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关键词： 胶质瘤   U251细胞   生物学活性   电压-门控钠离子通道   SCN5A基因  

摘要： 研究背景　　胶质瘤是中枢神经系统中最常见的、预后最差的原发性肿瘤之一。流行病学调查显示，胶质瘤约占颅内原发性肿瘤的40％～60％，且近年来有上升的趋势[1,2]。尽管现代医学在显微外科手术治疗、放射治疗、化学治疗和生物治疗等方面取得了突飞猛进的发展，但是对胶质瘤而言，尤其是胶质母细胞瘤，目前尚缺乏有效的治疗方法。该类患者的手术预后较差，肿瘤易复发、转移以及平均生存期较短等方面主要与肿瘤细胞异常增殖活跃且呈浸润性生长等生物学特性有关[3-5]。目前，恶性肿瘤的增殖复发和侵袭转移成为患者预后差的关键，对人类的健康构成了极大的威胁。　　目前恶性胶质瘤的发生机制尚不清楚，可能涉及多个基因的突变[3，5-7]。研究发现，胶质细胞的膜性结构上广泛的分布着各种类型的离子通道，并在胶质细胞的生长和代谢等多种生理活动中发挥着重要的作用[8]。深入研究提示，离子通道与胶质瘤的发生、发展密切相关，因为离子通道蛋白不仅参与胶质瘤细胞的细胞周期调控和细胞凋亡等过程，而且还参与胶质瘤细胞的增殖及迁移等生物学活动，并在其中扮演着重要的角色[7-14]。已有实验证明，氯离子通道在恶性胶质瘤细胞增殖及浸润性生长中起着重要的作用，且其特异性阻滞剂氯毒素(chlorotoxin)抗肿瘤作用已进入Ⅱ期临床试验[11]，所以探讨离子通道蛋白与胶质瘤发生、发展的关系已成为本领域研究的热点[3,6]。　　电压-门控钠离子通道(voltage-gatedsodiumchannels，VGSCs)是细胞各种生理活动的最基本离子通道。目前，已知VGSCs的α亚单位有9种，即Nav1.1～Nav1.9[3，15-18]，分别由基因SCN1A～SCN5A，SCN8A～SCN11A所编码[19]。其中，由SCN5A基因编码的Nav1.5是VGSCs的9个α亚单位之一[7,18，20-22]，以前被认为是心肌的特异性离子通道，在心肌细胞动作电位产生和传导过程中起着关键作用，但研究发现该种类型Na+通道除在心肌中有极高的分布外，在中枢神经系统中亦分布广泛[16-18]。本课题组首次全序列克隆和检测了Nav1.5在人脑组织及人脑神经母细胞瘤细胞株(NB-1)的基因序列和电生理学特点，发现这种类型的Na+通道的基因序列和电生理学特点均不同于其在心肌中类型的特点，验证它是Nav1.5/SCN5A基因编码产生的一种新的幼稚型变构体，即nNav1.5[7,17-18,22](neonatalNav1.5)。在动物实验中发现，SCN5A/nNav1.5在鼠中枢神经系统各部位的表达随神经元的发育成熟或年龄的增加而逐渐下降，且在成年鼠的非脑组织中不表达[7,16-18,22]（骨骼肌组织中仅有极低的表达[23]），这也提示SCN5A/nNav1.5这种新变构体属于胚胎性基因。胚胎性基因的再表达被认为是肿瘤产生的一种机制[3,6,23]，并且国外已有研究报道，SCN5A/nNav1.5在人乳腺癌组织及其高转移性细胞系中高表达，且对其调控可显著影响乳腺癌细胞的侵袭性[23]。推测这种SCN5A/Nav1.5的新变构体是一种新型癌基因，其在恶性肿瘤增殖及侵袭性生长等方面可能扮演者重要的角色，有望成为恶性肿瘤的一个新标记物和新治疗靶点。但是，VGSCs蛋白影响恶性肿瘤细胞增殖及侵袭性等生物学特性的具体机制目前尚不清楚。目前，国内外关于VGSCs亚型SCN5A/nNav1.5在不同级别胶质瘤中的表达情况及其与胶质瘤细胞增殖、侵袭转移和凋亡的生物学关系尚未见报道。　　目的　　1、通过检测SCN5A/nNav1.5在人脑不同级别胶质瘤中的表达情况，探讨其与胶质瘤恶性程度的关系。　　2、通过siRNA下调SCN5A/nNav1.5在胶质瘤U251细胞中的表达后，检测胶质瘤U251细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的变化，探讨SCN5A/nNav1.5在胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡等细胞生物学活性中的作用。　　3、观察表皮生长因子(EGF)是否通过上调SCN5A/nNav1.5在胶质瘤U251细胞中的表达水平，增加胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的生物学活性。　　方法　　1、首先用免疫荧光技术检测SCN5A/nNav1.5的蛋白在胶质瘤U251细胞株中的表达定位;收集2011年至2012年在中国医科大学附属第一医院神经外科手术切除并经病理诊断证实的72例人脑胶质瘤标本及12例瘤周组织作为对照组织。按2007年WHO胶质瘤分级，将胶质瘤组织标本分为低级别胶质瘤组(WHOⅠ～Ⅱ级)和高级别胶质瘤组（WHOⅢ～Ⅳ级），用Real-TimeRT-PCR技术、免疫组织化学方法和Westernbolt法分别检测SCN5A/nNav1.5的mRNA和蛋白在不同级别胶质瘤组织及对照组织中的表达情况。　　2、设计并合成SCN5A/nNav1.5靶向小干

