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关键词： 弓形体病   宿主免疫   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）可寄生于包括人在内的几乎所有温血动物的有核细胞，其感染所致的弓形虫病（to xop las mos is）是世界范围内流行的人兽共患的机会性寄生虫病。人们对弓形虫普遍易感，一般健康的人感染弓形虫会产生免疫力限制弓形虫增殖，然而抵抗力底下的患者如：妊娠妇女、癌症患者、免疫缺陷者感染弓形虫后可引起严重后果。弓形虫被认为介导宿主免疫反应以建立终身慢性感染，但其调控机制尚不清楚。在本研究中，我们应用微阵列分析来探讨弓形虫感染的人包皮成纤维细胞（HFF）细胞中lncRNA和mRNA的表达谱，我们检测到寄生虫感染后差异表达的lncRNA和mRNA的很大改变。通过GO和Pathway通路分析，差异表达的mRNA显示主要参与宿主免疫信号通路。结合LncRNA-mRNA共表达网络筛选出差异表达NONHSAT022487–UNC93B1共表达对，并应用qPCR、WB从mRNA及蛋白水平在HFF及THP1两种细胞中进行验证。然后采用干扰腺病毒载体shRNA-NONHSAT022487或导入pcDNA3.1-NONHSAT022487过表达载体，从功能缺失和功能获得两方面研究其对靶基因UNC93B1表达及生物学行为影响。值得注意的是，我们确定NONSHAT022487作为免疫相关基因UNC93B1的负调节因子，已知UNC93B1是诱导巨噬细胞中细胞因子产生和自主控制弓形体复制的关键因素。我们进一步发现由弓形虫感染诱导的lncRNA-NONSHAT022487通过下调人源巨细胞细胞中的UNC93B1表达而损害细胞因子IL-12，TNF-α，IL-6，IL-1β和IFN-γ的分泌。我们的研究结果揭示了一种新的调控机制，其中弓形体寄生虫调节宿主免疫信号通路，并可能提供抗击弓形虫病的潜在目标。　　目的：研究弓形虫感染后的人包皮成纤维细胞LncRNA的差异表达，确定感染诱导的lncRN A表达作为一种新的机制，通过这种机制，弓形虫寄生虫调节宿主免疫信号通路。这种机制可能提供抗击弓形体病的潜在目标。　　方法：⑴通过基因芯片分析正常细胞组、灭活速殖子组、速殖子组3组长链非编码RNA和mRNA差异表达，以>5 fold为基础筛选出差异倍数大的基因，为以后研究LncRNA功能奠定基础。⑵从大于5倍差异表达基因中随机抽取20种LncRNAs和10种mRNAs,并运用Primer5软件设计引物，选取特异性高的引物，并采用PCR仪进行PCR产物的扩增。⑶采用ABI7300荧光实时定量PCR检测来自正常细胞组、灭活速殖子组、速殖子组3组差异显著的20种LncRNAs和10种mRNAs进行验证;⑷根据GO注释，对差异倍数大于5倍的mRNA进行GO分析;以及mRNAs的Pathway通路分析。⑸选出与免疫相关的一些 mRNAs构建共表达以方便筛选出与本课题相关的LncRNA进行后续功能研究。⑹根据共表达网络筛选出 NONHSAT022487-UNC93B1共表达对，由于UNC93B1抗弓形虫感染，并采用 RT-PCR对其进行检测，发现NONHSAT022487上调明显，UNC93B1下调明显并采用Western Blot检测UNC93B1表达量下调，结果与芯片结果一致。⑺将 NONHSAT022487基因序列交给上海吉玛公司设计干扰序列，并筛选出合适的干扰序列构建干扰腺病毒载体。⑻构建干扰腺病毒shRNA-NONHSAT022487成功后，并用其感染HFF和THP1两种细胞，采用实时荧光定量 PCR检测其干扰效果，以及干扰后靶基因UNC93B1表达量变化。⑼构建NONHSAT022487过表达质粒，并采用PCR仪进行菌液PCR检测，确保构建过表达载体成功。⑽将构建成功的过表达载体转染HFF和THP1两种细胞，采用荧光定量PCR检测NONHSAT022487表达效果，以及过表达后靶基因UNC93B1表达量变化;⑾Western Blot检测NONHSAT022487干扰和过表达后，在HFF和THP1两种细胞中靶基因UNC93B1表达变化情况。⑿采用Elisa方法检测NONHSAT022487干扰和过表达后，弓形虫感染THP1细胞后，IL-1beta、IL-6、TNF、IFN-gama、IL-12等细胞因子变化;结果：①基因芯片数据分析，筛选出差异显著的LncRNAs和mRNAs（>5倍，P＜0.05），随机抽取20种LncRNAs和10种mRNAs进行RT-PCR检测,结果与芯片大体一致。②根据GO和Pathway分析，以及LncRNA-mRNA共表达网络分析，依据课题研究我们筛选出NONHSAT022487-UNC93B1共表达网络对，进行功能研究。③基因芯片和荧光实时定量PCR提示长非编码NONHSAT022487在弓形虫感染宿主

