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关键词： 溃疡性结肠炎   清肠化湿法   树突状细胞   NF-κB  

摘要： 目的针对溃疡性结肠炎活动期病机组成“清肠化湿、调气和血、敛疡生肌”的清肠化湿方,通过体外实验,观察其对小鼠骨髓来源树突状细胞抗原提呈功能的影响,探讨清肠化湿方治疗溃疡性结肠炎的作用机制。 方法采用rmGM-CSF诱导小鼠骨髓来源树突状细胞,以NF-κB基因圈套寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)转染后的小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)生物学特性为对照,观察清肠化湿方孵育后DC的细胞生物学特性的改变及NF-κB核转位情况,确立清肠化湿方通过抑制NF-κB的活化而影响DC的抗原提呈功能。rmGM-CSF诱导培养第6日分别予清肠化湿方共培养和ODN转染DC,第7日予LPS刺激24h。实验分为六组,分别为空白组,ODN转染组,清肠化湿方组,LPS组,ODN转染+LPS组,清肠化湿方+LPS组。免疫荧光法检测各组NF-κB核转位情况；流式细胞术检测各组DC表面标志抗原CD11c,共刺激分子CD40,MHC Ⅱ的表达。 结果通过rmGM-CSF诱导5天后,倒置显微镜下可明显观察集聚的细胞团,呈疏松贴壁状态,继续培养至第7日予LPS刺激24h后,可明显观察到细胞悬浮。各组DC表面CDllc表达无明显差异；与LPS组相比,清肠化湿方、ODN均能有效降低DC表面MHC Ⅱ.CD40的表达水平,P<0.05；与LPS组相比,清肠化湿方、ODN均能降低NF-κB的入核率,P<0.05,清肠化湿方与ODN两者之间比较,P>0.05,统计学无明显差异。 结论清肠化湿方对NF-κB、DC表面抗原CD40、MHCⅡ均有不同程度的干预和调控作用,并且可能是通过以上作用机制影响树突状细胞成熟与分化,下调抗原提呈功能,减轻炎症反应,从而达到治疗溃疡性结肠炎的目的。

关键词： 医学细胞生物学   实验教学   教学效果  

摘要： 实验教学是《医学细胞生物学》课程的重要内容,可以通过合理安排实验、优化教学内容、改变教学方法、有效使用多媒体辅助教学以及灵活运用授课技巧来提高实验课的教学质量.