关键词： 生理妊娠   羊水代谢   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：通过研究水通道蛋1(aquaporin1，AQP1)在人正常妊娠不同孕期胎盘和胎膜组织中的分布模式和表达规律，对AQP1在羊水代谢中的动态调节机制进行初步探讨。　　方法：分别采集孕早期（妊娠10-12周）、中期（妊娠18-26周）、晚期（妊娠32-40周）各15例的胎盘、胎膜组织，其中胎膜分别取羊膜、绒毛膜。应用免疫组化技术和荧光定量PCR检测胎盘、胎膜（羊膜、绒毛膜）组织中AQP1的蛋白和AQP1mRNA的分步和表达。　　结果：孕早、中、晚期的胎盘及胎膜组织中均有AQP1表达，且表达部位相同，分别位于羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞及胎盘血管内皮细胞中。在羊膜、绒毛膜组织中，孕早期，AQP1mRNA显示出高表达水平，孕11周后表达水平逐渐降低;孕中期，孕21周出现第二个表达高峰，孕21周后表达水平逐渐降低;孕晚期，AQP1mRNA表达水平较低。整个孕期中孕11周、孕21周AQP1mRNA表达水平较高(P＜0.0001)，差异具有统计学意义。在胎盘组织中，孕早期，AQP1mRNA显示出高表达水平，孕11周后表达水平逐渐降低;孕中期，孕26周出现第二个表达高峰;孕晚期，AQP1mRNA表达水平较低。整个孕期中孕11周、孕26周AQP1蛋白表达水平较高(P＜0.0001)，差异具有统计学意义。　　结论：在人不同孕期胎盘胎膜中检测到AQP1的表达。AQP1在羊膜、绒毛膜中的表达贯穿于整个孕期，两者的时间表达模式一致，均于孕11周、孕21周出现表达高峰，提示着羊膜、绒毛膜有相似的水的通透性，可能在羊水的膜内吸收、调节羊水的动态平衡过程有关，其表达模式与羊水量的多少呈负相关。AQP1在胎盘中的表达贯穿于整个孕期，于孕11周、孕26周出现表达高峰，提AQP1在胎盘的血管生成过程中起重要作用，与胎盘血管生长呈正相关。检测AQP1的表达，可为阐明羊水循环及分子学机制提供可靠的理论依据，为探讨羊水异常机制及治疗奠定基础，对改善围产结局具有重要意义。

