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关键词： 人脐带间质干细胞   生物学特征   早衰模型   氧化应激   体外扩增  

摘要： 目的:在体外扩增培养的过程中，探讨不同传代次数的人脐带间质干细胞（humanumbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）生物学特征的改变及建立过氧化氢(H2O2)诱导的人脐带间质干细胞早衰模型，进而探索氧化应激与脐带间质干细胞衰老的可能关联，从而为临床选用优质干细胞治疗提供相应参考依据。　　方法:(1)分离培养hUC-MSCs，采用组织块贴壁法。借助于形态特征、表面抗原标记等对其进行生物学特性鉴定。(2)原代培养细胞作为P0代hUC-MSCs，分别选取第4代(P4)，第11代(P11)，第17代(P17)分别代表年轻组，中年组及老年组。比较脐带间质干细胞在体外传代扩增的过程中，这三个阶段干细胞生物学性状上的差异。扫描电镜观察细胞膜表面超微结构及免疫荧光法检测细胞核染色质变化;MTT方法用于检测细胞增殖活力;采用衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)，检测不同代数hUC-MSCs衰老的变化;茜素红染色检测不同代数hUC-MSCs成骨分化，油红O细胞化学染色检测其成脂分化能力;流式细胞仪分析检测细胞周期及检测细胞内ROS表达量水平;免疫荧光法验证ROS在细胞内的定位;通过收集条件培养基，我们采用transwell迁移实验检测不同代数细胞分泌细胞因子的差异，从而间接反映不同传代能力hUC-MSCs分泌细胞因子的差异。RT-PCR技术检测衰老基因p53，p21及氧化还原因子APE1/Ref-1表达情况。(3)为探讨衰老与氧化应激的关系，我们选用不同浓度的氧化剂H2O2处理年轻组P4代hUC-MSCs，检测β-半乳糖苷酶活性，细胞周期及相应基因p53，p21及APE1/Ref-1情况。(4)采用GraphPad Prism5.0软件进行数据统计分析，当p＜0.05时，认为差异有统计学意义。　　结果:(1)从脐带组织中分离出一种长梭形细胞，经纯化后流式细胞仪鉴定符合间质干细胞相应表面标志:CD29(+)，CD44(+)，CD90(+)，CD105(+)，CD34(-)及HLA-DR(-).(2)不同代数的hUC-MSCs，其细胞形态的改变。扫描电镜显示，年轻组P4代细胞呈典型的瘦长，梭型，形态饱满立体，表面微绒毛分布均匀，而中年组P11代及老年组P17代，细胞形态复杂多变，宽大扁平，表面微绒毛分布稀少不均，并且细胞伪足增多，增多的伪足数目不一。此种变化在P17代表现尤其明显。DAPI染核显示，在年轻组细胞核中DNA呈均一分布，而老年组细胞核则呈现十分明显的DNA点块状聚集，即衰老相关异染色质聚集(senescence-associated heterochromatic foci，SAHF)。中年组细胞核DNA染色质相对均一，虽未达到点状聚集状态，但有开始聚集趋向，可能处在一种过渡衰老状态。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色显示，年轻组，中年组，老年组阳性率分别为:1.15％，35.3％，65.8％，说明衰老细胞在体外扩增的过程中逐渐增多，。(3) MTT检测结果显示，增殖能力随着传代次数的增加而下降，老年组hUC-MSCs增值能力明显降低，生长曲线趋向于停滞。流式细胞周期显示，P4，P11及P17代细胞G1期含量分别是:59.88％，63.85％，87.66％，可见老年组细胞发生明显的G1期阻滞。此外，transwell迁移实验显示，不同代数的hUC-MSCs分泌的细胞因子的能力发生显著改变。这个结果暗示我们，体外长期培养的过程中，干细胞的微环境很可能已经发生改变。(4)分化能力:成脂诱导21天后，油红O染色显示，与年轻组相比，中年组及老年组细胞诱导分化成脂肪滴能力均降低。成骨诱导14天，茜素红染色显示，与年轻组相比，中年组及老年组细胞诱导分化能力均降低，而老年组降低更显著。但在老年组成骨诱导分化的过程中，出现一个特殊的细胞集落，与周围宽大扁平的衰老细胞相比，这群细胞形态明显的小，规则，类圆形，似上皮样改变。由于在微环境发生变化的条件下，衰老细胞更容易发生癌变，所以我们高度怀疑这个集落是在成骨微环境条件下形成的肿瘤突变株，虽然我们尚未对其进行详细证明。(5)细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS):流式分析显示，与P4代细胞相比，P11及P17代细胞内ROS水平曲线右移，平均荧光强度逐渐增高。免疫荧光与流式显示结果一致，二者均可说明，细胞内的活性氧在体外培养扩增的过程中是不断累聚的。(6)基因表达:RT-PCR显示，与年轻组P4代细胞相比,p53，p21和APE1/Ref-1 mRNA表达量在P11，P17代中表达上调，但中年组P11代各基因表达量要略强于老年组P17代。(7)早衰模型:β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、流式细胞周期

