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关键词： 外源基因   HEK293   PEAK细胞   瞬时转染   抗体蛋白   细胞生物学  

摘要： 转染技术是将外源的遗传物质（质粒、DNA、 mRNA、siRNA、microRNA等）穿过细胞膜导入真核细胞的过程，是研究外源遗传物质在细胞内表达的一种重要手段。转染可分为瞬时转染（瞬转）和稳定转染（稳转），瞬转即将外源基因导入细胞内但不整合到宿主细胞的基因组内，外源基因在细胞分裂时不会被复制，而是会随着细胞的分裂而慢慢丢失，因此瞬转的外源基因只会在宿主细胞的表达几天，随着外源基因的丢失而终止表达。可在短时间内获得可供研究的抗体样品，从而在抗体药物研发的早期阶段非常适用。稳转则是使外源遗传物质整合到细胞的基因组中，随着细胞基因组的复制而复制扩增，通常作为获得抗体药物生产细胞株手段。　　PEI是一种阳离子聚合物，是近年发展迅速的高效非病毒载体之一，具有经济实惠，转染效率高，细胞毒性低，转染方法操作简单，转染的重复性好等优点，培养基可含或不含血清，可以用PBS或不含血清的培养基稀释DNA进行转染，转染过程中不需换液，适用于大多数常用细胞系。　　HEK293细胞，人胚肾上皮细胞，容易生长和转染已被广泛地应用于细胞生物学研究。它们还用于由生物技术工业生产治疗性蛋白质和病毒用于基因治疗。HEK293 PEAK rapid具有细胞生长快，贴壁不牢等特点，可以在无钙离子环境下生长，易于驯化为无血清悬浮培养，可以用来瞬转表达蛋白以备科学研究所用。　　本文将HEK293 PEAK细胞用Free style293 expression medium进行无血清悬浮驯化培养，成功获得无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞，经有限稀释法获得HEK293 PEAK细胞亚克隆，建立抗体瞬转表达的工程细胞株。用转染试剂PEI将质粒转入该细胞株中表达抗体。通过优化抗体质粒与转染试剂PEI的比例，质粒与转染试剂的比例为1∶2时，抗体质粒转染效率最佳，并对瞬转表达抗体进行鉴定和活性分析，获得有生物活性的抗体。结果表明成功建立了无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞瞬转快速表达抗体蛋白的平台。

