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关键词： 羊膜间充质干细胞   羊膜上皮细胞   归巢   CD126   CXCR4   迁移  

摘要： 目的：成体干细胞是具有多向分化潜能的细胞,在组织工程、细胞移植及基因工程方面具有良好的应用前景。近年来的研究发现,人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC)在体外具有与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)相似的造血重建功能,并因其取材方便、来源丰富等优势有望成为一种更加理想的MSC临床及科研新来源。同样来源于羊膜的羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells, AEC)不仅具备干细胞的生物学特性,还能分泌多种细胞因子。本课题旨在探索AMSC与AEC在体外共培养后,AMSC生物学特性的变化。SDF-1/CXC4轴是介导MSC在体内归巢及植入的重要的生物轴,本研究对比共培养前后AMSC中CXCR4的表达,探讨SDF-1/CXCR4轴在AMSC归巢、迁移过程中的作用,以期为AMSC临床应用奠定基础,并希望为临床提高MSC移植疗效提供实验依据。 方法：分别采用组织块法和消化法从羊膜中分离、培养AMSC和AEC,用密度梯度离心法从健康人骨髓标本中分离、培养BMSC,进行扩增及鉴定。选取P3代传代培养24h后AMSC和BMSC的培养基上清液,检测其中IL-6的含量,同时对比两种细胞上IL-6受体(CD126)的表达。用millicell小室建立间接共培养体系,实验分组为AMSC与AEC共培养组、无血清AMSC培养组、血清AMSC培养组(即常规培养组),应用CCK-8法及台盼蓝染色法观察共培养24h、48h、72h对AMSC细胞活力的影响；采取包括流式免疫分析、real-time RT-PCR等方法对AMSC中CXCR4的表达进行检测,并结合millicell小室探索共培养对AMSC体外迁移能力的影响。 结果：1、从羊膜分离出的AMSC在形态和表型上均符合MSC特征,流式分析显示其上表达CD29、CD44、CD105,不表达或低表达CDlla、CD11b、CD31、CD34、 CD45、HLA-DR、pan-CK。2、AMSC与BMSC有相似生物学特性,二者流式免疫表型基本一致。3、AMSC能合成和分泌比BMSC更为丰富的IL-6,同时CD126的表达亦高于BMSC。4、通过CCK-8法显示：虽然在24h三组细胞增殖活性无明显差异,但是在48h、72h后共培养组细胞与血清培养组细胞的活性明显的高于无血清AMSC组。5、台盼蓝染色进一步证实,无论在哪个时间位点,共培养组及血清培养组的存活率均高于无血清培养组。6、流式细胞仪检测提示：AMSC胞内的CXCR4在24h内呈现出共培养组高于无血清培养组的表达,但与血清培养组无明显差异,在接下来的48h及72h,三组细胞CXCR4的胞内表达无明显差别；对于细胞表面CXCR4,三个培养时间位点却均显示出血清培养组在CXCR4表面表达的劣势,而共培养与无血清培养组之间的表达无差别。7、通过real-time RT-PCR在mRNA水平上检测三种培养方式对细胞中CXCR4的表达,结果表明共培养及无血清培养组在三个时间位点均高于血清培养组,而共培养与无血清培养组之间差异无统计学差异。8、AMSC体外能够沿SDF-1浓度梯度趋化迁移,共培养组与无血清培养组迁移细胞数无统计学差别,但两组的AMSC的迁移数在三个时间位点均高于血清培养组。 结论：AMSC与AEC能够在体外分离、培养、扩增。AMSC在体外与BMSC有相似的生物学特性,二者均能合成和分泌IL-6,但AMSC表达更为丰富的IL-6受体(CD126),提示在组织的损伤修复及造血调控方面,AMSC可能具有比BMSC更广阔的应用前景。经AEC共培养的AMSC表现出良好的生长活性,并能上调CXCR4的表达,增强其迁移能力。