关键词： 食管肿瘤   清热化痰活血方   生物学性状   细胞周期蛋白  

摘要： 目的:分选鉴定无血清培养食管癌细胞EC9706中干细胞，以其为对象进行中药二次筛选组方;探讨中药组方及拆方对食管癌细胞EC9706中干细胞生物学性状的影响，揭示中药组方抗癌的细胞学和分子生物学相关机制。\n 方法:首先以MTT法探索在(Φ)60mm低粘附培养皿中添加DMEM/F12培养基（含EGF和bFGF）无血清培养食管癌细胞EC9706的条件，同时流式细胞仪鉴定每次传代细胞的p75NTR标记比率，以选定研究对象。然后通过MTT法绘制生长曲线和检测顺铂增殖抑制率、软琼脂集落形成和细胞周期分析等鉴定研究对象的干细胞性状。其次，应用MTT法再筛选中药女贞予、黄连、斑蝥、当归、地骨皮等，选出药效相对稳定的中药进行正交试验设计组方。最后，倒置显微镜下观察各方作用48h细胞形态变化，应用流式细胞仪检测清热化痰活血方及其拆方对食管癌EC9706干细胞鉴定相关指标影响，以阐释各方作用的细胞学机制，再根据各方作用下悬浮培养EC9706细胞周期分布，应用Western blot技术探索各方分子生物学机制。\n 结果:1.食管癌EC9706贴壁细胞0.25％胰酶消化离心洗涤后，以8×104cells/皿接种于(Φ)60mm低粘附培养皿中，添加5mlDMEM/F12培养基，每天补充生长因子EGF20ng、 bFGF10ng，10～14天传代1次。第1～4代无血清培养EC9706细胞存在分群现象，p75NTR标记率逐渐增高，5代后细胞聚团，p75NTR的表达率为4～5％，比较稳定，选为实验对象。研究对象再贴壁生长较贴壁培养细胞缓慢，顺铂耐药性强，软琼脂克隆形成率和p75NTR的表达率分别高于贴壁培养细胞，细胞周期分布集中在G0/G1期，鉴定是食管癌干细胞。2.我们筛选出IC50值稳定的黄连、地骨皮、瓜蒂、椿皮、斑蝥、八月札6味药，组成清热化痰活血方。清热化痰活血方及其拆方改变了无血清培养EC9706细胞形态、集落形成能力和周期分布。其改变细胞周期分布的作用与Bmi1/CyclinB1信号通路相关，以方测证，信号通路CyclinB1等蛋白表达是食管癌热、痰、瘀证现代辨证的组成部分，也是各方作用的靶点。\n 结论:1.无血清细胞培养是富集食管癌EC9706细胞中干细胞样细胞的一种方式，可应用于中药筛选。2.清热化痰活血方及其拆方抑制食管癌EC9706中干细胞增殖，改变了食管癌干细胞的一些性状。3.清热化痰活血方及其拆方对食管癌EC9706细胞中干细胞作用机理与Bmi1/CyclinB1信号通路相关。