关键词： 分子生物学   细胞生物学   高等教育   教材  

ISBN: (纸本)9787030517258

摘要： 本书简明、系统地介绍了细胞及相关的分子生物学知识，内容包括:细胞的物质基础、物质与能量代谢、细胞结构及功能、细胞遗传物质、遗传信息的表达及调控、信息转导、细胞增殖与分化、神经细胞等。

关键词： microRNA-192和-215   胃癌   BIVM  

摘要： 研究背景与目的微小RNA(microRNA,miRNA)是一类19-22个核苷酸的内源性非编码小RNA,miRNA的5’端的2-7个核苷酸的“种子序列”可以与靶mRNA的3’端非翻译区互补结合,在转录后水平调控靶基因的表达。1993年,miRNA-lin-4被发现,此后又陆续从线虫、果蝇、家鼠、拟南芥及人类等多种真核生物中发现了这类小分子RNA,据推测在人类染色体上就有1000余种miRNA,目前已有超过700种得到确认。miRNA的编码基因是目前最大的一类调节基因。它在细胞的生长、增殖、发育和凋亡等诸多重要过程中均发挥了关键作用,并与多种肿瘤的发生发展密切相关。大量研究表明,miRNAs在肿瘤中扮演着相当于癌基因或抑癌基因的角色,调节肿瘤细胞的多种重要的生物学行为。胃癌(gastric cancer)是世界上最常见的恶性肿瘤之一;在我国其发病率居各类肿瘤的首位,每年有超过17万人死于胃癌。目前,住院病例中90%为进展期胃癌,尽管针对胃癌的诊断和治疗已经有了长足的进步,但进展期胃癌的预后依然很差,五年生存率长期徘徊在30%左右。近年来已发现胃癌的发生是多基因改变的结果,且已有证据表明miR-21,miR-191,miR-223,let-7a microRNA,miR-106b-25亚群等与胃癌的发生密切相关:let-7 microRNA,miR-155等与胃癌的侵袭与转移密切相关。随着越来越多的miRNA在胃癌中被发现,miRNA在胃癌的基因诊断和治疗中将发挥更为重要的作用。目前,还没有关于BIVM(for basic,immunoglobulin-like variable motif-containing)与胃癌关系的研究。基于本课题组有关胃癌miRNA表达谱的研究,我们初步确定BIVM为研究重点。以BIVM基因为检索词,利用四个常用数据库***、Target Scan、Pictar和miRanda进行相互作用miRNAs的预测,挑选出预测值较高(至少三个软件均预测到)的MiR-192和miR-215作为候选miRNAs;基因芯片、Real-time RT-PCR和Western blot结果显示MiR-192和miR-215可能是BIVM相互作用的miRs:荧光素酶报告系统结果显示miR-192和miR-215 inhibitors上调BIVM的后转录水平;然而MiR-192和miR-215 mimics起相反作用。向胃细胞系HFE145、SGC7901、BGC823中转染BIVM-siRNA以降低BIVM的蛋白表达水平来研究BIVM对胃细胞生物学功能的影响。