关键词： 骨髓来源间充质干细胞   脂肪来源间充质干细胞   退变髓核细胞   同源干细胞   骨髓间充质干细胞   脂肪间充质干细胞   髓核细胞   非接触式共培养   类髓核细胞   椎间盘退变  

摘要： 研究目的：来源于骨髓的骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）和来源于脂肪的脂肪间充质干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs），是目前较为公认的干细胞，也是研究较多的干细胞，此类干细胞具有自我更新、多向分化及可被诱导成其他细胞的能力。而椎间盘退变主要表现为细胞外基质的降解，髓核细胞数量的减少和功能下降。本研究拟在脊柱手术的同时，从椎弓根内抽取骨髓组织，从皮下获取脂肪组织，从退变椎间盘内获取髓核组织，并在体外无菌条件下分离培养出骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和退变髓核细胞。观察细胞的生长状态，摸索细胞的扩增时间，对细胞进行计数，并绘制细胞生长曲线。为下一步细胞之间共培养奠定基础。 研究方法：在实行脊柱手术的同时获取骨髓组织、脂肪组织及髓核组织，眼科剪剪碎后分别用Ⅱ型胶原酶与Ⅰ型胶原酶消化髓核组织和脂肪组织，获取退变髓核细胞和脂肪间充质干细胞。利用密度梯度离心法分离提取骨髓间充质干细胞，将提取的上述三种细胞加入含有胎牛血清DMEM/F12完全培养基中进行培养。观察细胞的生长形态，测定不同细胞的增殖时间，并对细胞进行计数及绘制细胞生长曲线。 结果：骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在原代接种后，24h开始贴壁生长，细胞形态由圆形变成长梭形、多角形，1周左右形成集落。2周后细胞在80%90%左右达到融合，即可传代。传至第2代，细胞为长梭形，呈漩涡状，形态均匀。获取的髓核细胞接种后4～5天可贴壁生长，细胞形态呈现长梭形，10天细胞融合至80%左右即可传代。 结论：从脂肪组织和骨髓组织中提取间充质干细胞，细胞呈长梭形，漩涡状生长，扩增能力强。从髓核组织中分离培养的退变髓核细胞贴壁生长，呈长梭形、多角状。骨髓间充质干细胞增殖能力强，获取容易，应用广泛；而脂肪间充质干细胞同样具有良好的扩增能力，储存量大、获取创伤更小，两者均可用于与同源退变髓核细胞进行非接触式共培养，观察共培养后细胞之间的生物学效应。 研究背景和目的：椎间盘退行性改变目前是引起成人下腰痛、颈肩痛及坐骨神经痛的主要原因。一方面，随着现代社会人均寿命逐渐延长，而脊柱相关退变性疾病的发病率呈逐年上升趋势。另一方面，年轻人是社会的主力军，由于工作压力大，生活节奏快，又使得脊柱退行性疾病呈现出年轻化的趋势。然而，目前对于椎间盘退变性疾病临床治疗的远期效果尚不理想。一种创新性的治疗思路逐渐被人们所接收，即修复而并非简单切除退变的椎间盘。应用干细胞移植技术来修复退变的椎间盘逐渐成为脊柱外科领域非手术治疗的发展方向，很可能推动椎间盘退变相关疾病的生物学治疗。尽管多种干细胞在基础研究中表现出修复椎间盘退变的良好前景，但目前尚缺乏完善的对比实验研究，仍然不能确认究竟哪种干细胞适宜作为椎间盘修复的最佳种子细胞来源。本实验拟在对脊柱退行性疾病患者实施外科手术的同时，获取骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）与退变髓核细胞（nucleus pulposus cells,NPCs），将两种干细胞与同源的人退变髓核细胞进行非接触式共培养，探讨两种来源间充质干细胞哪种更适宜于椎间盘退行性疾病的生物学治疗？ 方法：在医院伦理委员会的监督及充分尊重患者知情同意权利的前提下，在对脊柱退行性疾病患者实施外科手术的同时，采集人骨髓、脂肪与髓核组织，体外分离、培养同源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脂肪干细胞（ADSCs）与退变髓核细胞（nucleus pulposus cells, NPCs），取生长状态良好的第三代骨髓间充质干细与脂肪间充质干细胞分别和同源同代次的人退变髓核细胞在Tanswell六孔板中进行非接触式共培养（共培养细胞的比例为50:50），Transwell六孔板的插入层底部是直径为0.4μm的半透膜；其中骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞接种于六孔板的底层，髓核细胞接种于六孔板的Transwell半透膜底部。与ADSCs共培养的NPCs为A组，与BMSCs共培养的NPCs为B组，以单独培养的NPCs作为对照组。共培养1周以后，分离出非接触式共培养的髓核细胞，并提取其总的RNA，反转录以后获得cDNA，利用RT-PCR（Real-Time PCR）方法检测髓核细胞中的Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9等基因表达，管家基因GAPDH作为内参，利用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达变化并进行对比研究。 结果：非接触式共培养7天后，与对照组相比，A、B组髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达显著增加（P<0.05）；其中A组Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量分别是3.49±0.55、3.88±2.11和2.41±0.91，B组Ⅱ型胶原、蛋白多糖和S

