关键词：
颅骨锁骨发育不良
牙囊细胞
RUNX2基因
miRNA
摘要：
颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia,CCD）的患者,因为RUNX2基因（RUNT-related transcription factor2,又称成骨细胞特异性转录因子CBFα1）突变,导致牙齿迟萌或始终不能萌出于口腔。microRNA （miRNA）是近年的研究热点,为转录后水平的基因表达调控分子。本课题组前期研究提示RUNX2基因缺陷可能影响相关功能细胞的分化。但这种对细胞增殖分化的影响是否与miRNA有关?转录因子和miRNA之间往往可以通过相互作用来更精细准确地调节基因的表达,那么作为转录因子的RUNX2与miRNA是否有相互调控作用?本研究通过分析RUNX2与miRNA的相互调控,探讨RUNX2基因影响牙囊细胞生物学特性的miRNA相关的可能机制,试图为牙齿萌出障碍的研究提供新思路。本文内容共分为三部分：
一、颅骨锁骨发育不全患者RUNX2基因突变检测
目的：研究颅骨锁骨发育不全1例患者的RUNX2基因突变。
方法：收集颅骨锁骨发育不全病例1例。患者来自广东省口腔医院牙周科门诊,男性,21岁,主诉为部分乳牙脱落后恒牙未萌,咬合不适,咀嚼无力,影响进食。首先对具有相关临床症状的患者详细采集病史,明确单发或家族聚集倾向；利用X线检查全面了解患者及其父母的全身骨骼发育情况；详细进行口腔专科检查,对其进行全身健康状况检查。结果显示该患者具有比较典型的CCD特殊面容,眼距增宽,鼻梁塌陷,额部圆突,颌面部小,面中部发育不足,侧貌为凹面形。口腔内表现为乳牙滞留,多数恒牙及多生牙埋伏于颌骨中,伴有锁骨发育不全,囟门闭合迟缓,第一指骨末端关节间隙变窄等等。临床特征符合颅骨锁骨发育不全（CCD）的诊断。患者的姐姐及双亲无异常,作为对照组进行研究。收集患者静脉血,提取全血基因组DNA,根据本课题组前期研究结果利用7对引物PCR扩增RUNX2基因7个外显子,双向直接测序,BLAST同源序列分析,检测基因突变位点。体外分离培养患者来源的牙囊细胞及正常对照牙囊细胞,进行Trizol法RNA提取,反转录获得cDNA,对cDNA测序验证基因突变。采用实时定量PCR （qRT-PCR）检测RUNX2mRNA表达水平的改变。
结果：全血基因组测序结果发现,患者RUNX2基因第2外显子插入TG突变,导致下游多位点规则套峰,而正常对照组测序中未见这种改变。该突变导致第104位的谷氨酸GAG （W）移码突变为色氨酸TGG （W）,并在第144位提前产生TAG终止密码子,使RUNX2蛋白翻译中止,引起c端部分氨基酸丢失。牙囊细胞cDNA测序结果相同。该突变型为c.309310insTG。实时定量PCR结果显示,基因突变后RUNX2mRNA表达下调,但无统计学差异（P>0.05）。
结论：本研究在CCD患者全血基因组DNA及牙囊细胞cDNA中均检测到RUNX2基因的相同突变位点,而家系中健康成员未发现此突变,进一步验证了RUNX2基因是CCD患者的致病基因。经搜索SNP数据库,未发现此突变位点的报告,证明本研究所检测到的为RUNX2基因新的突变位点,补充了国内外CCD致病基因的突变位点数据库。
二、牙囊细胞中差异表达miRNA的筛选及靶基因预测
目的：筛选RUNX2突变牙囊细胞和正常人牙囊细胞差异表达的miRNA并预测其靶基因。
方法：首先从患者的下颌埋伏多生牙中分离了牙囊组织,实验组为颅骨锁骨发育不良患者（RWX2基因突变）埋伏恒牙的牙囊,恒牙上方没有滞留乳牙,无旋转、倒置等,牙囊完整。对照组为牙位、年龄、性别与实验组匹配的正常人埋伏恒牙牙囊。分离牙囊,磷酸盐缓冲液洗去血污,用眼科剪将组织剪成1-2mm3的小块,以低糖DMEM培养液用组织块贴壁法培养原代牙囊细胞（Human dental follicle cells, HDFCs）,3d后去除未贴壁组织,每3d换一次液,胰酶消化,1：3传代,显微镜下观察细胞形态,细胞免疫组化染色检测结果波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性。收集第3至第5代牙囊细胞备用。取第5代对数生长期的RUNX2突变牙囊细胞（RUNX2+/m HDFCs）和正常牙囊细胞和（RUNX2+/+HDFCs）,吸干PBS后抽提Total RNA,经琼脂糖凝胶电泳条带分析鉴定RNA的质量,采用TaqMan（?） Array Human MicroRNA A+B芯片检测差异表达的miRNA,以Average Delta Ct值计算2-ΔΔCT相对定量分析RUNX2突变牙囊细胞和正常牙囊细胞样品相关miRNA转录本之间的表达差异。通过生物信息学方法使用miRNA靶标基因数据库miRGen预测差异表达的miRNA靶基因,通过DAVID功能注释进行靶基因功能富积分析。
结果：R
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