关键词： 心脏疾病   生物学特性   成心肌分化   经血源性子宫内膜干细胞  

摘要： 背景近年来,心血管疾病发病率逐年升高,而基于成体干细胞治疗心脏疾病的基础研究为临床应用带来新的契机。经血源性子宫内膜干细胞（Menstrual blood-derived Endometrial Stem Cells,Men ESC）具有干细胞特有的多向分化潜能,在特定诱导条件下可向心肌、神经、肝脏、胰腺、肺、骨、脂肪样细胞等分化。因此,在深入研究Men ESC生物学特性的基础上,筛选安全高效的成体干细胞成心肌分化诱导剂,为Men ESC在心脏疾病治疗中的应用提供理论支持。目的1. 深入分析经血源性子宫内膜干细胞生物学特性。2.明确样本存储时间对经血源性子宫内膜干细胞生物学特性的影响。3.筛选安全高效的经血源性子宫内膜干细胞成心肌分化的诱导剂。方法1. 月经杯收集健康女性志愿者（23-40岁）经血样品15 m L,与等量样品稀释保存液混合（含1%的青链霉素混合液、4%的0.25 mg/m L两性霉素B、2%的15 g/L EDTA-Na2）,4oC储存,并于48 h内进行原代细胞的分离提取。MTT法和流式细胞仪检测不同年龄志愿者经血样本中分离的Men ESC第3、9和18代（P3、P9及P18代）细胞增殖活性和成体干细胞表面标志的表达;将P3代Men ESC和小鼠嗜铬细胞瘤细胞株PC12注射入裸鼠皮下,检测Men ESC的致瘤性;将Di I标记的Men ESC经小鼠尾静脉注射72 h后取出肝、脾、肺和肾,经4%多聚甲醛固定,常规包埋后冰冻切片观察Men ESC在各器官分布。2.收集志愿者经血样本,同一经血样本平均分为三份,4oC储存6 h、24 h及72 h后采用密度梯度离心法分离培养Men ESC,HE染色及结晶紫染色法观察原代细胞形态及克隆形成;待培养至P3代时进行成脂成骨诱导和染色,MTT法检测增殖活性,流式细胞分析仪检测成体干细胞表面标志物表达。3.通过MTT法和划痕实验检测淫羊藿苷（Icariin,ICA）、丹酚酸B（salvianolic acid B Sal B）对P3代Men ESC增殖和迁移活性的影响;RT-PCR检测ICA、5氮杂胞苷（5azacytidine 5aza C）诱导前后心肌特异性转录调控因子MEF-2C、Nkx2.5、GATA4以及心肌特异性标志物心房钠尿肽（h ANP）、肌钙蛋白I（c Tn I）、肌钙蛋白T（c Tn T）的基因表达水平;最后进一步利用免疫细胞荧光的方法检测ICA、5aza C诱导后细胞中c Tn T在蛋白质水平的表达变化。结果1. 所分离培养的Men ESC阳性表达成体干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105,阴性表达造血细胞标志表面标志物CD45和CD34,并且阳性表达HLA-ABC,阴性表达HLA-DR;供体年龄和细胞传代次数对Men ESC的增殖能力影响呈负相关。细胞随着供体年龄和传代次数的增加对Men ESC成脂分化没有明显影响。裸鼠接种PC12细胞一周后可明显观察到瘤体形成,生存期不超过12周;而接种Men ESC的裸鼠至12周后仍未观察到瘤体形成;Di I标记的Men ESC经尾静脉注射72 h后,主要滞留在肺脏和肝脏,少数出现在脾脏和肾脏。2.经血样本体外4oC保存6 h、24 h及72 h后,所分离获得的三组原代Men ESC培养7 d后,HE染色结果显示多数细胞呈长而扁平的梭形,细胞集落成旋涡状生长,形态均一,排列较为整齐,结晶紫染色后均可见明显细胞克隆。且获得的Men ESC培养相同时间后检测其细胞数量各组之间没有明显差异。三组P3代Men ESC经成脂或成骨诱导21 d后,均可见明显的脂滴和钙沉淀;在培养3 d、5 d及7 d后MTT法检测其增殖活性,分析表明三组细胞的增殖活性无统计学差异。流式分析结果表明:CD29、CD44、CD73、CD90及CD105五种常用成体干细胞表面标志物,在上述三组P3代Men ESC上的阳性表达率均高于95%,且各组表达无明显差异。***在浓度为10-6 mol/L和10-7 mol/L时对Men ESC增殖和迁移无明显影响;而Sal B对Men ESC增殖和迁移均有抑制作用,因此选用ICA为理想的诱导Men ESC成心肌分化的诱导剂。进一步RT-PCR结果显示经ICA、5aza C诱导后的Men ESC均能显著上调MEF-2C、Nkx2.5、GATA4、h ANP、c Tn I及c Tn T基因的表达,而最终的免疫荧光结果也证实ICA诱导后的Men ESC阳性表达c Tn T。结论1. 所分离得到的Men ESC符合对成体干细胞的鉴定标准,进一步明确了Men ESC的生物学特性。2.从体外4oC存储72 h内经血样本中均可成功分离获得Men ESC,且对所分离获得的Men ESC生物学

