儿脐血及羊水中PPARγ蛋白的表达。 结果：GDM足月妊娠孕妇血浆中PPARγ蛋白浓度(0.201ng/ml)高于正常足月孕妇血浆中PPARγ蛋白浓度(0.153ng/ml),其差异有显著性(P<0.001)。 GDM足月妊娠新生儿脐带血浆及羊水中PPARγ蛋白浓度与正常足月孕妇新生儿脐带血浆及羊水中PPARγ蛋白浓度,无统计学差异。 结论：本研究首次发现了细胞内的核转录因子PPARγ蛋白在细胞外液即人体液组织中的表达,我们推测PPARγ可能通过一定的机制由细胞内释放至细胞外,并且为了维持胎儿体内及羊水中PPARγ蛋白的稳态,GDM孕妇外周血的PPARγ蛋白反应性的增高,但PPARγ蛋白影响母胎界面细胞功能需要进一步研究。 第二部分PPARγ蛋白在GDM孕妇胎盘、羊膜、绒毛膜的定位 目的：通过分析GDM孕妇胎盘、羊膜、绒毛膜上PPARγ蛋白的定位表达,了解PPARγ蛋白在母胎界面可能的功能。 方法：选取在复旦大学附属妇产科医院产科2012年10-11月足月妊娠行选择性剖宫产的GDM孕妇的胎盘、羊膜、绒毛膜组织各5例。免疫组化方法检测PPARγ蛋白的表达。 结果：在GDM孕妇的胎盘组织中,PPARγ阳性表达,主要表达在合体滋养细胞核,细胞滋养细胞未见明显表达。在GDM孕妇羊膜组织中,PPARγ阳性表达,表达主要位于羊膜上皮层中的单层立方上皮细胞的细胞核内、成纤维细胞层中的成纤维细胞细胞核内及无定形基质内。在GDM孕妇绒毛膜组织中,PPARγ阳性表达,表达主要位于网状层的细胞的细胞膜上及成纤维细胞细胞核内。 结论：在胎盘层面,PPARγ蛋白定位于胎盘的合体滋养细胞核、细胞质,可见PPARγ蛋白不仅定位于细胞核内,有可能通过细胞损伤分泌到细胞质、细胞外的可能,进一步支持了临床实验过程中脐血血浆、羊水中检测到PPARγ蛋白的表达。在羊膜、绒毛膜层面,PPARγ蛋白定位于羊膜上皮细胞核、无定型基质内及绒毛膜网状层细胞的细胞膜上,进一步支持了胎膜的分泌功能,有可能PPARγ蛋白通过胎膜的分泌功能分泌进入羊水。由此可见PPARγ蛋白可能通过内分泌分泌到外周循环,进而发挥作用。 第三部分PPARγ蛋白对细胞糖、脂代谢能力的影响 目的：建立滋养细胞和子宫内膜基质细胞的体外诱导的共培养体系,模拟母胎界面细胞间的相互作用,通过改变PPARγ蛋白在共培养体系中的浓度,分析滋养细胞合体化相关分子、子宫内膜基质细胞容受性相关分子以及两种细胞糖、脂代谢能力的改变,进一步了解PPARγ是否发挥母胎细胞交互作用的调节,其调节作用是否影响细胞的糖、脂代谢功能的改变。 方法：采用人绒癌滋养细胞株(Be Wo细胞)及子宫内膜基质细胞(ESC细胞)建立细胞共培养体系,在共培养的培养液中加入纯化的PPARγ蛋白,改变细胞培养微环境中游离PPARγ蛋白的浓度,分别设立PPARγ蛋白浓度为0.25ng/μL、5ng/μL、10ng/μL。RT-PCR方法检测细胞葡萄糖转运体1(GLUT1)、硬脂酰CoA去饱和酶(SCD)的表达,检测滋养细胞合体化分子syncytin的表达,检测子宫内膜基质细胞容受性相关分子血管内皮生长因子(VEGF)的表达。油红O染色法观察共培养体系中BeWo细胞和ESC细胞对脂质的储存能力改变。 结果：1)BeWo细胞GLUT1mRNA、SCD mRNA的表达：单独培养体系中,在各浓度PPARγ作用下,BeWo细胞表达Glut1mRNA、SCD mRNA相对表达率均无差异性。在共培养体系中,在PPARγ蛋白浓度为10ng/ml、5ng/ml时,BeWo细胞表达Glut1mRNA相对表达率相对空白对照组有显著性增高(P<0.05), SCD mRNA相对表达率随着PPARγ蛋白增加有一定增高趋势,但是无统计学差异。共培养体系相对单独培养体系BeWo细胞Glutl mRNA、SCD mRNA相对表达率数值上有一定升高,仅在PPARγ蛋白浓度为10ng/m, SCD mRNA相对表达率的升高有统计学差异(P<0.05)。 2)ESC细胞中GLUT1mRNA、SCD mRNA的表达：单

关键词： 实验   细胞生物学   细胞工程  

ISBN: (纸本)9787535777942

摘要： 细胞生物学是迅猛发展的生命科学的重要基础学科，有关细胞的基础知识和相关研究是现代生命科学发展的重要支柱之一。在它的内容中处处体现着与现代生物学各分支学科的交叉与整合。细胞生物学是高等学校生物科学类、医学类各专业的基础课程之一，是一门实验性很强的学科。生命科学与医学的许多重大发现与细胞生物学实验技术的不断创新、发展是分不开的。实验是科学理论的实践，通过实验可以巩固和加深对细胞生物学知识和理论的理解，同时可获得感性认识。学生在实验中既可接受一定的细胞生物学基本实验技能的训练，又培养了实事求是的科学态度和独立工作能力，从而可以掌握观察问题和分析解决问题的方法，为生命科学与医学的后续课程学习打下坚实的基础。