关键词： 乳腺癌干细胞   CD44+CD24-/low   CD44   敲减  

摘要： [目的]1、通过检测人乳腺癌MDA-MB-435细胞系中CD44+CD24-/l0W表型细胞的比例,探讨CD44分子在乳腺癌发生中的作用。2、采用短发夹状RNA(shRNA)干扰技术敲减MDA-MB-435系中CD44,观察其是否抑制人乳腺癌MDA-MB-435细胞系中CD44的表达,以及对MDA-MB-435细胞生物学行为是否产生影响。 [方法]1、流式细胞仪检测人乳腺癌MDA-MB-435细胞系中CD44的表达,确定MDA-MB-435细胞系中含CD44+CD24-/low表型细胞的比例。2、本实验采用先前以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435和原发性乳腺癌组织中表达最高的CD44剪接变异体4(CD44s) mRNA为模板,设计、合成shRNA基因片段,构建特异的shRNA-CD44s质粒表达载体,以乱序siRNA和shRNA-GAPDH质粒表达载体作为对照。3、脂质体法将上述质粒瞬时转染到人乳腺癌MDA-MB-435细胞内,应用体外成球实验、Transwell侵袭小室法和流式细胞技术观察shRNA-CD44s阻断CD44基因表达对MDA-MB-435细胞增殖、黏附、侵袭、细胞周期分布及细胞凋亡的影响。4、在瞬时转染的基础上,通过G418筛选,建立稳定转染的MDA-MB-435细胞系,将未转染的MDA-MB-435细胞系作为空白对照组,实时荧光定量PCR检测各组MDA-MB-435细胞的CD44mRNA表达水平并观察CD44mRNA的表达是否受到抑制,应用体内成瘤实验进一步观察敲减CD44对成瘤能力的影响。 [结果]1、流式细胞仪检测显示：用流式细胞术的方法检测人乳腺癌MDA-MB-435细胞,可获得含CD44+CD24-/low表型细胞的比例达到90%以上。2、shRNA-CD44s能明显降低MDA-MB-435细胞中CD44s基因nRNA的表达量,促进乳腺癌MDA-MB-435细胞的凋亡利坏死,调控细胞周期,使细胞侵袭力降低,同时能抑制细胞的增殖、自我更新能力。3、体内成瘤实验显示,在NOD/SCID小鼠胸部皮下注射106个未转染shRNA-CD44s的MDA-MB-435细胞,第21天,注射部位出现质地较硬的结节,然而左侧注射106个转染shRNA-CD44s的MDA-MB-435细胞,第21天,注射部位却未见明显的肿瘤形成。荧光显微镜下观察,未转染组肿瘤组织中有明显红色荧光信号,荧光信号区域分布广泛,说明对照组肿瘤组织中有CD44蛋白的表达；而转染组肿瘤组织中可见到微弱的或几乎见不到的红色荧光信号及绿色的GFP荧光。肿瘤组织石蜡切片HE染色,光镜下见未转染组的肿瘤组织呈条索状排列,未见明显导管分化。中央见大片坏死,细胞体积大,胞浆嗜酸性透亮,细胞核明显增大,深染,病理性核分裂易见,大部分细胞可见明显核仁,局部可见奇异巨细胞,而转染组肿瘤组织大部分细胞体积中等,中央未见坏死。[结论]1、敲减CD44可使乳腺癌细胞的成球能力减弱,提示乳腺癌干细胞干性受到抑制并分化成非乳腺癌干细胞,提示CD44是发挥肿瘤干细胞干性的关键分子。2、敲减CD44可抑制乳腺癌细胞的增殖,调控细胞周期,促进细胞的凋亡和坏死,使细胞侵袭力降低。3、本项目的研究结果为乳腺癌的靶向治疗提供了新依据和线索。