关键词： 组蛋白去甲基化酶   Jhdm1d   慢病毒   肝癌细胞  

摘要： Jhdm1d是位于小鼠6号染色体上的编码包含有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶的基因,该结构域包含的氨基酸有940个,2008年,由NCBI将其名称确定为Jhdm1d。Jhdm1d能使H3K9me2和H3K27me2产生特异性的去甲基化,在转录抑制和染色质调节过程中均有所参与,并且另有研究证实,该基因也能参与许多发育过程,包括减数分裂以及重要器官形成等等,但Jhdm1d在肝癌中的作用目前尚无报道。为了深入研究Jhdm1d对小鼠肝癌细胞生物学特性的影响,通过构建干扰Jhdm1d基因表达的慢病毒载体,即p LKO.1-Jhdm1d,将p LKO.1-Jhdm1d与包装质粒pCMV-Δ8.9和pCMV-VSV-G共三种质粒共转染HEK-293T细胞,包装相应的慢病毒,并进行病毒滴度的测定。利用已包装的病毒感染肝癌细胞Hepa1-6细胞,并且利用实时定量RT-PCR和Western Blot检测分析,结果表明Jhdm1d的表达下调。进一步采用MTT增殖实验和结晶紫染色的方法发现pLV-Jhdm1d感染Hepa1-6细胞后促进其的增殖和克隆形成。为了进一步探究Jhdm1d的作用机制,通过PI染色分析发现,Jhdm1d对肝癌细胞Hepa1-6的细胞周期DNA合成期有显著性影响。另外,细胞划痕以及Transwell实验的结果也表明Jhdm1d下调能够提高肝癌细胞Hepa1-6的迁移和侵袭的能力。为进一步研究Jhdm1d对小鼠体内成瘤的影响,将感染pLV-Jhdm1d的Hepa1-6细胞进行了裸鼠体内移植实验,收集细胞进行皮下注射,结果显示,与对照组相比,pLV-Jhdm1d感染下调Jhdm1d表达后显著促进了肿瘤的增长。综上所述,Jhdm1d下调表达对小鼠肝癌细胞的增殖迁移以及侵袭等生物学特性有促进作用,由此推断Jhdm1d在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中具有肿瘤抑制的功能。