关键词： 定量蛋白质组学   中性粒细胞   新生儿   NETs   iTRAQ  

摘要： 目的：新生儿中性粒细胞由于其杀菌机制不成熟导致新生儿高死亡率。新生儿中性粒细胞功能的研究说明新生儿中性粒细胞存在多方面功能不成熟,但是没有一个统一的理论来解释这种功能上的差异。本研究利用定量蛋白质组学技术寻找新生儿和成人中性粒细胞的蛋白质表达差异,从而解释新生儿中性粒细胞功能不成熟的原因。 方法：iTRAQ定量蛋白质组学分析两组临床样本：新生儿脐带血和健康成人静脉血。KEGG分析差异蛋白的功能。Western blot用于认证iTRAQ的蛋白表达结果。 结果：共有1332个蛋白被检测到,其中98%蛋白被定量。当把差异表达蛋白倍数设定为1.24时,127个蛋白在新生儿和成人中性粒细胞中存在差异(P<0.05)。其中103个蛋白表达下调,24个蛋白表达上调,KEGG分别对上调和下调的蛋白进行归类,共有5组被归类,其中4组与免疫相关。这些免疫相关途径包括了蛋白酶体,白细胞跨内皮转移,溶酶体,以及乙醛酸和二羧酸代谢。此外NETs成分在新生儿中性粒细胞中呈现下调表达。 结论：我们的研究提供了一个整体的新生儿中性粒细胞与成人中性粒细胞的蛋白表达差异的全貌,揭示了脐带血中性粒细胞的多种功能缺陷。此外,脐带血新生儿NETs组份的下降有可能是NETs在脐带血中性粒细胞中形成推迟的原因。

关键词： 锁核酸核酶   EB病毒   潜伏膜蛋白1   鼻咽癌   LMP1   锁核酸核酶   脱氧核酶   抑制时效   EBV-LMP1基因   锁核酸核酶   细胞增值   致瘤性   凋亡  