关键词： TM4SF1   上皮性卵巢癌细胞   免疫组化   TM4SF1   RNAi   上皮性卵巢癌细胞   侵袭   迁移   TM4SF1   上皮性卵巢癌细胞   慢病毒表达载体   侵袭   迁移  

摘要： 第一部分TM4SF1蛋白在人上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义 目的探讨TM4SF1蛋白在人卵巢组织及卵巢癌相应淋巴结转移灶中的表达及其与上皮性卵巢癌（EOC）临床病理因素的关系。 方法采用免疫组织化学SP法检测16例正常卵巢上皮组织、23例上皮性卵巢良性肿瘤组织、55例上皮性卵巢癌原发灶及30例配对淋巴结转移灶组织中TM4SF1蛋白的表达情况，分析其与上皮性卵巢癌临床病理因素及预后的关系。 结果（1）TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率（90.90%）高于上皮性卵巢良性肿瘤组织（65.22%）及正常卵巢上皮组织（31.25%）、上皮性卵巢良性肿瘤组织中TM4SF1蛋白的阳性表达率高于正常卵巢上皮组织，差异均有统计学意义（P<0.05）；TM4SF1在配对淋巴结转移灶中全部呈现阳性表达（100%）。（2）TM4SF1蛋白在正常卵巢上皮细胞中的表达主要位于上皮细胞胞膜近基底膜处及细胞膜的其它部位和细胞质中，在卵巢良性肿瘤组织中的表达主要集中在肿瘤细胞胞膜近基底膜处及细胞膜其它部位，而在卵巢癌原发灶及淋巴结转移灶细胞中则主要分布于癌细胞胞质中。（3）Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者中TM4SF1蛋白的阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，中-低分化癌患者TM4SF1蛋白的阳性表达率高于高分化癌患者（P<0.05）。（4）TM4SF1蛋白阳性表达率与组织学类型、腹水量多少无明显相关（P>0.05）。（5）Cox模型多因素分析显示TM4SF1蛋白在卵巢癌组织中的阳性表达不是影响患者生存的独立预后因素。 结论TM4SF1蛋白在上皮性卵巢癌原发灶及淋巴结转移灶肿瘤细胞中高表达，可能与卵巢癌的发生、发展及远处转移相关。 第二部分RNA干扰TM4SF1基因对上皮性卵巢癌细胞系生物学功能影响的体外研究 目的运用RNAi技术下调TM4SF1基因在上皮性卵巢癌细胞系HO8910PM的表达，研究干扰TM4SF1基因后对卵巢癌细胞生物学功能的影响。 方法应用RT-PCR技术检测不同上皮性卵巢癌细胞系中TM4SF1基因的表达情况，筛选出高表达该基因的细胞系HO8910PM；针对TM4SF1mRNA序列设计3对siRNA片段，脂质体法转染TM4SF1高表达株HO8910PM，荧光定量PCR检测干扰效率，选出干扰效果最好的片段构建shRNA；脂质体法转染HO8910PM后用G418筛选稳定干扰株，荧光定量PCR及Western blot检测干扰效果，通过生长曲线及克隆形成实验、流式细胞仪检测细胞周期、Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞的生长、增殖、迁移和侵袭能力的变化。 结果TM4SF1基因在SKOV3，HO8910尤其是HO8910PM细胞中高表达，在A2780细胞中不表达；荧光定量PCR显示，siRNA-TM4SF1-813片段沉默TM4SF1基因效果最好，抑制率约为61.5%；将构建好的pGPU6/GFP/Neo-TM4SF1-813转染HO8910PM细胞并筛选出稳定干扰细胞株后，荧光定量PCR检测TM4SF1沉默效率约为85%，Western-blot检测TM4SF1沉默效率为50%；细胞功能试验显示：干扰组即pGPU6/GFP/Neo-TM4SF1-813组细胞穿膜细胞数为37.67±3.79，较阴性对照组即pGPU6/GFP/Neo-control（107.31±5.13）明显下降（P<0.05）；干扰组细胞穿过Metrigel胶并透过膜的细胞数为（32.33±3.05），较阴性对照组（88.01±2.646）明显减少（P<0.05）；两组细胞生长、增殖、细胞周期进展差异均无统计学意义（P>0.05）。 结论下调TM4SF1的表达能够抑制上皮性卵巢癌细胞HO8910PM的迁移和侵袭能力，对其生长、增殖无影响。 第三部分上调TM4SF1基因对上皮性卵巢癌细胞系生物学功能影响的体外研究 目的构建携带TM4SF1基因的重组慢病毒表达载体，研究上调TM4SF1基因后对上皮性卵巢癌细胞系生物学功能的影响。 方法针对TM4FS1基因设计引物，扩增出TM4SF1基因全长；将TM4SF1基因及慢病毒表达载体pWPI连接构建重组慢病毒表达载体；pWPI、pCMV-dR8.74、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装；病毒上清液感染宿主细胞A2780；流式细胞仪分选后扩大培养；荧光定量PCR及Western blot检测上调表达效果；通过生长曲线及克隆形成实验、流式细胞仪检测细胞周期、迁移和侵袭实验分别检测细胞的生长、增殖、迁移和侵袭能力的变化。 结果成功构建重组慢病毒表达质粒TM4SF1-pWPI；荧光定量PCR显示实验组TM4SF1-pWPI-A2780细胞TM4SF1mRNA表达