关键词： 中药   肿瘤干细胞   K562细胞   生物学特性   表型  

摘要： 恶性肿瘤一直是世界性医学难题,其治疗之难难于上青天。化疗作为肿瘤治疗的主要方法已经遭遇瓶颈而难以有所突破[1,2]。靶向治疗已发展成为近年来的重要的治疗手段,但肿瘤发生发展的多环节、多基因和多靶点,使得靶向治疗在针对肿瘤发病机制上如同面临敌众我寡的局面而具有局限性。绝大多数肿瘤治疗至今未见突破性进展。原因主要在于肿瘤存在肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)。从天然资源中开发新药是抗白血病药物研究的一个热点,近年国际国内对肿瘤的治疗方法采取了温阳疗法治疗肿瘤。三阳血傣源于傣族贝叶经和中药结合,是云南省新开发的治疗肿瘤特色药物,主要含的肉桂成分具有对人的多种肿瘤细胞杀伤作用的能力。大回阳饮是云南省已故著名温阳大家“吴附子”吴佩衡先生创制的名方,该方所含的附子具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。观察云南特色有效的三阳血傣和大回阳饮中温阳药物对白血病细胞及其干细胞的诱导驯化作用,以此改变恶性细胞的阴阳状态,将其从静止封闭的阴态提升至激活开放的阳态。明确温阳中药有效成分对白血病及其干细胞生物特性的影响程度,为白血病尤其是白血病干细胞治疗久攻不下寻求突破的新途径。要研究结果如下:对三阳血傣中的肉桂所含桂皮醛和大回阳饮所含附子里的新乌头碱有效成分提取并纯化。体外吸收模型的已成功建立:Caco-2细胞单层细胞培养21天,细胞达到汇合分化,用上皮电阻仪测量细胞单层的跨膜电阻TEER。测试细胞的完整性。进行电子显微镜拍照。(1)桂皮醛具有药理活性桂皮醛对K562细胞的无细胞毒的浓度范围为50μg/ml-75μg/ml,与对照组(只加入DMSO组)相比,能抑制K562细胞生长,且呈浓度、时间依赖性(P<0.05),作用时间为72小时,抑制效果明显。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期状态,测定G1/S期细胞所占比例。实验结果显示,50μM桂皮醛作用K562细胞,S期比例上升了 4.32%;75μM桂皮醛作用K562细胞,S期比例上升了 11.73%。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)分析白血病细胞株K562的CD34+CD38-等抗原变化。细胞分化抗原检测结果提示桂皮醛使K562细胞向髓系,红系分化,但同时能诱导K562中的干细胞比例降低。FCM通过Annexin V/PI染色法测定细胞凋亡变化,桂皮醛作用K562细胞72h后凋亡率明显增加,50μM桂皮醛作用K562细胞72小时,细胞凋亡率为1.979%;75μM桂皮醛作用K562细胞72小时,细胞凋亡率为5.690%,提示桂皮醛可能部分通过诱导细胞凋亡的途径来抑制细胞增殖。甲基纤维素细胞体外克隆形成细胞培养法观察白血病细胞株K562集落形成情况,自我更新和增殖能力。桂皮醛能够明显抑制K562细胞的克隆形成,50 μM、75 μM桂皮醛组集落形成率分别为(1.25±0.13)%、(2.70±0.36)%,加药组与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。实验证明三阳血傣中的肉桂所含的桂皮醛能够改变白血病细胞的生物学特性。(2)新乌头碱具有药理活性新乌头碱对K562细胞的无细胞毒的浓度范围为25μg/ml-50μg/ml,作用时间为72小时,抑制效果明显。与对照组相比,能抑制K562细胞生长,且呈浓度、时间依赖性(P<0.05),作用时间为72小时,抑制效果明显。流式细胞仪检测白血病细胞的细胞周期状态,测定G1/S期细胞所占比例。实验结果显示,25μM新乌头碱作用K562细胞,S期的比例上升了 4.40%,50μM新乌头碱作用K562细胞,S期比例上升了 17.88%。FCM分析白血病细胞株K562的CD34+38-等抗原变化。细胞分化抗原检测结果提示新乌头碱使K562细胞向巨核系分化,但同时能诱导K562中的干细胞比例降低。流式细胞术通过Annexin V/PI染色法测定细胞凋亡变化,新乌头碱作用K562细胞72h后凋亡率明显增加,提示桂皮醛可能部分通过诱导细胞凋亡的途径来抑制细胞增殖。甲基纤维素细胞体外克隆形成细胞培养法观察白血病细胞株K562集落形成情况,自我更新和增殖能力。新乌头碱能够明显抑制K562细胞的克隆形成,25 μM、50 μM新乌头碱组集落形成率分别为(1.72±0.18)%、(1.91±0.13)%,加药组与对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。实验证明大回阳饮中的附子所含的新乌头碱能够改变白血病细胞的生物学特性。