摘要： 鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是我国南方常见的恶性肿瘤，每年新增患者人数居世界首位。目前认为鼻咽癌病因与EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）密切相关。其中EBV编码的潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1,LMP1）是唯一被证明的致瘤基因。针对EBV-LMP1基因靶向治疗成为人们广泛研究的热点。锁核酸核酶(Locked nucleic acid ribozyme， LNAzyme)，是一种在脱氧核酶（Deoxyribozyme，DNAzyme/DZ）基础上引入一个或几个锁核酸（Locked nucleic acid,LNA）单体而形成的特异性切割RNA的新型反义核苷酸。LNA是一种带双环状结构的寡核苷酸衍生物, LNA的引入使LNAzyme较相应的DZ切割效率明显提高，特别是与10～23型DNAzyme结合效率最高。 本研究选用课题组前期筛选的针对鼻咽癌EBV-LMP1的高效10～23型DZ167为基础，经LNA修饰设计合成LANzyme，以EBV-LMP1阳性的B95-8细胞为实验对象，比较DZ167和LNA167对LMP1表达的抑制作用，并观察其对B95-8细胞生物学的影响。初步探索锁核酸 目的：根据前期筛选的脱氧核酶DZ167为基础，设计合成锁核酸核酶LAN167，比较DZ167、LAN167对B95-8细胞靶基因EBV-LMP1的抑制效应。 方法：以B95-8为原型，EBV-LMP1基因为抑制靶点，设计合成脱氧核酶DZ167，对其5'端及3'端前2个结合臂分别进行硫代化修饰或引入2个LNA单体，并设计无催化活性中心的无序DNAzyme对照序列，所有序列5'端用FITC标记。经脂质体转染B95-8细胞，分为硫代修饰DZ167组（S-DZ167）、锁核酸核酶LNA167组、无序DZ167组。同时设立未转染空白对照组。转染后24h，荧光显微镜观察活细胞中荧光的分布情况，流式细胞仪测转染率。转染12h、24h、48h、72h及96h，采用Real-Time PCR评价S-DZ167、LNA167对LMP1稳定性及抑制时效关系。转染后48h采用Western blot方法检测LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1蛋白表达的抑制情况。 结果：转染后24h，荧光显微镜观察各组均有绿色荧光表达，核酶主要分布于细胞浆、细胞膜。无序DZ167组、S-DZ167组、LNA167组转染效率分别为75.5%、76.7%及77.6%。 对LMP1稳定性及抑制时效关系评价结果示：与未转染组相比，LNA167组及S-DZ167组于转染后12h、24h、48h、72h对96h，LMP1均保持一定的抑制效应，抑制率分别为，23.73%，33.93%，44.89%，27.45%，12.24%；45.76%，51.79%，71.43%，54.90%，22.45%。转染12h，LNA167及S-DZ167就表现出对LMP1的抑制作用，以48h最明显，之后逐渐下降；转染72h后，LNA167组与S-DZ167组抑制率相比，差异有显著性（P＜0.05）；转染至96h，仍然表现出对LMP1mRNA一定抑制效应，与未转染组相比，LNA167组差异有显著性（P＜0.05），而S-DZ167组差异无显著性（P＞0.05），两组相比虽然差异无显著性（P＞0.05），但LNA167组对LMP1mRNA抑制程度仍高于S-DZ167组。未转染组与无序DZ167相比差异均无显著性（P＞0.05）。 Western blot检测结果显示：与未转染组比较，无序DZ167组对EBV-LMP1蛋白表达抑制率为5.89%，差异无显著性（P＞0.05）；LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1蛋白抑制率分别为49%、75.02%，LNA167与S-DZ167能不同程度地抑制EBV-LMP1蛋白，但LNA167抑制效应明显高于S-DZ167，差异有显著性（P＜0.05）。 结论：LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1表达的抑制作用呈一定时效关系，48h抑制作用达高峰，以后逐渐下降，但LNA167抑制效应均高于S-DZ167；与S-DZ167相比，经LNA修饰的LNA167能高效抑制EBV-LMP1基因的表达； 目的：探讨锁核酸核酶靶向抑制LMP1后，对细胞毒性、增值活性、致瘤能力、凋亡的影响。 方法：将无序DZ167、S-DZ167及LNA167经脂质体分别转染EBV-LMP1阳性B95-8细胞、EBV-LMP1阴性的鼻咽癌CNE-2细胞，同时设立未转染的B95-8、CNE-2细胞为空白对照。转染24h、48h、72h后，采用CCK8法评价不