关键词： 细胞生物学   中药   癌症   传染病预防   恶性肿瘤   人体   免疫功能低下   传染源   特异性免疫   病原微生物   预防手段   预防接种   预防方法   易感人群   遗传物质   环境   核糖核酸   发生机制   传播途径   传播机制  

摘要： 癌症和恶性肿瘤一样，都是一种基因病，是细胞的遗传物质核糖核酸（DNA）发生了变化的疾病。在我国的恶性肿瘤中癌症占多数，约75%~90%。人们渴望战胜它，希望能有一种好的预防方法能像对传染病预防那样有效和立竿见影！但遗憾的是，癌症不像传染病是由病原微生物侵入人体而直接引起的，传染病发病快、病因直观，传染源（向环境排出病原体的人或动物）、传播途径、易感人群和特定的季节性等传染传播机制清楚。特别是对付传染病还有一个特效的特异性免疫预防手段即预防接种。而癌症是不传染的，没有传染源。它的发生机制是，在人们所在的环境（包括饮食等）的化学、物理或生物的致癌物所形的作用与影响下，人体正常细胞慢慢异化、癌变，在人体失衡特别是机体免疫功能低下时，这一变化就演变为癌症。

关键词： 母-胎界面   IL-33   滋养细胞   妊娠   黏附   侵袭  

摘要： 妊娠是胚胎(胎儿)在母体内生长发育的全过程,即从胚胎形成到胎儿及其附属物从母体排出的全过程。这是一个由多种因素参与精密调控的复杂生理过程。而这其中所蕴含的大自然赋予的科学真理值得深入研究。同时,母-胎界面的生物学研究对器官移植和肿瘤研究领域都有着重要的推动作用。母-胎界面主要由滋养细胞、蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞以及免疫细胞等多种细胞及细胞外环境中的多种细胞因子共同构成。正常妊娠时母-胎界面以Th2型免疫占优势,形成免疫耐受的微环境,以利于同种异体的胚胎在子宫内生长发育。胎盘的形成是母-胎界面的重要生物学事件,其成功与否直接影响妊娠的结局。滋养细胞增殖与侵袭对于囊胚植入、胎盘形成,并建立适当的母胎关系至关重要。母-胎界面的滋养细胞是胚胎种植、胎盘形成过程中一种特殊的上皮细胞,具有独特的高增殖高侵袭的能力。滋养细胞首先黏附于蜕膜化的子宫内膜,而后侵入蜕膜基质,与母体子宫螺旋小动脉接触,继而侵入血管腔,沿着血管内皮细胞逆行,向蜕膜深部及子宫肌层的浅1/3-1/2浸润,分化并替代血管内皮细胞,形成胎盘的胎儿部分,最终建立母胎循环,促成血管低阻高流量的形态学变化,使大量血液供向胎儿,以确保胎儿生长发育的需要。以往研究发现滋养细胞增殖与侵袭障碍是子痫前期、胎儿宫内生长受限、自然流产等妊娠相关疾病的主要原因。相反,滋养细胞的增生和侵袭如果失去了限制,则表现出肿瘤细胞的特性,导致妊娠滋养细胞疾病的发生。滋养细胞侵入子宫蜕膜受母-胎界面微环境细胞与分子间相互作用的调控。正常情况下,滋养细胞极少发生无限增殖和远处转移,提示滋养细胞的黏附和侵袭可能直接或间接受到某些细胞和细胞间分子的调控,使黏附侵袭的促进和抑制维持在生理性动态平衡。