关键词： 组蛋白乙酰化   胶质瘤Nanog   组蛋白H3Apicidin  

摘要： 目的：研究正常脑组织、不同级别胶质瘤组织以及胶质瘤细胞系U87中H3乙酰化组蛋白的表达，使用去乙酰化酶抑制剂Apicidin干扰U87胶质瘤细胞系，研究组蛋白H3乙酰化程度改变对胶质瘤细胞中Nanog的影响，并探索组蛋白H3低乙酰化对胶质瘤细胞体内及体外生物学活性的影响。为后续进一步研究Nanog的表观遗传学干预治疗奠定基础。 方法：①使用Western-Blot方法检测53例不同级别脑胶质瘤组织及11例取自颅脑损伤行内减压术患者的正常脑组织中H3乙酰化组蛋白的表达情况，RealtimePCR检测高级别和低级别胶质瘤组织内Nanog表达情况。②通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidin干预U87胶质瘤细胞，不同浓度和时间干预过后，通过RT-PCR和Western-blot实验分别检测U87细胞株中H3乙酰化组蛋白和Nanog的mRNA和蛋白表达水平，ChIP检测U87细胞系中Nanog启动子区域H3组蛋白乙酰化水平。③通过MTT、细胞划痕实验、流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期、透射电镜检测凋亡、裸鼠成瘤实验、免疫组织化学染色等方法检测组蛋白H3低乙酰化水平抑制Nanog后对胶质瘤细胞体内外生物学活性的影响。 结果：①与正常脑组织相比，乙酰化组蛋白H3在不同级别胶质瘤中的表达均明显上调（P＜0.05）。WHO Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织中乙酰化组蛋白H3表达明显高于WHOⅠ～Ⅱ级（P＜0.05）。与正常脑组织相比，在胶质瘤细胞系U87中的表达亦显著升高（P＜0.05）。②利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidin干预胶质瘤U87细胞系后，同时检测乙酰化组蛋白H3及Nanog表达水平的变化，发现Nanog启动子区域的组蛋白H3乙酰化水平降低，同时Nanog的表达亦明显降低；③与空白对照组相比，U87-Apicidin胶质瘤细胞的增殖水平和迁移能力均减弱，细胞凋亡增加； U87-Apicidin皮下胶质瘤的体积与质量都明显小于空白对照组，提示Apicidin处理组U87细胞裸鼠皮下成瘤能力亦明显下降（P＜0.05）。 结论：①组蛋白H3乙酰化可能与胶质瘤的发生发展关系密切。胶质瘤级别越高，乙酰化组蛋白H3的表达量越高；②Nanog启动子区域的组蛋白H3乙酰化修饰水平可以影响Nanog的表达；③Apicidin可以特异性的降低Nanog启动子区域乙酰化组蛋白H3水平，从而影响Nanog的表达，最终对胶质瘤的生物学活性产生抑制性作用。