关键词： 实验   细胞生物学  

ISBN: (纸本)9787030412362

摘要： 本书分为三章，第一章编写了22个基本型实验，涉及细胞的形态、结构观察及组成显示等；第二章为21个综合型实验，包括细胞的分离与分选、细胞培养、细胞增殖等；第三章为12个开放探索型实验，涉及细胞凋亡及胀亡的诱导及检测、细胞衰老的诱导与检测等。

关键词： MULTIPLE sclerosis -- Treatment   ASTROCYTES   INTRACELLULAR calcium   OLIGODENDROGLIA  

摘要： The author discusses a study by M. Stenovec and colleagues which shows that multiple sclerosis drug FTY720, a mimetic of sphingosine, inhibits astroglial secretion by increasing intracellular calcium concentration. He reports several studies which suggest that FTY720 accumulates in brain due to its lipophilic nature and affect vesicle mobility in astrocytes. Further he mentions that studies are required to show how FTY720 affect astrocyte interactions myelinating oligodendrocytes.

关键词： 皮肤缺损   细胞修复   胶原纤维   细胞生物学  

摘要： 目的： 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的生物相容性主要决定于其脱细胞效果。本实验对两种猪膀胱ECM制备方法的脱细胞效果进行比较，并检测脱细胞后ECM纤维类型;通过使用猪膀胱ECM消化降解产物在体外培养大鼠脾细胞，使用MTT法评价其对脾细胞的相对增殖率;通过建立大鼠背部皮肤缺损模型，在缺损区滴加ECM消化降解产物，观察周边皮肤修补缺损的情况及毛囊再生情况。　　方法：⑴分别采用酸性溶液法和细胞表面清洁剂法对新鲜猪膀胱组织进行脱细胞处理。HE和Masson染色后在显微镜下观察脱细胞效果。纤维四重染色法观察ECM纤维类型。⑵使用MTT方法检测猪膀胱ECM消化降解产物对脾细胞的相对增殖率，观察时长为8天。⑶建立大鼠背部皮肤缺损实验模型，在缺损区域每日滴加细胞表面清洁剂处理组ECM消化降解产物100μl，连续滴加1周，4周后处死，取缺损部位皮肤做HE染色观察周边皮肤修补缺损的情况及毛囊再生情况。　　结果：①细胞表面清洁剂处理组制备的猪膀胱ECM脱细胞更为彻底。酸性溶液处理组制备的猪膀胱ECM仍有细胞和肌纤维残留。纤维四重染色观察两种方法处理后的猪膀胱ECM主要成分均为胶原纤维。②MTT法检测脾细胞相对增殖率显示，两个处理组无明显差别。③HE染色显示，滴加细胞表面清洁剂处理组猪膀胱ECM消化降解产物的大鼠毛囊基底细胞数量比对照组有明显增多，双尾t检验结果为t=4.821，P=0.001＜0.05，可以认为两组毛囊基底细胞计数结果的差别有统计学意义。　　结论：⑴脱细胞效果方面细胞表面清洁剂法优于酸性溶液法。⑵两处理组制备的猪膀胱ECM消化降解产物在促进细胞增殖方面没有明显差别。⑶细胞表面清洁剂组制备的猪膀胱ECM降解产物对大鼠毛囊基底细胞数量有明显诱导增多的趋势，表明该降解产物可能会对皮肤再生有一定的效果，具体机制需要后续研究进一步探讨。