因此,母-胎界面参与调控滋养细胞侵袭力的相关分子,直接影响胚泡的正常植入和生长。白细胞介素(interleukin, IL)是一类参与多种重要生物学功能调节的生物活性分子,参与细胞间信息的传递,激活免疫细胞,介导T、B淋巴细胞的活化、增殖与分化,非特异性的调节机体的免疫反应并在炎症反应中发挥重要作用。白细胞介素-33(IL-33)是IL-1家族的新成员,是炎症反应和免疫偏倚的重要调节因子之一,主要诱导Th2型免疫反应。IL-33与免疫性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、生殖系统疾病等多种疾病的发生发展有关。IL-33可降低细胞与细胞之间钙粘蛋白的表达,促进肿瘤细胞的脱落、转移。本课题组前期研究已证实IL-33及其受体ST2在早孕绒毛组织及蜕膜组织中均有表达。并且研究证实IL-33可以通过NF-κB和ERK1/2信号通路上调CCL2/CCR2促进蜕膜基质细胞的增殖和侵袭功能。其他研究还发现胎盘的IL-33主要来自母-胎界面的巨噬细胞,通过旁分泌途径激活滋养细胞AKT和ERK1/2信号通路,促进滋养细胞的增殖,对胎盘的形成具有重要作用。而IL-33对滋养细胞的重要生物学功能——黏附和侵袭是否有影响,目前尚未见报道。进一步解析IL-33在母-胎界面的作用机制,将有助于阐明生理状态下胚泡植入和病理性滋养细胞疾病发生的机理,对治疗复发性流产、子痫前期、胎儿宫内生长受限及滋养细胞相关疾病等亦具有潜在的临床价值。本课题在以往研究的基础上,进一步关注IL-33对滋养细胞黏附和侵袭功能的影响,并解析IL-33在母-胎界面对滋养细胞生物学功能调控的可能机制。第一部分IL-33及其受体ST2在母-胎界面的表达目的：分析孕晚期IL-33及其受体ST2在母-胎界面的表达情况,了解IL-33及受体ST2在母-胎界面的表达特征。方法：选取2013年在复旦大学附属妇产科医院正规产检并足月妊娠行选择性剖宫产的正常孕妇8例。于剖宫产手术时收集新鲜胎盘组织。石蜡包埋切片。采用免疫组织化学技术,检测母-胎界面IL-33及其受体ST2的表达情况。结果：正常足月妊娠母-胎界面共表达细胞因子IL-33及其受体ST2。免疫组织化学结果显示正常足月妊娠分娩的胎盘组织中可见IL-33及ST2表达,IL-33主要表达于滋养细胞的细胞核中,ST2则主要表达于滋养细胞和基质细胞,以胞膜胞浆表达为主。结论：IL-33及其受体ST2共表达于母-胎界面。提示：IL-33/ST2轴在正常妊娠的胎盘形成及功能维持中可能发挥作用。第二部分IL-33对滋养细胞黏附和侵袭功能的影响目的：明确滋养细胞系细胞表面IL-33受体ST2表达情况；探讨IL-33对滋养细胞黏附功能和侵袭功能的调控作用。方法：采用流式细胞术检测滋养细胞系JEG-3、JAR、BeWo、HTR-8细胞表面ST2的表达情况。利用多基质黏附试剂盒检测不同浓度IL-33作用48小时后,滋养细胞对基质Fibronectin、Laminin Ⅰ、Fibrinogen、Collagen Ⅰ和CollagenⅣ的黏附能力的改变。通过建立Tr