关键词： M2型巨噬细胞   炎症小体   糖酵解   结肠癌  

摘要： 背景： 结肠癌严重威胁人类健康,在我国更是有日渐严重的趋势,引起社会普遍的关注。针对结肠癌的研究发现,作为肿瘤细胞赖以生存的土壤,肿瘤微环境在结肠癌演变过程中起到重要作用,它能通过调节局部的免疫反应和炎症反应来影响肿瘤的发生和发展,而存在于肿瘤微环境中的巨噬细胞-肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)在调节免疫和炎症反应过程中发挥重要作用。 巨噬细胞是人体体液免疫和细胞免疫中的重要组成部分,作为一种效应细胞和抗原提呈细胞,它参与人体内很多急性和慢性炎症反应,在不同环境下,巨噬细胞能表现出具有不同功能的两种表型：M1型和M2型。近年研究发现,肿瘤微环境中的巨噬细胞-肿瘤相关巨噬细胞TAM既存在M1型也有M2型,甚至在肿瘤发生发展的不同时期,TAM还会发生不同表型问的转化,TAM可以通过复杂的自分泌、旁分泌途径作用于T细胞或者肿瘤细胞,从而影响肿瘤的侵袭和转移能力,并与肿瘤的恶性增殖和凋亡密切相关。TAM的表型转化与肿瘤细胞之间的相互作用及其确切机制尚不十分清楚。 巨噬细胞中存在一种模式识别受体Nod样受体,它能在受到外界刺激激活后,与下游级联蛋白形成巨大的蛋白复合体--炎症小体。NLRP3(Nod-like Receptor pyrin domain containing-3protein)炎症小体在机体免疫反应和各种炎症疾病发生过程中都具有重要作用,它能活化caspase1进而调控炎性细胞因子IL-1β和IL-18的表达和释放。Jonas Ungerback发现Nlrp3-/-小鼠与野生型相比,更容易发生DSS诱导的结肠炎和肿瘤。近年来的研究结果显示炎症小体及其下游产物能够维持组织稳态,并通过复杂级联通路控制机体的过度炎症反应。 恶性肿瘤一个显著的生化特征就是细胞在缺氧环境中进行活跃的糖酵解代谢,甚至在重新获得充足的氧时,仍能继续依赖糖酵解获得能量(“有氧糖酵解”),虽然这种代谢途径的产能效率低于线粒体的有氧呼吸途径,但活跃的糖酵解代谢是肿瘤细胞能量ATP的重要来源。肿瘤细胞的这一特性,被称作Warburg效应。有研究发现,糖酵解代谢途径受到肿瘤微环境中各种细胞因子的调控,从而影响肿瘤细胞的发生发展。 本实验拟通过共培养体系及表型鉴定,研究结肠癌LoVo细胞对巨噬细胞极化表型的影响,同时体外诱导培养M2型巨噬细胞,使之与人结肠癌LoVo细胞共培养,研究M2型巨噬细胞对LoVo细胞生物学特性的影响,进一步探究肿瘤细胞中糖酵解过程与巨噬细胞炎症小体通路间的关系,旨在为进一步研究巨噬细胞与结肠癌细胞间复杂的相互作用关系及其调控机制奠定基础。 目的： 研究结肠癌LoVo细胞对巨噬细胞极化表型的影响,进一步在体外诱导巨噬细胞分化,研究M2型巨噬细胞对结肠癌LoVo细胞生物学特性的影响,并进一步探讨产生影响的潜在分子机制。 方法： 1.采用佛波酯(PMA)和白介素4(IL-4)体外刺激诱导M2型巨噬细胞,用Western blot和相关试剂盒检测细胞标志蛋白精氨酸合酶(ARG1)、一氧化氮合酶(iNOS)、甘露糖受体(CD206)的表达,以鉴定不同表型的巨噬细胞 2.将巨噬细胞与结肠癌细胞进行Transwell非接触式共培养 ***法检测共培养对肿瘤细胞活力的影响 4.划痕实验检测共培养对肿瘤细胞迁移能力的影响 5.根据分光光度法利用Caspase1活性检测试剂盒检测共培养条件下细胞中caspase1的活性 6.糖酵解关键酶活性检测：根据分光光度法检测肿瘤细胞丙酮酸激酶(PK)、己糖激酶(HK)的活性变化 结果： 在共培养体系中,结肠癌LoVo细胞能够诱导未分化的M0型巨噬细胞向M2型巨噬细胞方向极化。 经过体外诱导鉴定得到高表达CD206、ARG1,低表达iNOS的M2型巨噬细胞。 MTT显示,在梯度巨噬细胞培养液(20μl,40μl,60μl,80μl,100μl)影响下,结肠癌LoVo细胞的活力受到明显的抑制；划痕实验显示,共培养后肿瘤细胞的迁移能力受到抑制。 共培养条件下,巨噬细胞的caspase1活性增强,而肿瘤细胞变化不大。 共培养条件下,肿瘤细胞中PK、HK的活性明显的降低。 结论： 在M2型巨噬细胞与结肠癌细胞共培养状态下,癌细胞生长受到抑制,迁移能力减弱,糖酵解途径中的关键酶PK、HK活性下降,其机制可能与M2型巨噬细胞炎症小体通路被激活,上调11-1β的表达相关。