关键词： 生物材料   氧化石墨烯   蛋白递送   细胞生物学  

摘要： 蛋白质在治疗及器官损伤修复方面有良好的临床应用前景，但是如何提高蛋白质的稳定性以及生物利用度是目前实际应用中的难点。近年来，随着纳米科学的发展，具有良好生物相容性的纳米材料被广泛应用在药物递送和组织工程等生物医学领域。利用载体递送蛋白有望提高蛋白药物的生物利用度，进而提高治疗效果。另一方面，利用掺杂纳米纤维以及基于天然高分子的可降解水凝胶作为支架材料，诱导或促进其上的干细胞分化，在组织修复治疗领域具有良好的应用潜力。本研究内容包括以下四部分：　　⑴设计合成了生物可降解高分子----聚乙烯亚胺衍生物BDDA，并研究了其在蛋白递送方面的应用。在本文第二章中，利用迈克尔加成反应获得BDDA，再通过静电相互作用有效负载不同种类的蛋白质，避免了通过化学偶联方法负载药物而导致的蛋白质活性丧失。然后，利用BDDA-蛋白复合物将蛋白递送到细胞胞质中并实现了对细胞功能的调控。体内和体外毒性实验表明，这种可生物可降解阳离子高分子载体具有较低的生物毒性。以上实验表明BDDA在蛋白药物递送等方面具有潜在应用前景。　　⑵氧化石墨烯是新型二维碳纳米材料石墨烯的重要衍生物，具有超大比表面积、高吸附性能以及良好的生物相容性。基于此，本文第三章研究中选择与高分子载体相比具有更高药物负载效率的氧化石墨烯作为载体用于蛋白递送。本研究发现，氧化石墨烯对蛋白药物表现出更高的负载和递送效率，而且聚乙二醇修饰的氧化石墨烯具有很低的体外毒性，并且可以保护吸附在其上的蛋白质不被酶降解。更重要的是，通过氧化石墨烯递送的功能性蛋白质仍可以保持其生物活性，进而调控细胞新陈代谢。　　⑶在上述氧化石墨烯有效吸附蛋白工作基础上，本文第四章通过静电纺丝技术将氧化石墨烯掺杂到聚乳酸·羟基乙酸共聚物纳米纤维中，获得具有富集培养条件中的蛋白质及小分子作用的组织工程基底。研究发现，掺杂氧化石墨烯的纤维支架可以有效吸附培养环境中的蛋白质和促进间充质干细胞成骨分化诱导剂地塞米松，有利于间充质干细胞的粘附和生长及促进成骨分化，有望在骨修复等领域找到广泛的应用。　　⑷相比于静电纺丝技术制备的纳米纤维膜支架材料，水凝胶同样也是一种良好的组织工程基底并且具有三维空间结构。更重要的是，三维水凝胶作为细胞培养支架具有生物可降解性及良好的生物安全性，其立体孔洞结构可以更好的模拟体内细胞生长环境。在本博士论文第五章中，作者利用甲基纤维素、明胶和琼脂糖等天然高分子在交联剂N' N-羰基二咪唑（carbonyldiimidazole，CDI）和致孔剂存在下，设计并合成了基于天然高分子的三维多孔水凝胶。通过控制CDI用量调节甲基纤维素网格结构的交联程度，从而有效调控三维多孔水凝胶孔洞的大小、密度和材料的机械强度。研究发现，间充质干细胞可以在甲基纤维素三维多孔水凝胶基底上粘附生长。更重要的是，本实验发展的甲基纤维素水凝胶在没有成骨分化诱导剂的培养条件下就可以明显促进间充质干细胞向成骨细胞分化，并且该基底的机械强度显著影响植入的间充质干细胞向成骨细胞分化程度，这对于其在骨组织工程领域的应用具有重要意义。

关键词： 人脐带间充质干细胞   低氧   细胞增殖   细胞凋亡  

摘要： 目的探讨低氧培养对人脐带间充质干细胞的形态、免疫表型、分化潜能以及对细胞增殖和凋亡等的影响,为其今后在干细胞移植和组织细胞工程研究提供理论支持。 方法经父母授权同意后收取足月剖宫产新生儿脐带,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,细胞贴壁法培养人脐带间充质干细胞。分别将细胞置入20%O2、10%O2和3%O2培养条件下培养,鉴定第7代人脐带间充质干细胞特性。将人脐带间充质干细胞行成骨和成脂诱导,通过茜素红和油红O染色检测人脐带间充质干细胞成骨分化和成脂分化潜能；流式细胞仪检测细胞表面标志物(CD105、CD73、 CD90、CD29、CD44、HLA-ABC、CD106、CD45、CD34、HLA-DR),观察细胞免疫表型的变化；细胞计数法绘制细胞生长曲线；流式细胞仪检测细胞周期；Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况。 结果本实验3%O2低氧培养的人脐带间充质干细胞具有成脂、成骨多向分化的潜能；人脐带间充质干细胞CD105、CD73、CD90、CD44、HLA-ABC呈高表达,CD106、CD29、CD45、CD34、HLA-DR低表达,提示低氧培养并不影响人脐带间充质干细胞的免疫表型。3%O2、10%02和20%O2氧浓度培养组,倍增时间分别为17.2小时、18.9小时和20.8小时,提示细胞增殖速度增快,且3%O2低氧培养组与20%O2氧浓度培养组比较有显著差异(P<0.05)；3%O2低氧培养组与20%02氧浓度培养组比较,G0/1期细胞减少,S期细胞增多,增殖指数增高(P<0.05)。3%O2培养组细胞凋亡率为(13.41%士1.39%),显著低于20%O2培养组(20.83%±1.81%),两组间差异显著(P<0.05)。 结论3%O2低氧持续培养可促进人脐带间充质干细胞的增殖,减少细胞凋亡,并可保留其干细胞的特性。