关键词： 原发性肝细胞癌   Rock2   DNA损伤   磷酸化   UV  

摘要： 目的： 通过鉴定Rock2磷酸化位点来研究其对肝癌细胞生物学活性的影响，并明确Rock2在肝癌发生发展过程中的作用。 方法： 1.通过磷酸化位点预测软件以及生物信息学分析Rock2结构，并设计可能发生磷酸化位点的磷酸化多肽。 2.分别对HepG2细胞和MHCC97H细胞进行UV照射，通过Western Blot分析Rock2可能发生磷酸化的位点。 3.应用平板克隆形成实验和细胞凋亡实验，观察UV辐射诱导DNA损伤时，Rock2磷酸化位点对肝癌细胞生物学活性的影响。 结果： 1. Rock2可能发生磷酸化的位点有：(1) S442;(2) S771;(3) T814。 2. UV照射后，Rock2的T814位点发生磷酸化。 3. UV照射后，MT-Rock2组的克隆形成率比WT-Rock2组低。 4. UV照射后，MT-Rock2组的细胞凋亡率比WT-Rock2组高。 结论： 1. UV辐射诱导DNA损伤时，Rock2的T814位点发生磷酸化。 2. Rock2的T814位点磷酸化对UV造成的DNA损伤具有修复作用。