关键词： 雌激素相关受体α   下颌髁突软骨细胞   雌激素   去势  

摘要： 颞下颌关节疾病的发生往往与髁突软骨组织异常的代谢状态存在关联，髁突软骨细胞是髁突软骨中最主要的细胞成分。髁突软骨细胞与颞下颌关节适应外周环境刺激进行功能性改建，维持软骨组织基质的完整性等方面均有着密不可分的作用。雌激素对于软骨的早期发育、成熟以及维持软骨组织的正常功能和形态都有着重要作用。机体内雌激素水平的异常变化容易导致髁突软骨细胞增殖和分化状态的改变，继而可能诱发颞下颌关节疾病。 雌激素相关受体α（estrogen-related receptor α, ERRα）属于孤儿核受体的家族成员之一，与雌激素受体（estrogenreceptors, ERs）有着同源性。表面上ERRα不直接以受体配体形式结合雌激素，但却可以通过共激活因子与雌激素受体作用，参与雌激素辅助转导体系进而影响雌激素的信号通路。越来越多的研究证实ERRα能够激活或者抑制涉及不同代谢途径的多种目标基因，在控制动物代谢平衡中起到了至关重要的作用。ERRα是否在髁突软骨组织中存在表达？其表达情况是否会受雌激素不同环境的影响，以及对髁突软骨细胞的代谢调节存在哪些作用？这些问题目前均尚未明确。 研究ERRα在大鼠髁突软骨代谢中的调控作用，有利于更深刻地了解正畸临床矫形治疗过程中髁突适应性改建的生理基础，对认识颞颌关节疾病的发生发展并提供新的治疗策略有着非常重要的意义。 研究目的 （1）研究ERRα在雌性SD大鼠髁突软骨组织与细胞中的表达分布 （2）研究去势雌性SD大鼠体内髁突软骨组织中ERRα以及软骨特异性标志物表达的变化 （3）研究雌激素刺激对体外培养大鼠MCC生物学特性和ERRα表达的影响 （4）探讨ERRα在调控大鼠MCC生物学特性的作用机理 研究方法 （1）利用密度梯度离心和贴壁法相结合分离培养雌性SD大鼠MCC，并采用Ⅱ型胶原抗体染色和阿尔新蓝染色鉴定软骨细胞表型特征。采用免疫组化和免疫荧光染色对髁突软骨细胞和组织中ERRα的表达分布进行观察。 （2）将雌性SD大鼠分为OVX处理组与假手术Sham组，采用Real timeRT-PCR分析OVX后体内髁突软骨组织特异性标志物和ERRα表达的变化。 （3）通过E2(10-8M)对体外培养的雌性SD大鼠MCC进行刺激，采用Real timeRT-PCR和Western Blot分别对MCC生物学特性相关标志物和ERRα表达的变化进行观察。WST-1检测雌激素刺激与化学制剂XCT790抑制ERRα表达后MCC的增殖变化情况。 （4）对MCC采用脂质体瞬时转染和化学制剂XCT790分别过表达和抑制ERRα，通过Real time RT-PCR和WesternBlot分别对髁突软骨特异性标志物的变化进行检测，明确ERRα在髁突软骨调控中的作用机理。 实验结果 （1）细胞Ⅱ型胶原荧光染色和阿尔新蓝染色结果均为阳性，证实提取培养的细胞具有髁突软骨细胞表型。免疫荧光和免疫组化染色显示，ERRα表达于TMJ各层软骨细胞中，MCC的胞核与胞质中均存在ERRα表达。 （2）对大鼠OVX后体内髁突软骨组织进行Real time RT-PCR检测，结果显示：雌性SD大鼠OVX1周后，ERRα、Sox9、GDF-5和Aromatase表达下降，Col2a1没有显著变化；去势4，8，12周后ERRα、Sox9、Aromatase表达升高，GDF-5和Col2a1表达下降。OVX后软骨细胞增殖能力总体呈升高趋势，但细胞成熟的标志物表达下降。 （3） Real time RT-PCR与Western Blot检测显示E2(10-8M)对体外培养MCC的ERRα及MCC增殖、分化、成熟相关标志物的表达均存在促进作用。WST-1检测显示E2(10-8M)可以促进体外培养的MCC增殖，XCT790抑制ERRα表达后可以降低E2(10-8M)促进MCC增殖的效果。 （4） MCC经转染过表达ERRα与XCT790抑制ERRα后，Real time RT-PCR与Western Blot检测均显示：ERRα正向调控Sox9与GDF-5的变化，Aromatase和Col2a1的表达无明显变化。ERRα通过调控Sox9与GDF-5进而影响MCC的增殖与分化。 结论 （1）雌性SD大鼠MCC胞核与胞浆中均存在ERRα表达，并在TMJ软骨各层中均有分布。 （2） OVX后因雌激素缺乏可以引起短期内ERRα的表达下降，而后期总体呈升高趋势，ERRα表达的变化受雌激素直接或者间接作用影响。 （3）生理浓度的雌激素对体外培养的MCC增殖和分化能力均有促进作用，ERRα介导了雌激素促进MCC增殖的作用。雌激素对ERRα存在双向调控作用。