关键词： 细胞生物学   双语教学   教学改革  

摘要： 高等教育国际化已成为一种不可避免的趋势,双语教学则是高校实现教育国际化采取的一项必要措施。而在当代生命科学领域中发展最为迅速的细胞生物学,其课程实施双语教学的迫切性更加突出。文章根据总结以往的双语教学经验,对细胞生物学双语教学的必要性、面临的问题,以及提高教学效果的对策等几方面进行了深入论述,为细胞生物学双语教学改革取得良好成效提供了理论基础。

关键词： 羊水干细胞   肾组织多潜能干细胞   0.01%胰酶培养液   类胚体   多潜能细胞   干细胞分化   干细胞凋亡  

摘要： 近年来,在人和动物的羊水中发现一类多潜能干细胞(Amniotic fluid-derived stem cells, AFSC), AFSC生长无需滋养层细胞,能够表达胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和成体干细胞(Somatic Stem Cell, SSC)的标志基因,体外悬浮培养能形成类胚体,因此,羊水来源干细胞被认为具有发育全能性并在体内可能发挥极其重要的生理功能。 本试验研究中,采用两种不同的分离培养方法共从绵羊羊水以及胎儿肾组织中成功分离培养3株表达Oct4和SSEA-1多潜能干细胞。采用干细胞通用分离培养方法,以鼠胚胎干细胞培养液成功分离培养一株羊水来源多潜能干细胞(AFSC), AFSC表达主要组织相容性抗原(major histocompatibility gene, MHC)MHC-Ⅰ不表达MHC-Ⅱ,称之为AFSC-Ⅰ。在此基础上,通过调整培养液组成,采用低浓度胰酶培养液培养,从同—受孕中期绵羊的羊水和胎儿肾组织中分别分离培养1株多潜能干细胞。其中,羊水来源的干细胞表达MHC-Ⅱ,不表达MHC-Ⅰ,称之为AFSC-Ⅱ,肾组织来源的多潜能干细胞(The renal tissue pluripotent stem cells, RTSC)表达MHC-Ⅱ,不表达MHC-Ⅰ,称之为RTSC-Ⅱ。 RT-PCR分析结果表明,AFSC-Ⅰ表达ESCs相关标志基因Oct-4、Nanog,胚胎生殖细胞(Primordial germ cells,EGCs)标志基因SSEA-1及间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)相关标志基因CD117、SH2等,主要组织相容性抗原MHC-Ⅰ,不表达MHC-Ⅱ。Real time PCR分析结果表明,AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ均表达ESCs相关标志基因Oct-4,胚胎生殖细胞标志基因SSEA-1,主要组织相容性抗原MHC-Ⅱ,细胞凋亡基因Bcl-2以及抑制细胞凋亡基因Bax,不表达MHC-Ⅰ、Nanog以及Tert。基因表达相对定量分析表明,AFSC-Ⅱ的Oct-4相对表达量是RTSC-Ⅱ的1.8倍,而AFSC-Ⅱ的SSEA-1相对表达量是RTSC-Ⅱ的1.12倍,AFSC-Ⅱ的Bcl-2和Bax的相对表达量约为RTSC-Ⅱ的2倍。在AFSC-Ⅱ中Bax、Bcl-2基因的相对表达量是SSEA-1的62、63.7倍,Bax/Bcl-2约为0.97。在RTSC-Ⅱ中, Bax、Bcl-2基因的相对表达量是Oct4的133,105倍,Bax/Bcl-2约为1.3。AFSC-Ⅰ、AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ体外悬浮培养7d后均能形成类胚体。RT-PCR检测结果表明类胚体表达三胚层特异标志基因fgf5(外胚层)、α-fetoprotein(内胚层)和ξ-globin(中胚层)。AFSC-Ⅰ培养至40代,AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ至10代,二倍体核型检测正常率分别为94%、88%、90%。非正常核型为染色体数目发生倍增。 以携带有强启动子CMV的p CMV-DsRed为报告质粒,脂质体法介导转染AFSC-ⅠI和RTSC-Ⅱ,流式细胞仪分析,结果表明基因的瞬时转染效率为分别为68.61%、69.17%,通过浓度为6mg/mL的G418快速筛选获得纯化转基因AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ。转基因AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ体外悬浮培养7d均能形成类胚体。Real time PCR分析,结果显示转基因AFSC-Ⅱ和RTSC-Ⅱ均表达Oct-4、SSEA-1、Bax、Bc1-2和MHC-Ⅱ,不表达MHC-Ⅰ、Nanog以及Tert。AFSC-Ⅱ在转染后,相对表达量分析显示,SSEA-1的表达量显著增加,Oct-4、Bax的表达量略有下降,而Bcl-2却出现明显下降。而RTSC-Ⅱ转染后,相对表达量分析显示,Oct-4的表达量显著增加,其相对表达量为转染前的13倍,SSEA-1的表达量未发生明显变化,而Bax和Bcl-2的表达明显下降。在AFSC-Ⅱ转染后,Bax、Bc1-2的相对表达量为SSEA-1的53.4、36.6倍,Bax/Bcl-2约为1.5。在RTSC-Ⅱ转染后Bax、Bcl-2的相对表达量为Oct4的5.5、3.1倍。Bax/Bcl-2约为1.8。 研究结果显示,绵羊羊水干细胞的生物学特性与胚胎干细胞类似,但是又有别于胚胎干细胞。同时,体内机体组织中有与羊水干细胞类似细胞存在意味着羊水干细胞有可能在人与动物的机体组织中扮演着重要的角色。因此,对羊水干细胞的生物学特性进行深入系统研究具有重要的理论和实践意义。