关键词： 肿瘤相关成纤维细胞   上皮-间质转化   肿瘤干细胞   趋化因子   信号转导通路  

摘要： [研究背景及目的] 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的消化系统肿瘤之一。尽管近30年来HCC的诊断与治疗已取得了较大进展,但是其预后并未得到根本改善。因此,深入研究HCC发生、发展及其耐药机制,寻找有效的治疗靶点是研究人员亟需攻克的难题。 随着肿瘤研究不断深入,研究人员发现肿瘤细胞并不是“孤军奋战”,他们可以招募周围间质细胞形成一个新的整体,我们称之为肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、细胞外基质(extracellular matrix, ECM).多种间质细胞及其分泌的蛋白组成。间质中的细胞成分主要分为三类：血管相关细胞(angiogenic cells)、免疫细胞(immune cells)及肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts,TAFs)。越来越多的研究表明TAFs参与维持肿瘤的标志性特征,如增殖信号的持续活化、抵抗细胞死亡、维持细胞持续复制、诱导血管生成、促进增殖及转移、改变能量代谢等。同时,TAFs增加肿瘤细胞对化疗药物的抵抗能力。因此,靶向TAFs阻断其对肿瘤的“支持”作用是肿瘤治疗的新策略。 基于以上研究背景,本研究主要探索TAFs对HCC发生、发展的作用。我们将从三个方面展开研究。首先,在人HCC组织中分离并纯化TAFs及癌旁成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs),利用细胞免疫化学及Real-time PCR检测TAFs与PTFs相关标记物的表达,研究二者生物学特性差异；在此基础上建立TAFs与肝肿瘤细胞株体外共培养系统,观察TAF对肝肿瘤细胞株增殖、侵袭、转移、成球、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)、皮下成瘤与转移等生物学效应的影响；进一步研究TAFs促进肿瘤恶性转化的机制,芯片检测并筛选TAFs与PTFs分泌差异的趋化因子,探讨趋化因子对TAFs与肝肿瘤细胞Cross-talk的作用并寻找相关信号转导通路。为HCC的临床治疗提供新的思路和方法。 [实验方法] 一、肝癌相关成纤维细胞的分离与鉴定 1.分离并纯化TAFs与PTFs 将人HCC组织与癌旁组织剪碎,胶原酶Ⅳ消化完全后梯度离心得到TAFs与PTFs,利用Anti-fibroblast磁珠纯化原代分离的成纤维细胞。 2.鉴定TAFs与PTFs 细胞免疫化学与Real-Time PCR检测TAFs与PTFs细胞α-SMA、Vimentin、FSP-1及EMT相关指标表达。 3. TAFs与PTFs生物学特性的差异 将不同TAFs与PTFs以3×103/孔的数量接种于96孔板中,每组设3个复孔,CCK-8每天检测TAFs与PTFs的增殖情况；将TAFs与PTFs消化并重悬于无血清DMEM中,以4×104/孔的数量接种于上层迁移小室,24小时后检测TAFs与PTFs的迁移情况。 二、TAFs与PTFs对肝肿瘤细胞生物学特性的影响 1.建立TAFs、PTFs与肝肿瘤细胞的共培养系统 将’TAFs与PTFs置于0.4μm共培养小室中与下层肿瘤细胞共培养或收集 TAFs与PTFs培养液上清(条件培养基Conditional medium,CM)直接培养肝肿瘤细胞。 2. TAFs对肝肿瘤细胞株增殖、侵袭及迁移能力的影响 建立TAFs与PTFs与肝肿瘤细胞的共培养系统,CCK-8检测TAFs与PTFs或其条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)对不同肝肿瘤细胞株增殖能力的影响；将TAFs与PTFs (1×104)接种于24孔板底层,肝肿瘤细胞株LM3置于上层侵袭小室中,24小时后利用结晶紫对侵袭细胞进行染色,显微镜观察并拍照；将TAFs与PTFs细胞或条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)置于24孔板底层,肝肿瘤细胞株接种于上层迁移小室中,24小时后利用结晶紫对迁移细胞进行染色,显微镜观察并拍照。 3. TAFs对肝肿瘤细胞株上皮-间质转化的作用 将2×105的Huh7细胞接种于35mm培养皿中,待其贴壁后更换培液为TAFs与PTFs条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),Real-time PCR及细胞免疫荧光法检测EMT相关指标的表达。 4. TAFs对肝肿瘤细胞株“干性”的影响 TAFs与PTFs条件培养基处理(干细胞专用培养液培养成纤维细胞24小时)Huh7细胞48小时,Real-time PCR检测肿瘤干细胞(Cancer stem cel