关键词： 急性淋巴细胞白血病   PCI-32765   Bortezomib   Dasatinib   Btk   NFκB  

摘要： 目的：通过观察Btk抑制剂联合NFκB抑制剂及酪氨酸激酶Bcr-abl抑制剂,对B细胞肿瘤包括淋巴瘤细胞(Raji、Ramos)及急性淋巴细胞白血病细胞(Sup-B15、 RS4;11)的生物学的影响,研究Btk对上述细胞增殖、凋亡的影响,并揭示其可能作用机制,以探讨PCI-32765用于Ph+和Ph-ALL靶向治疗的可行性及临床意义。方法：1、利用PCI-32765和Bortezomib处理Raji、Ramos细胞：1.1分别利用CCK-8法及流式细胞术检测其对细胞增殖、凋亡的影响；1.2 Western blot检测PCI-32765和Bortezomib单药及联合用药对凋亡相关蛋白表达水平的影响。2、利用PCI-32765和Bortezomib处理RS4;11、Sup-B15细胞：2.1分别检测其对细胞增殖、凋亡的影响；2.2 RT-PCR检测PCI-32765和Bortezomib单药及联合用药后Btk、NFκB在RNA水平表达情况；2.3Western blot检测PCI-32765和Bortezomib单药及联合用药对NFκB活性及相关凋亡蛋白表达的影响。3、利用PCI-32765和Dasatinib处理RS4;11、Sup-B15细胞：3.1检测PCI-32765、Dasatinib单药及联合用药对细胞生长、增殖的影响；3.2刘氏染色观察PCI-32765、Dasatinib单药及联合用药对细胞形态的影响；3.3 Western blot检测PCI-32765和Dasatinib单药及联合用药对Btk上下游信号分子表达及活性的影响。结果：1、PCI-32765和Bortezomib对Rajk Ramos细胞作用及其机制：1.1不同浓度Bortezomib(10nmol/L、20 nmol/L、30 nmol/L、40 nmol/L、50 nmol/L、60 nmol/L、 80nmol/L)和PCI-32765(0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L、4.0μmol/L、 5.0μmol/L、6.0μmol/L)处理Raji和Ramos细胞,均可抑制细胞存活率,抑制作用呈时间和剂量依赖性,且两药具有协同作用。1.2 Bortezomib和PCI-32765单药及联合用药处理Raji和Ramos细胞48小时后。1.2.1单药组与对照组,联合用药组与单药用药组及对照组比较,细胞的凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1.2.2单药组细胞Btk、NFκB、c-IAP1、BCL-XL的表达水平较空白对照组降低,Caspase-3的表达水平升高,两药联用后,作用增强。2、PCI-32765和Bortezomib对RS4;11、Sup-B15细胞作用及其机制：2.1不同浓度Bortezomib (2.5nmol/L、5.0 nmol/L、7.5 nmol/L、10.0 nmol/L、12.5 nmol/L 15.0nmol/L、17.5 nmol/L、20.0 nmol/L)和PCI-32765 (0.5μmol/L、1.0μmol/L、 2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L、8.0μmol/L、10.0μmol/L)作用细胞48小时,均可抑制细胞活性,呈剂量依赖性,且两药具有协同作用。2.2Bortezomib(10nmol/L)和PCI-32765(3μmol/L、8μmol/L)单药及联合用药处理RS4；11和Sup-B15细胞48小时后。2.2.1对于RS4；11细胞,空白对照组、Bortezomib和PCI-32765单药组、两药联用组细胞凋亡率分别为(5.21±2.18)%、(40.97±4.09)%、(37.21±6.98)%、(78.30±3.39)%,单药组与对照组,两药联用组与单药组及对照组比较,细胞的凋亡率明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)2.2.2对于Sup-B15细胞,空白对照组、Bortezomib和PCI-32765单药组、两药联用组细胞凋亡率分别为(9.37±1.08)%、(41.03±5.29)%、(32.14±6.18)%、(73.09±4.32)%,单药组与对照组,两药联用组与单药组及对照组比较,细胞的凋亡率明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。2.3Bortezomib和PCI-32765单药及联合用药对RS4;11、Sup-B15细胞Btk、NFκB mRNA表达的影响。2.3.1对于RS4；11细胞,加药组Btk、NFκB mRNA表达水平较空白对照组下降,差异有统计学意义,且两药联用组表达水平下调幅度明显大于单药组。2.3.2对于Sup-B15细胞,加药组Btk、NFκB mRNA表达水平较空