关键词： 细胞生物学   摇篮   中心粒   中心体(细胞学)   纤毛细胞   扩增  

摘要： 中科院上海生物化学与细胞生物学研究所研究员朱学良等人在最新研究中,揭开了多纤毛细胞中心粒扩增之谜,并发现其与脊椎动物适应从海洋到陆地以及进化之间的联系。相关论文日前在线发表于《自然-细胞生物学》,并将作为杂志封面论文发表。纤毛既可作为细胞的运动器官,也可作为感觉器官。纤毛基部有一个叫作"中心粒"的桶状细胞器,其产生通常依赖于"母"中心粒,而且在

关键词： 生物技术专业   细胞生物学   教学质量  

摘要： 近年来,我校新开设了生物技术本科专业,本教研室承担了生物技术专业细胞生物学课程教学任务,笔者通过教学实践,从课程结构、师资培训和教学手段等方面对于提高生物技术专业细胞生物学教学质量作出初步探讨。

关键词： 细胞生物学   教学   优化  

摘要： 细胞生物学是生命科学的重要基础课,笔者为了改进该课程教学效果,提高学习效率,经过多年探索实践,摸索出了整体学习、基础学习、重点学习、前沿学习和常识学习等一系列行之有效的课程教学优化方法,取得了显著成效。