关键词： CASK   H1299   慢病毒载体   增殖   迁移  

摘要： 目的肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌总数的80%-85%,是临床最常见的一种类型。由于肺癌在早期缺乏明显的特异性症状,同时易发生血行转移,因此大多数患者在确诊时已进入中晚期阶段,治疗效果及预后均不佳。本课题组在前期通过生物信息学方法筛选出11个基因,其中人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK)在报道中与肺癌发病有重要关系。故本研究通过构建能高效表达人CASK基因的慢病毒载体并对H1299细胞系稳定转染后进行鉴定,并通过对人非小细胞肺癌H1299细胞株进行感染后,研究CASK过表达对其增殖能力和迁移能力的影响。方法***过表达慢病毒载体的构建采用聚合酶链反应(PCR)扩增CASK基因片段,通过重组反应完成目的基因扩增产物和线性化GV358载体的体外环化。对重组产物进行转化后,挑取单克隆进行PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序分析。最后将正确克隆菌液扩大培养、抽提以获得高纯度质粒。将重组质粒和包装质粒共转染至293T细胞。Western Blot检测转染后293T细胞蛋白表达水平;用酶联免疫吸附实验(ELISA)法进行滴度检测。2.细胞模型效能检测将成功包装的CASK过表达慢病毒LV-CASK(OE组)和阴性对照病毒CON238(NC组)分别感染人非小细胞肺癌H1299细胞,同时设置空白对照组(MOCK组),用荧光定量PCR(FQ-PCR)和Western Blot法检测CASK表达水平。***过表达对H1299细胞生物学功能特性的影响实验分组:空白对照组(MOCK组)、CASK过表达组(OE组)和阴性对照组(NC组),NC组和OE组分别用CON238和LV-CASK进行感染,MOCK组不予任何处理,分别使用MTT法和细胞划痕实验观察CASK过表达对H1299细胞增殖能力和迁移能力的影响。结果***过表达慢病毒载体的构建通过PCR技术成功地扩增CASK基因片段并连接到GV358病毒载体上,PCR及DNA测序鉴定结果证明CASK-GV358质粒构建正确。重组慢病毒转染293T细胞后可观察到绿色荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并测定其浓缩滴度为2×108 TU/m L。2.细胞模型效能检测FQ-PCR和Western Blot检测结果显示,与NC组相比,OE组CASK m RNA和蛋白的表达均显著上调(P<0.05)。***过表达对H1299细胞生物学功能特性的影响MTT法结果表明,OE组细胞增殖能力与NC组相比有明显差异(P<0.05),提示CASK过表达对H1299细胞增殖能力有抑制作用;细胞划痕实验结果表明OE组细胞迁移能力与NC组无明显差异(P>0.05),CASK过表达对H1299细胞迁移能力无明显作用。结论成功构建了CASK基因过表达慢病毒载体,可在H1299细胞中稳定表达,CASK过表达可抑制H1299细胞增殖能力,为进一步研究CASK在肺癌中的机制和作用奠定了基础。