关键词： 骨髓间充质干细胞   脂肪间充质干细胞   髓核细胞   接触式共培养   比较研究  

摘要： 研究目的：椎间盘退行性疾病（disc degeneration disease，DDD）是严重困扰人类的医学难题之一，且发病率逐年升高。传统的手术方法虽取得良好疗效，但未能从根本上解决椎间盘退变的本质。随着生物治疗的进步，干细胞技术和组织工程技术的不断发展，为人们对椎间盘退行性疾病的治疗，带来了新的前景。在这些研究中，种子细胞的选择，是决定治疗效果的重要方面之一。目前，研究较为深入的是骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。它们是分别来源于骨髓和脂肪组织的间充质干细胞，它们都具有干细胞的基本特征，即自我更新以及向不同细胞或组织分化的能力。本研究从同一患者提取骨髓组织、脂肪组织和退变髓核组织，分离培养骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和退变髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs），并在接触式共培养体系下将两种干细胞分别与退变髓核细胞进行共培养，此后利用MoFlo高速流式细胞分选仪分离提取共培养的髓核细胞，检测髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖以及SOX-9基因的相对表达量，以此来探讨骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞对退变髓核细胞的生物学影响，并比较两者对退变髓核细胞生物学影响的差异，为椎间盘退行性疾病的生物学治疗提供更好的种子细胞。 研究方法：取同一腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织、脂肪组织和骨髓组织，然后分别分离培养退变髓核细胞（NPCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）。取3种细胞传代至第3代的细胞进行接触式共培养。共培养前，利用PKH26对第3代退变NPCs进行染色标记，然后按1：1的细胞比例，将髓核细胞分别与脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞在普通6孔板内进行接触式共培养。实验分为3组，A组为单独培养的髓核细胞，为对照组；B组为与脂肪间充质干细胞共培养的髓核细胞；C组为与骨髓间充质干细胞共培养的髓核细胞。共培养后第7天，利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养的细胞进行分选，获取各组髓核细胞。然后提取各组髓核细胞的总RNA，进行反转录后，再利用Real-Time PCR技术检测各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。将Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量按分组进行组间t检验，P＜0.05有统计学差异。 结果：获取同一患者的退变髓核组织、骨髓组织和脂肪组织后，均成功分离培养髓核细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。待各细胞传至第3代时，成功利用PKH26对髓核细胞进行染色标记。按实验分组将各细胞进行接触式共培养后第7天，成功利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养细胞进行分选，获取各组髓核细胞。经提取各组髓核细胞的总RNA，反转录并进行Real-time PCR后，获取各组髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量。Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因在A组的相对表达量分别是1.03±0.04，1.05±0.07，1.04±0.17；B组分别是5.26±0.24，7.71±0.21，3.84±0.25；C组分别是9.33±0.39，11.07±0.34，5.64±0.26。对各指标进行组间t检验后，结果表明：B、C组髓核细胞的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量与A组相比，显著增加（P<0.05）；C组与B组相比，各指标基因相对表达量显著增加（P<0.05）。 结论：在接触式共培养条件下，骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞对退变髓核细胞均具有营养激活效应；骨髓间充质干细胞对退变髓核细胞的激活效应比脂肪间充质干细胞更好，对于椎间盘退行性疾病的生物学治疗可能更具优势。