关键词： 中枢神经   神经损伤   药物干预   细胞生物学  

摘要： 目的：对谷氨酸损伤后乳鼠皮层脑片的神经细胞用不同浓度神经生长因子（NGF）后处理的作用。　　方法：采用新生7日龄SD大鼠皮层脑片的谷氨酸损伤模型，又分别分为对照组、损伤组、10μmol/L GN F，50μmol/L GNF及100μmol/L GNF后处理组，所以共分5组，每组12例。损伤组和后处理组脑片培养第六天用谷氨酸的培养基孵育30min;然后给予含10μmol/L GNF，50μmol/L GNF及100μmol/L GNF1mmol/L的培养基孵育24H;正常组用原培养基培养;对谷氨酸损伤后再培养24h的脑片采用2,3,5－三苯基四氮唑(TTC)染色后测定其A490nm时的OD值以计算组织损伤率;分析脑片活性用乳酸脱氢酶（LDH）释放率OD值表示;用流式细胞术检测脑片中神经细胞凋亡程度;用透射电镜观察细胞超微结构是否改变;用蛋白印迹法方法检测不同组别Caspase-3蛋白表达变化。　　结果：⑴不同浓度神经生长因子后处理组与谷氨酸损伤组相比较：损伤组皮层脑片TTC染色A490OD值均降低，LDH释放率的OD值均增加，流式细胞术显示损伤组细胞数均降低，细胞形态受损程度和神经元超微结构病变均加重;⑵不同药物浓度后处理保护组之间比较：发现明显差异，Caspase-3蛋白含量随之变化(P<0.01)，其中100μmol/L GNF保护作用强。　　结论：药物后处理可使谷氨酸损伤后的新生大鼠皮层脑片的神经元细胞损伤程度减轻，凋亡细胞的数量减少，且不同药物浓度的后处理之间有统计学意义的差别。

关键词： 过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα)   表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)   电离辐射   血红素加氧酶-1(HO-1)   YingYang1   (YY1)   食管鳞癌   放射敏感性   HO-1  

摘要： 第一部分：PPARα对EGCG和电离辐射敏感性的影响及机制研究 目的研究PPARα活化对表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG)和电离辐射敏感性的影响及其机制。方法首先利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率;分别采用Western Blotting和real-time PCR检测蛋白质和mRNA表达水平;采用PPARα的特异性激动剂和特异性拮抗剂来改变PPARα的表达;应用荧光素酶报告基因系统及染色质免疫共沉淀研究PPARα对血红素加氧酶-1(HO-1)的调控。采用克隆形成实验检测PPARα活化对肿瘤细胞放射敏感性的影响;采用表达谱芯片检测PPARα活化增加肿瘤细胞放射敏感性的机制。结果随着EGCG浓度的增加，PANC1细胞和A2780细胞的存活率逐渐下降。当EGCG处理肿瘤细胞后，PPARα蛋白水平会随着EGCG剂量的提高而增加。PPARα的特异性激动剂—氯贝特能增加胰腺癌PANC1和卵巢癌A2780细胞对EGCG的敏感性，其机制是氯贝特能够抑制细胞保护性HO-1的诱导。荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验(CHIP)表明，活化的PPARα能结合到启动子上的PPAR结合元件(PPARE)上并抑制HO-1的表达。结论本研究表明EGCG能诱导肿瘤细胞中PPARα的表达，PPARα活化能够在转录水平上抑制HO-1的表达，从而增加肿瘤细胞对EGCG敏感性。PPARα的特异性激动剂氯贝特联合电离辐射可显著增加胰腺癌细胞的放射敏感性。表达谱芯片表明氯贝特主要通过影响多个受体介导的信号通路。C18orf4、CDH5等相关基因参与了这一过程。PPARα的特异性激动剂氯贝特联合EGCG或电离辐射为临床肿瘤治疗提供了一个新方案。 第二部分：Ying Yang1在食管癌中的表达及功能研究 目的研究YY1在正常食管组织和食管鳞癌组织中的表达及其在食管鳞癌发展过程中的作用。方法(1)采用实时定量PCR，检测24例正常食管组织样本和60例食管鳞癌组织标本中YY1的mRNA的表达水平;通过免疫组化，检测102例食管鳞癌组织、52例食管癌旁组织和15例正常食管组织中YY1的蛋白水平。(2)构建YY1基因过表达载体和基因沉默载体，将两种载体转染人食管鳞癌TE-1细胞株，挑选稳定株，通过实时定量PCR技术检测YY1mRNA表达情况;通过Western Blot检测YY1蛋白表达情况;对于转染YY1过表达载体或基因沉默质粒的TE-1细胞株，采用MTT法测定细胞的生长，细胞照射后，采用显微镜进行克隆形成率的分析以及对辐射敏感性的影响。(3)采用Western Blot、荧光素酶报告基因检测YY1对HO-1的调控作用;通过免疫组化检测YY1与HO-1的相关性;通过转染和感染重组腺病毒，检测HO-1对食管癌细胞的影响。结果与正常的食管组织相比，人ESCC组织中的YY1mRNA表达水平和蛋白水平显著升高。设计构建了过表达载体pcDNA.3.1-YY1和基因沉默载体YY1-siRNA与阴性对照siRNA-NC，YY1过表达载体能增强YY1转录和翻译，siRNA载体能减弱YYI基因转录表达。稳定转染YY1过表达载体的TE-1细胞中的YY1基因转录和蛋白表达显著增强，稳定转染siRNA载体的细胞中YY1转录和翻译水平显著降低。YY1过表达载体转染细胞后，抑制TE-1细胞的生长和克隆团的形成，但增加了其辐射抗性。YY1过表达，ESCC组织或细胞中的HO-1表达水平上调，YY1表达水平下降则HO-1减少。与对照组Ad-EGFP相比，转导Ad-HO-1，细胞生长并没有明显的改变，但是可以降低克隆团的大小。结论YY1在食管鳞癌组织中的表达水平明显高于正常组织，YY1通过调控HO-1抑制食管癌细胞生长增殖。