关键词： IL-17   SGC7901   Akt   NF-κB   胃癌  

摘要： 目的： 采用重组人IL-17作用于IL-17R阳性胃癌细胞，检测外源性IL-17对胃癌细胞生物学特性的影响，探讨IL-17在胃癌进展中的作用及其机制。 方法： 1采用RT-PCR法检测胃癌细胞株SGC7901、MKN-28和BGC-823细胞中IL-17R的表达。 2采用MTT法，检测不同浓度外源性IL-17（5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）作用不同时间（24h、48h、72h）对SGC7901细胞的增殖活性的影响。 3采用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验，分别检测IL-17对SGC7901细胞迁移能力和侵袭能力的影响。 4采用ELISA法，检测50ng/ml IL-17作用SGC7901细胞后，培养上清中IL-6、IL-8和TNF-α的含量。 5采用Western blot技术，从蛋白水平检测外源性IL-17对SGC7901细胞信号通路蛋白Akt和NF-κB表达水平的影响。 结果： 1RT-PCR实验结果显示，三种胃癌细胞株SGC7901、MKN-28和BGC-823细胞均表达IL-17R，并且，SGC7901细胞表达IL-17R的水平明显高于MKN-28和BGC-823细胞（P<0.05）。 2MTT实验结果显示，不同浓度外源性IL-17作用于SGC7901细胞24h、48h、72h后，细胞相对增殖率无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。 3细胞划痕实验结果显示，50ng/ml IL-17作用于SGC7901细胞24h后，与对照组相比，实验组细胞向划痕中间迁移的距离明显增大，差异有统计学意义（P<0.01）；Transwell侵袭实验结果显示，50ng/ml IL-17作用于SGC7901细胞48h后，与对照组相比，实验组穿膜细胞数明显增多（P<0.01）。 4ELISA实验结果显示，50ng/ml IL-17作用SGC7901细胞48h后：细胞培养上清中IL-6和IL-8的分泌水平（分别为160.5725±37.95；70.1413±16.65）显著高于对照组（分别为106.7082±66.74；62.8905±18.39）（P<0.05）；而TNF-α的分泌水平两组间无显著差异（分别为39.4688±25.28；48.4688±24.36）（P>0.05）。 5Western blot实验结果显示，50ng/ml IL-17作用SGC7901细胞48h后，细胞内Akt和NF-κB蛋白表达水平（分别为0.52±0.13；0.55±0.10）均显著高于对照组（分别为0.33±0.11；0.32±0.07）（P<0.05）。 结论： 1外源性IL-17作用SGC7901细胞后，对细胞的生长增殖活性无显著影响，但可明显促进其迁移和侵袭。 2外源性IL-17作用SGC7901细胞后，培养上清中IL-8和IL-6含量明显增高，且与其相关的信号通路蛋白Akt和NF-κB表达明显增高，提示IL-17可能通过调节PI3K-Akt信号通路上调IL-8和IL-6的分泌，改变肿瘤炎性微环境促进肿瘤进展。

关键词： MG-63细胞   RNA干扰   侵袭迁移   凋亡   自噬  

摘要： 目的：通过构建小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)降低MG-63骨肉瘤细胞环氧合酶-2(COX-2)基因的表达,并进一步研究其对MG-63骨肉瘤细胞增值、侵袭迁移能力、细胞凋亡和自噬能力的影响及分子机制。 方法：设计靶向干扰COX-2基因的siRNA,通过脂质体转染MG-63骨肉瘤细胞,使其抑制MG-63骨肉瘤细胞COX-2基因的表达,后采用噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell小室实验研究其对MG-63骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响,采用流式细胞仪(FCM)检测其对细胞凋亡的影响,采用实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR, RFQ-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别从基因和蛋白的水平检测MG-63骨肉瘤细胞侵袭性相关因子基质金属酶(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞凋亡及自噬相关因子Bcl-2、LC3、 Beclin1的表达。 结果：转染MG-63骨肉瘤细胞后,实验组与阴性对照组和空白对照组比较,通过RFQ-PCR和Western blot检测COX-2基因表达降低约90%(P<0.05),MTT检测MG-63骨肉瘤细胞增值能力明显受到抑制(P<0.05),Transwell实验检测MG-63骨肉瘤细胞侵袭、迁移能力明显下降(P<0.05),经RFQ-PCR、Western blot检测侵袭性相关因子MMP-9和血管内皮生长因子VEGF的mRNA及蛋白表达降低(P<0.05),抗凋亡因子Bcl-2mRNA和蛋白表达下调(P<0.05),自噬相关因子LC3mRNA、Beclinl mRNA和Beclinl蛋白表达上调(P<0.05)。阴性对照组和空白对照组比较无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。 结论：COX-2siRNA可显著抑制人MG-63骨肉瘤细胞COX-2基因的表达,并进一步诱导MG-63骨肉瘤细胞降低增值、侵袭、迁移能力。沉默COX-2基因可以促进MG-63骨肉瘤细胞的凋亡和自噬,且二者之间存在一定的联系。