关键词： 医学   教学参考资料   医学院校   细胞生物学  

ISBN: (纸本)9787030400895

摘要： 医学笔记系列丛书是魏保生医学复习考试独创方法——“两点三步法”的集中体现。本着“青春不能没有梦想，生活不能没有乐趣；学习不能没有方法，考试不能没有智慧”的宗旨，从枯燥中寻找趣味，在琐碎中提炼精华，到考试中练就高分；从零散中挖掘规律，由成长中迈向成功，于寂寞中造就出众，为您在成为名医的道路上助一臂之力！本套丛书自从2005年面世得打了广大师生的喜爱，成为优秀医学教辅畅销书。为了紧跟教材脉搏，更好为大家服务，作者对本套丛书进行了第三次全面修……

关键词： 脂肪干细胞   细胞增殖   金属蛋白酶   细胞生物学  

摘要： 目的：研究TIMP-1（tiussue inhibitor of matrix metalloproteinases，基质金属蛋白酶抑制剂-1）对人脂肪干细胞(human adipse-derived stem cell，hADSCs)存活增殖的影响，为初步探索hADSCs增殖机制及其在创伤修复中的作用提供理论依据。\n 方法：⑴Western Blot检测脂肪组织（对照）、成纤维细胞（对照）及hADSCs中TIMP-1蛋白表达情况。⑵按照慢病毒载体构建方法，构建干扰TIMP-1慢病毒载体及阴性对照载体，将TIMP-1慢病毒干扰载体及阴性对照载体转染hADSCs。进行实验分组:空白对照组(CON)、阴性对照组(Lv-TIMP-1-NC)、干扰实验组(Lv-TIMP-1-shRNA)。⑶显微镜下观察hADSCs中绿色荧光表达情况，qRT-PCR测定hADSCs中TIMP-1 mRNA干扰效果，Western Blot测定TIMP-1蛋白干扰效果。⑷通过MTT检测细胞活性，流式细胞术检测细胞周期，Western Blot检测P53蛋白表达，免疫细胞化学检测Ki67表达情况，研究TIMP-1对hADSCs增殖的影响。\n 结果：①Western Blot检测提示TIMP-1在hADSCs呈高表达。②成功构建3对针对TIMP-1表达的慢病毒干扰载体(TIMP-1-shRNA)及1对不干扰任何因子的阴性对照组载体（TIMP-1-NC）。③MTT结果显示:同对照组相比，干扰实验组细胞增殖能力明显降低（P＜0.05）。④流式细胞术分析结果显示:同对照组相比，干扰实验组处于G1期细胞比例明显增高，而进入S期及G2期细胞比例明显减少（P＜0.05）。⑤Western Blot检测结果显示:同对照组相比，干扰实验组中的P53的蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)。⑥免疫细胞化学结果显示:同对照组相比，干扰实验组中Ki67表达量明显降低(P＜0.05)。\n 结论：⑴TIMP-1慢病毒干扰载体可以稳定干扰hADSCs中TIMP-1表达，为下一步研究TIMP-1对hADSCs增殖的影响提供前期准备。⑵干扰TIMP-1基因后hADSCs增殖能力降低，提示TIMP-1可能参与调控hADSCs增殖。

ISBN: (数字)9787535773845

摘要： 本书内容包括：普通光学显微镜的构造及使用、细胞的基本形态与结构、鸡红细胞的融合、人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本的制备、人类染色体常规核型分析、细胞的有丝分裂、动物生殖细胞的减数分裂、细胞的显微测量、细胞传代培养、性染色质的制备及观察等。

关键词： 神经母细胞瘤   Survivin   ASODN   生长增殖   凋亡   迁移和侵袭   神经母细胞瘤   Survivin   YM155   迁移和侵袭   神经母细胞瘤   YM155   顺铂   Survivin   增敏   神经母细胞瘤   Survivin   YM155   顺铂   裸鼠移植瘤  