关键词： 神经干细胞   干细胞分化   激酶抑制剂   细胞生物学  

摘要： 目的：本研究旨在观察Rho激酶抑制剂Y-27632对大鼠胚胎脑神经干细胞增殖分化的影响，为神经干细胞的增殖和分化寻求新的诱导方式，为Rho激酶抑制剂在神经干细胞移植治疗脑损伤方面提供新的实验依据。\n 方法：通过饲养SD大鼠，获取SD胎鼠，取SD胎鼠脑海马组织，制备单细胞悬液，加入NSCs培养基培养，在形成神经球之后，分离神经球传代培养，并利用免疫荧光检测神经干细胞表面特异的标志蛋白Nestin和CD133，鉴定神经干细胞。神经干细胞实验设置3个组(n=9):空白对照组，细胞在NSCs完全培养基培养;LPA处理组，在神经干细胞培养基中加入LPA(200ng/ml);实验组:在神经干细胞培养基中加入LPA(200ng/ml)和Y27632(200ng/ml)，培养两周后，软琼脂检测细胞的单克隆个数、观察细胞的形态。然后利用免疫荧光检测神经干细胞Ki67和GFAP的表达情况。最后收集三组细胞分别提取RNA和蛋白质进行荧光定量和western blotting，检测Ki67和GFAP基因表达量的变化。\n 结果：免疫荧光检测神经干细胞表面蛋白Nestin、CD133，结果均为阳性，表明成功分离出了大鼠神经干细胞。软琼脂实验检测LPA组神经干细胞单克隆的数量是空白对照单克隆的1.54倍，与空白对照组相比，实验组单克隆的数量稍有降低，但没有统计学意义;免疫荧光检测三组细胞，LPA组细胞Ki67明显呈现阳性;空白对照组和实验组细胞GFAP显阳性，Ki67的表达较弱。荧光定量结果显示，较空白对照组，LPA组细胞GFAP表达量无明显变化，而Ki67基因表达量升高了2.97±0.74倍;实验组GFAP基因表达量也升高5.03±0.62倍。westernblotting结果显示，较空白对照组，LPA组细胞GFAP表达量无明显变化，而Ki67相对表达量升高2.47±0.56倍;实验组GFAP相对表达量均升高了2.14±0.73倍，ki67无明显变化。\n 结论：本研究已经成功分离出大鼠的神经干细胞，并在体外增殖，大量培养。Rho激酶抑制剂Y27632可以提高体外培养的神经干细胞中GFAP的表达，提示Rho激酶抑制剂Y27632可以促进神经干细胞向神经细胞的定向分化，对损伤的神经细胞可能有保护作用。