关键词： 人小涎腺   间充质干细胞   上皮祖细胞   成肝诱导   小鼠肝大部分切除模型  

摘要： 目的 1.对小涎腺组织分别进行间充质干细胞方向培养和上皮祖细胞方向培养;在先前研究的基础上进一步深入鉴定小涎腺两种类型干细胞表型;对两种细胞的生物学特性如生长曲线、倍增时间、克隆形成率等进行检测,分析其干细胞增殖潜能;选用2D平面培养和3D matrigel培养两种诱导方案,对两种类型细胞分别进行2D及3D成肝诱导分化实验,探索小涎腺间充质干细胞(Minor Salivary Gland-derived Mesenchymal Stem Cells, MSG-MSCs)及上皮祖细胞(Minor Salivary Gland-derived Epithelial Progenitor Cells, MSG-EpiPCs)体外成肝诱导方法,分析确定其成肝分化潜能。 2.建立小鼠2/3肝大部分切除损伤模型,设立对照组;对小涎腺间充质干细胞和上皮祖细胞进行CM-Dil荧光标记示踪;分别移植小涎腺间充质干细胞及上皮祖细胞到小鼠肝损伤模型,评估移植细胞在肝损伤模型中的分布及转化,探讨这两种类型细胞在体内成肝的可能性。 方法 1.对小涎腺组织进行免疫荧光鉴定,分析从小涎腺组织中获得干细胞的可能性;通过组织块培养法从人小涎腺组织中培养间充质干细胞及上皮祖细胞,进行纯化扩增;利用免疫荧光、流式细胞仪等对获得的细胞进行表型鉴定;检测克隆形成率、生长曲线及倍增时间,对间充质干细胞进行成骨成软骨成脂分化诱导,研究两种细胞的生物学特性。QPCR检测干细胞及成肝相关基因的表达情况,并与骨髓间充质干细胞进行比较,深入探讨细胞的干细胞特征及成肝分化的可能性。 2.分别对两种细胞进行体外2D及3D成肝分化诱导,观察细胞生长及形态的变化,通过免疫荧光、吲哚青绿ICG摄取及QPCR检测不同诱导条件下的成肝分化情况。 3.对小涎腺间充质干细胞和上皮祖细胞进行CM-Dil荧光标记;建立小鼠2/3肝大部分切除模型,随机分为3组：MSG-MSCs组移植小涎腺间充质干细胞(n=15,其中有3只做流式分析用),MSG-EpiPCs组移植小涎腺上皮祖细胞(n=12),及正常对照组(n=3);细胞通过尾静脉注射移植到小鼠体内,移植后1周、2周、3周、4周分别取材;荧光显微镜及流式细胞仪分析移植2周后细胞在小鼠体内的分布,观察移植细胞的归巢情况;并将细胞移植后肝组织消化进行再培养,评估细胞移植后的活力;对取材组织进行免疫荧光鉴定,观察成肝相关标记蛋白的表达。 结果 1.小涎腺组织表达白蛋白(Albumin, ALB)、甲胎蛋白(a-Fetoprotein, AFP)、细胞角蛋白(Cytokeratin) CK15、CK18及CK19、富含亮氨酸重复序列G-蛋白偶联受体(Leucine-rich repeat-containing G Protein-coupled Receptor, LGR) LGR5及LGR6;分离获得的间充质干细胞及上皮祖细胞生长良好,体外传代均可达25次。免疫荧光及流式分析表明,小涎腺间充质干细胞表达谱与公认的骨髓间充质干细胞表型相似,上皮祖细胞表达细胞角蛋白、ATP结合盒转运蛋白G2(ATP-binding cassette superfamily G member2, ABCG2)、胎盘表达转录本-1(Placenta-expressed Transcript-1, PLET-1)等上皮祖细胞标记,两种细胞均表达LGR5和LGR6,其中部分间充质干细胞特异性表达阶段特异性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen-1, SSEA-1)(27.63%±1.88%),上皮祖细胞特异性表达转录因子性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box2,SOX2)(19.2%±8.94%)。P5代间充质干细胞和上皮祖细胞的倍增时间分别为19.77小时和24.93小时,克隆形成率分别为41%±5.4%和10.7%±3.0%。间充质干细胞可成功向成骨、成软骨、成脂方向分化。QPCR检测显示与骨髓间充质干细胞相比,小涎腺间充质干细胞高表达LGR5,上皮祖细胞高表达LGR6。 2.两种细胞在2D及3D诱导情况下均可向肝细胞样细胞分化,其中间充质干细胞在2D诱导情况下效果较好,而上皮祖细胞在3D诱导优于2D诱导。ICG摄取阳性。免疫荧光和QPCR结果显示二者在诱导后均能表达肝细胞相关蛋白。 3.小涎腺间充质干细胞移植2周后,在小鼠肝、脾、胸腺、心、肺、胰腺、肾、皮肤中均可观察到CM-Dil红色荧光信号,其中肝脏组织中最多,肺和脾脏次之。间充质干细胞移植2周后肝组织再培养后多数贴壁细胞为CM-Dil阳性细胞,免疫荧光显示表达LGR5。对不同时间取材的肝组织切片免疫荧光染色显示小涎腺间充质干细胞及上皮祖细胞均可在体内