摘要： 研究背景： 神经母细胞瘤(Neuroblastoma, NB)是发生在儿童和婴儿中最常见的恶性颅外实体肿瘤之一,其起病部位隐匿,临床治疗困难,尤其对于进展期NB患儿,生存率仍然维持在20%-30%,复发率居高不下。因此,对神经母细胞瘤的生物学、遗传学特性及具体发病机制进行深入研究,对寻找新的肿瘤基因治疗方法、提高NB患儿的治愈率和改善患儿的远期预后具有重要的临床价值。 Survivin蛋白属于凋亡抑制蛋白家族,在多种恶性肿瘤中均被发现高表达,提示其可能在肿瘤发病机制中起重要作用。Survivin可能参与NB的发生、发展、演变的过程,它不仅可能是判断NB预后的重要参考指标,也可能成为NB基因治疗中的一个理想靶点。YM155是水溶survivi特异抑制剂,体内外均可特异性地抑制survivin的表达,具有强大的抗肿瘤功效,同时可增加常见肿瘤对化疗、放疗的敏感性。Survivin在NB肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和转移等过程中究竟扮演着什么调控角色?而YM155作用于NB肿瘤细胞的效果如何呢?在体内、体外研究应用中YM155是否能发挥对NB肿瘤细胞的顺铂化疗增敏作用呢?本课题通过体内外实验相互结合,进一步研究Survivin和其抑制剂YM155与NB的关系,以期为NB靶向治疗寻找新的靶点。 第一部分Survivin ASONDN对神经母细胞瘤细胞迁移和侵袭的影响目的 将Survivin的反义寡核苷酸以不同浓度转染入人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH,观察Survivin对SK-N-SH增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 方法 设计并合成Survivin的反义寡核苷酸(ASODN),以脂质体为载体,以不同浓度转染入体外培养的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH;采用RT-PCR和Westernblot分析经过不同浓度Survivin ASODN干扰后SK-N-SH细胞中Survivin mRNA和蛋白表达水平；应用MTT法检测不同浓度Survivin ASODN对细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测转染后的细胞凋亡率；用Transwell实验分析Survivin ASODN对SK-N-SH细胞体外迁移力和侵袭力的影响。 结果 不同浓度Survivin ASODN作用于SK-N-SH细胞48h后,Survivin mRNA表达均明显下调,与空白对照组、脂质体转染对照组及正义寡核苷酸SODN组比较,有显著的差异(P<0.05),且抑制作用呈现剂量依赖性,以浓度为800nmol/L时的作用最明显。SK-N-SH细胞经200、400、800lmol/L Survivin ASODN转染48h后,Survivin蛋白表达较空白对照组、脂质体转染对照组及正义寡核苷酸SODN组明显下降(P<0.05),且抑制作用呈现剂量依赖性,以浓度为800nmol/L时的作用最明显。 不同浓度Survivin ASODN转染入SK-N-SH细胞后,可不同程度地抑制该肿瘤细胞的生长增殖,相同作用时间下各浓度ASODN转染组细胞抑制率均显著高于空白对照组、脂质体转染对照组和正义寡核苷酸SODN组(P<0.05)。相同浓度(800nmol/L)下Survivin ASODN随着时间的增加其抑制作用明显增强,有着较为明显的时效关系,48h抑制率升至最高。 各Survivin ASODN转染组细胞凋亡率均明显高于空白对照组、脂质体转染对照组和SODN转染组(P<0.05),且细胞的凋亡率随着Survivin ASODN浓度增加而增加,呈剂量依赖关系,以800nmol/L时,其促进细胞调亡的作用最强。相同浓度(800nmol/L) Survivin ASODN转染SK-N-SH细胞后,细胞凋亡率48h达高峰,72h后开始下降,表明Survivin ASODN对SK-N-SH细胞凋亡的促进作用呈一定的时间依赖性,最佳作用时间48h。 细胞迁移和侵袭实验中,转染作用24、48、72h后,各Survivin ASODN转染组迁移穿膜细胞数和侵袭穿膜细胞数均明显减少,与空白对照组、脂质体转染对照组、SODN对照组间比较,有显著的差异(P<0.05),且呈现一定的剂量和时间依赖性,以浓度为800nmol/L时的作用最明显,最佳作用时间为48h。结论 Survivin ASODN能通过特异性抑制SK-N-SH细胞中Survivin mRN及蛋白的表达,诱导SK-N-SH细胞凋亡,抑制肿瘤增殖,并降低SK-N-SH细胞的侵袭和迁移能力。 第二部分YM155对神经母细胞瘤细胞迁移和侵袭的影响 目的 探讨Survivin抑制剂YM155对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制。