关键词： 神经缺损   神经再生   人工合成管   细胞生物学  

摘要： 目的：观察人工合成管促进大鼠轴突跨神经缺损间隔再生的作用。　　方法：实验分为对照组（NCG）、空管组（NBG）、给药组（TDG）和辅桥组（TBG）。切除大鼠左侧腓总神经（PN）0.5cm，NCG作PN两断端显微缝合，其余各组动物用各自的人工合成管于显微镜下连接PN两端，根据人工合成管不同，命名为NBG、TDG和TBG。观察大鼠术前及术后1d、10d、20d以及30d的步态和趾展宽度（TS）的变化，并计算趾展指数（TSI）;术后30d，于手术部或人工合成管远心端的PN鞘膜处显微注射Alexa fluro4885μl。次日麻醉动物以4％多聚甲醛心脏灌流固定动物组织，剖取脊髓（SC）、左右两侧PN及胫前肌（TA），观察SC中的荧光强度、PN及TA的组织学改变。　　结果：术后各组动物足迹均明显变形，TS变窄，术后1d至10d各组TSI均不同程度升高，组间比较无明显差异（P>0.05）。NBG术后1d至30d，TSI持续增高，其余3组术后20d至30d TSI均不同程度下降。术后20d和30dNBG与其余各组比较差异显著（P<0.05，P<0.01）;除NBG外，其余各组动物SC中均观察到绿色荧光。组织学检查显示：NCG神经基本正常，TA轻度萎缩;NBG无轴突跨神经缺损间隔再生，TA中度萎缩;TDG、TBG则分别可见不同程度的轴突跨神经缺损间隔再生，TA轻度萎缩;NBG神经纤维直径和平均灰度值明显低于其余各组，其神经组织平均光密度明显高于其余各组，差异显著（P<0.01）。　　结论：人工合成管能促进大鼠轴突跨神经缺损间隔再生。

关键词： 培养基地   细胞生物学   教研室  

摘要： 北京师范大学细胞生物学研究所是在已故著名细胞生物学家王堃仁院士领导的细胞教研室基础上发展起来的,历经20多年的建设和发展,成为我国细胞生物学领域拥有一定影响力的国家级科技创新与高层次人才培养基地之一。