关键词： 类风湿性关节炎   免疫紊乱   乳铁蛋白   细胞生物学  

摘要： 乳铁蛋白(LTF)是一种分子量约为80kDa的糖蛋白,属于转铁蛋白家族成员之一,具有多种生物学功能,如调节铁的吸收,抗病原微生物,抗肿瘤与免疫调节作用。在正常情况下,体内LTF含量较低,但是在患有类风湿性关节炎(RA)的关节液中,LTF水平会明显升高。抗LTF抗体是抗中性粒细胞胞浆抗体的一种,在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)和RA等病人血清中抗LTF抗体含量较高。然而,乳铁蛋白免疫复合物(LTF-IC)在RA病人体内的表达是否升高及其在RA的发生发展过程中发挥怎样的作用尚不清楚。　　本研究在RA病人血清中LTF-IC含量增加的基础上系统地研究了LTF-IC对人单核细胞的免疫学功能,并对其机制进行了深入探讨。结果发现LTF-IC能够在体外活化人单核细胞分泌促炎性细胞因子,包括TNF-α、IL-1β和IL-8,但不能产生IL-10和IL-12。不同组成的LTF-IC,无论是由多克隆抗体还是单克隆抗体所组成的LTF-IC均具有这种功能。肝素能够阻断LTF与人单核细胞的结合,在LTF-IC刺激人单核细胞的培养体系中加入肝素能够明显抑制LTF-IC对人单核细胞的刺激作用。并且加入抗LTF受体的抗体去阻断LTF-IC的刺激作用,发现抗CD14的抗体具有很强的阻断作用。可见,LTF在LTF-IC的刺激作用中发挥着重要作用。然而,由生物素标记的LTF与亲和素结合形成的LTF多聚物却对人单核细胞没有明显的功能,证明LTF-IC发挥作用不是仅仅通过抗体交联乳铁蛋白来实现的。在培养体系中加入抗 Fcγ受体的抗体,发现抗FcγRII(CD32)的抗体也能明显抑制这种刺激作用。同时对乳铁蛋白抗体进行酶切,去除其Fc段后与LTF形成的复合物不再具有活化作用,因此, Fcγ受体在LTF-IC的刺激作用中也发挥重要作用,并且没有Fcγ受体的帮助是不足以诱导单核细胞活化的。据此我们推测,LTF-IC对人单核细胞的刺激作用可能是LTF受体和Fcγ受体共同介导的,二者缺一不可。　　本文通过激光共聚焦的方法研究LTF-IC活化人单核细胞是否是通过内吞实现的。结果发现,与普通免疫复合物OVA-IC相比,LTF-IC更容易被内吞到细胞中,并且内吞抑制剂MDC能阻断这种现象。同时,Western-blot及信号通路抑制剂(NF-κB通路抑制剂及Casepase-1抑制剂)结果显示LTF-IC被单核细胞内吞后通过活化NF-κB等途径产生TNF-α,IL-1β等炎性细胞因子。检测了LTF-IC处理人单核细胞后对外来刺激剂的反应性。结果显示,LTF-IC处理后的单核细胞对其他刺激剂如LPS和Zymosan等的反应性明显上调,较普通复合物OVA-IC产生更多的细胞因子。进一步研究发现,这种细胞敏感性的增强可能与协同作用有关。而LTF-IC使细胞敏感性上调的特点,可能进一步增强RA病人体内的炎症反应,从而进一步加重病情。发现了LTF-IC对人单核细胞的免疫学功能并初步阐明了其发挥作用的分子机制。LTF-IC能够很强地活化人单核细胞并能增加细胞对其他刺激剂的敏感性,而这种刺激作用是通过细胞表面的LTF受体及Fcγ受体共同介导的内吞作用实现的。这些发现增加了我们对类风湿性关节炎等自身免疫病发生发展的理解,为人类研究自身免疫病的发病机制提供了新的思路。

关键词： 细胞生物学   靶学说   电离辐射   电磁辐射   出版  

摘要： 近些年来,随着细胞生物学的发展,辐射细胞生物学也成为放射生物学学科的重要组成部分,乃至核心部分。有鉴于此,龚守良经过两年多的努力,参阅了大量的国内外文献,结合自己和所在研究团队的资料,在国内首次编著了《辐射细胞生物学》一书,于2014年1月由中国原子能出版社出版,ISBN 978-7-5022-6133-7,定价128元。本书共20章,91.4万字,主要阐述细胞放射敏感性、电离辐射靶学说和非靶学说、电离辐射对细胞和亚细胞结构及生物大分子的作用、对基因转录与翻译和信号转导通路的作