关键词： 骨髓间充质干细胞   神经生长因子β   低氧诱导因子-1α   基因转染  

摘要： 目的 本文通过对NGFβ/HIF-1α双基因转染表达对SD大鼠骨髓间充质干细胞生物学功能的影响及其安全性评价的研究，为应用组织工程学方法治疗脊髓损伤奠定基础。 方法 首先，复苏SD大鼠BMSCs，采用贴壁培养法将SD大鼠BMSCs传代培养，取细胞融合率达85%以上的BMSCs用于实验研究。然后，分别构建编码NGFβ、HIF-1α表达基因的慢病毒载体，测定最佳感染复数，用最佳感染复数的携载目的基因的慢病毒载体转染BMSCs，Western blot检测基因转染后NGFβ和HIF-1α表达水平。实验共分五组：A组，空白对照组；B组，空载慢病毒组；C组，NGFβ单基因转染组；D组，HIF-1α单基因转染组；E组，NGFβ/HIF-1α双基因转染组。最后，通过透射电镜观察细胞超微结构，MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期，体外软琼脂集落形成实验检测细胞成瘤性，评测携载目的基因的BMSCs的生物学功能及生物安全性。数据采用SPSS19．0统计软件，方差分析比较组间差异。 结果 1、在倒置显微镜下观察，BMSCs呈贴壁样生长，培养3-5天，BMSCs的基本形态为长梭形，部分呈不规则的多边形，漩涡状排列，细胞融合率可达到80%-90%。 2、慢病毒转染后，倒置荧光显微镜下观察可见A组无荧光表达，B组呈现绿色荧光，C组呈现红色荧光，D组呈现绿色荧光，E组可呈现黄色荧光。在转染后72h，MOI=100时荧光呈全细胞分布，转染率可达85%以上。 3、Western blot检测到A组和B组无明显NGFβ/HIF-1α蛋白表达，C组中仅有NGFβ蛋白表达，D组中仅有HIF-1α蛋白表达，E组中NGFβ/HIF-1α两种蛋白均表达。 4、透射电镜下观察细胞超微结构，在B组和D组的细胞质中，细胞器丰富，形态正常，与A组细胞结构比较无明显差别；在C组和E组的细胞质中，细胞器丰富，形态正常，与A组细胞结构比较无明显差别，但在部分细胞的胞质中可见到神经丝形成。 5、MTT法检测细胞的增殖能力结果显示1-3天为细胞生长的潜伏期，3-5天为对数生长期，5-7天为平台期。第5天时各组的BMSCs的增殖能力趋于高峰，实验组与阴性对照组，阳性对照组无明显差别。 6、流式细胞仪检测细胞周期结果显示各组中S+G2+M期细胞均约占20%，G0/G1期细胞均约占80%，实验组与阴性对照组，阳性对照组之间无明显差别。 7、体外软琼脂集落形成实验结果显示双基因转染组BMSCs未见细胞集落形成。 结论 1、NGFβ/HIF-1α双基因转染的BMSCs可持续高表达HIF-1α及NGFβ蛋白。 2、NGFβ/HIF-1α双基因转染的BMSCs具有良好的生物学功能及安全性。