关键词： 多不饱和脂肪酸   胃癌   高糖高胰岛素   氧化应激   迁移   代谢  

摘要： 研究背景和目的：近年来,越来越多的研究发现多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)对抑制或者缓解各类慢性疾病的发生和发展都有极显著的作用。然而各种慢性疾病之间存在着潜在的并发危险,而现阶段对不饱和脂肪酸的研究只停留在对单一慢性疾病的影响,很少有关于多不饱和脂肪酸影响慢性疾病并发症的研究。此外,对多不饱和脂肪酸的研究也局限在单独的脂肪酸对各类慢性疾病的影响,没有涉及到利用多不饱和脂肪酸优良的生物学活性联合对人体有毒副作用的化学药物来探索低毒治疗的新途径。本文就这两个方面进行了初步的研究和探讨：1、本文用具有代表性的多不饱和脂肪酸ALA(a-Linolenic Acid)、LA (linoleic acid)处理高糖高胰岛素环境下的胃癌细胞,以氧化应激为切入点,研究多不饱和脂肪酸对胃癌细胞的影响。2、PUFAs联合传统抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-FU)处理胃癌细胞,研究联合治疗对胃癌细胞氧化应激,迁移和代谢等的影响。 方法：1、以正常胃细胞(GES-1)和胃癌细胞(MGC、SGC)为研究对象,建立高糖高胰岛素环境,用多不饱和脂肪酸亚麻酸、亚油酸分别干预48h,MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)去测定细胞存活率;流式细胞仪分析细胞凋亡情况;荧光法测定活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量;化学反应法测定超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量;用酶联免疫法测定脂氧素(lipoxin4, LXA4)水平;2、以胃癌细胞为研究对象,5-FU处理组为实验对照组,加入多不饱和脂肪酸干预48h后,MTT法测定细胞存活率,化学法测定超氧化物歧化酶活性、丙二醛积累量和一氧化氮分泌量;荧光法测定细胞线粒体膜电位;3、以胃癌细胞为研究对象,5-FU处理组为实验对照组,加入多不饱和脂肪酸干预48h后,划痕法观察细胞迁移情况,酶联免疫法测定新生血管相关因子肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-a, TNF-a)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌以及代谢相关因子过氧化物酶体增殖因子活化受体Y(Peroxisome proliferator-activated receptor y, PPARy), CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT-enhancer binding protein a, CEBPA)和脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)的表达。 结果：1、ALA、LA使MGC、SGC的SOD活性显著下降,MDA积累量显著增加,ROS在细胞内大量积累,两株癌细胞均出现显著凋亡,LXA4水平下降的现象。多不饱和脂肪酸能显著增加自由基的积累,降低清除自由基的能力,引起癌细胞的氧化损伤,进而引发凋亡,具有抑制胃癌细胞在高糖高胰岛素环境下生长的能力,同时保护正常细胞不受损害。2、6种多不饱和脂肪酸ALA、EPA、DHA、LA、GLA、AA的加入使胃癌细胞的SOD活性,NO分泌量以及线粒体膜电位显著下降,MDA积累量显著上升,而正常细胞不受损害。3、6种多不饱和脂肪酸的加入能较好的抑制两株胃癌细胞的迁移;同时,显著地抑制了新生血管相关因子TNF-α和VEGF的分泌;显著增加代谢相关因子PPARy,CEBPA和LPL的表达。多不饱和脂肪酸联合5-FU能有效增强对癌细胞的杀伤作用,并且对正常细胞有一定的保护作用。