关键词： 酵母拮抗菌   水通道蛋白   活性氧代谢   细胞生物学  

摘要： 果实表面存在着大量微生物群，其中包括病原菌群以及生物拮抗菌群，这些微生物群与果实的采后品质密切相关。而活性氧在调节病原真菌致病力与酵母拮抗菌生活力中起着重要的作用。本研究以采后主要病原真菌Botrytis cinerea和几种常见的酵母拮抗菌为材料，运用生物化学、分子生物学、蛋白质组学以及细胞生物学等方法，系统的研究了***中小G蛋白Rho3和水通道蛋白在调控其细胞内活性氧的代谢及致病力的功能，以及酵母拮抗菌对高温和氧化逆境的生理应答及生活力变化。本研究主要内容包括：　　⑴小G蛋白Rho3调控Bcinerea的活性氧代谢与致病力:利用同源重组方法构建了rho3基因的缺失突变株，结果表明突变株生长速率和产孢量都明显低于野生型菌株。显微观察发现突变株菌丝内细胞隔的数量减少、菌丝尖端膨大，菌丝极性生长受到抑制，说明Rho3参与调控菌丝的极性生长。在苹果和番茄果实，以及番茄叶片上接种突变株，其致病力明显降低。离体实验表明突变株的附着胞形成受到了抑制，说明Rho3参与调控附着胞的形成。通过荧光染色检测证明菌丝尖端细胞内的线粒体为胞内活性氧的主要来源，而突变株的活性氧代谢明显减弱，由此推测Rho3蛋白是通过调节线粒体在菌丝尖端的极性分布来调控菌丝的极性生长。　　⑵水通道蛋白调控Bcinerea的活性氧代谢及致病力:采用同源重组原理构建了八个水通道蛋白(Aquaporin)基因的缺失突变株，结果发现Aquaporin8缺失突变株的生长速率明显低于野生型菌株，菌落形态发生较大变化，并且完全失去产孢能力。此外，Aquaporin8缺失突变株对番茄叶片的致病力也丧失，突变株菌丝尖端不能形成附着胞;而且荧光染色检测证明突变株菌丝尖端线粒体与活性氧的极性分布受到破坏。通过双向SDS-PAGE法检测到Aquaporin8缺失突变株中，93个蛋白的丰度发生了变化。利用酿酒酵母细胞的异源表达，证明了Aquaporin8能够介导H2O2的跨膜运输。这些结果说明Aquaporin8是病原菌胞外生成的H2O2进入细胞的主要通道，它能够调控Bcinerea细胞内活性氧及相关下游蛋白的表达，从而影响***的生长和致病力。　　⑶外源CaCl2提高酵母拮抗菌在高温逆境下的存活率:在培养基中添加外源CaCl2能够增强酵母拮抗菌Debaryomyces hansenii和Pichia membranaefaciens在高温逆境下的存活率。荧光染色检测到在高温逆境下，***酵母细胞内有大量的活性氧积累。外源CaCl2处理能够提高***细胞内的抗氧化酶活性，清除掉过量的活性氧，避免细胞内蛋白质发生羰基化损伤，从而提高其耐受高温逆境的能力。Pmembranaefaciens与***对高温逆境的敏感性不同。　　⑷钙-钙调素信号途径参与调控脂筏蛋白表达及酵母菌胞内活性氧代谢:钙调素的抑制剂三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)处理能够提高H2O2逆境下Candidaguilliermondii的生活力。双向SDS-PAGE结果显示TFP处理***细胞后，位于其质膜脂筏组分中的线粒体电子传递链蛋白、线粒体外膜通道蛋白的丰度发生明显下调。荧光染色观测到TFP处理能够显著降低H2O2逆境下***细胞内活性氧的积累，避免细胞内蛋白质发生羰基化和凝集损伤，从而提高***细胞在H2O2逆境下的生活力。以上研究结果对揭示活性氧对病原菌真菌致病力，以及外源物质拮抗菌生活力的调控机制提供了新证据。