关键词： 大豆凝集素   整联蛋白   仔猪小肠上皮细胞   细胞生物学功能   α-辅肌动蛋白   抗营养机制  

摘要： 大豆凝集素(SBA)是大豆及大豆产品中含有的抗营养物质,这种物质可通过与肠道上皮细胞膜表面特异性结合,改变细胞的结构及功能,影响肠上皮细胞的代谢过程。整联蛋白是细胞膜上的跨膜糖蛋白,其介导的细胞粘附作用是指导细胞生物学功能的一个重要因素。为了阐明SBA在影响猪肠道上皮细胞健康过程中是否与整联蛋白的信号传递存在关系,本论文主要开展了以下三部分试验研究。本研究以仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为细胞模型,探究表达于IPEC-J2细胞中整联蛋白亚基的种类,探索这些整联蛋白亚基的在IPEC-J2细胞增殖,周期,凋亡以及SBA引起的IPEC-J2细胞周期及凋亡改变中的作用,初步研究SBA与这些整联蛋白之间的作用关系及连接方式,为揭示SBA的抗营养机制提供重要的研究证明和理论依据。试验一:IPEC-J2细胞中整联蛋白亚基的鉴定采用细胞膜蛋白提取试剂盒提取IPEC-J2细胞膜蛋白,通过SDS-PAGE电泳分离细胞膜蛋白,根据整联蛋白分子质量为80-220 kDa的特点,将此区段的凝胶条带进行质谱(Q-TOF)分析。采用免疫印迹的方法对质谱检测的整联蛋白亚基结果进行二次鉴定。质谱与免疫印迹试验的检测结果发现:分布于IPEC-J2细胞膜蛋白上的整联蛋白亚基种类为5种,分别为α2,α3,α6,β1和β4。试验二:整联蛋白在IPEC-J2细胞增殖,细胞周期,细胞凋亡以及SBA引起IPEC-J2细胞周期与凋亡改变中的作用采用浓度为0,0.125,0.25,0.5,1.0和2.0 mg/mL SBA处理IPEC-J2细胞24 h,通过CCK-8试剂盒检测不同水平SBA对IPEC-J2细胞增殖的影响,采用流式细胞仪测定SBA对IPEC-J2细胞周期及凋亡的影响。通过荧光定量PCR测定SBA处理前后,细胞周期相关基因CDK4,Cyclin E和Cyclin D1 mRNA表达量的变化情况。分别采用作用浓度为0,5,10及20μg/mL的整联蛋白(α2,α3,α6,β1及β4)功能性抑制剂处理细胞24 h,用CCK-8试剂盒检测不同整联蛋白抑制剂对IPEC-J2细胞增殖的影响,同时筛选出整联蛋白亚基抑制剂的最佳作用浓度。利用所筛选出的最佳作用浓度的SBA与整联蛋白抑制剂进行整联蛋白功能性抑制试验。试验主要分为4组,分别为:0 mg/mL SBA处理组(对照组);SBA处理组;整联蛋白抑制剂处理组;以及整联蛋白(α2,α3,α6,β1及β4)抑制剂+SBA处理组,试验24 h后,检测不同整联蛋白亚基抑制剂在IPEC-J2细胞增殖,周期,凋亡以及SBA引起的IPEC-J2细胞周期与凋亡改变中的作用。试验结果表明:不同水平的SBA会通过阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期而显著降低细胞增殖(P<0.05),引起细胞凋亡(P<0.05)。SBA会显著下调细胞周期关键基因CDK4,Cyclin E和Cyclin D1的mRNA表达水平。整联蛋白α2,α3,α6,β1和β4是维持IPEC-J2细胞正常增殖,周期及凋亡的重要蛋白,功能性抑制任何一种亚基均会引起细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05),抑制IPEC-J2细胞增殖(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05)。除此之外,整联蛋白α2,α6和β1参与SBA引起的IPEC-J2细胞周期改变过程(P<0.05),而整联蛋白α2,α3,α6,β1及β4参与SBA引起的IPEC-J2细胞凋亡过程。试验三:SBA与整联蛋白作用关系与连接方式的研究采用2.0 mg/mL SBA处理IPEC-J2细胞24 h,通过荧光定量PCR检测SBA对整联蛋白亚基α2,α3,α6,β1和β4 mRNA表达水平的影响;采用免疫共沉淀的方法分离IPEC-J2细胞膜上的SBA特异性结合蛋白,通过质谱(Q-E)对SBA结合蛋白进行鉴定;利用荧光定量PCR测定2.0 mg/mL SBA对α-辅肌动蛋白-2(ACTN2)基因表达量的影响;采用ACTN2-siRNA序列处理IPEC-J2细胞24 h,通过荧光定量PCR技术探索ACTN2与整联蛋白(α2,α3,α6,β1和β4)基因表达水平之间的作用关系。试验结果显示:SBA显著下调整联蛋白α2,α3,α6,β1及β4的mRNA表达量(P<0.05)。IPEC-J2细胞膜上含有67种SBA特异性结合蛋白,在这些SBA特异性结合蛋白中,不存在任何一种整联蛋白亚基,说明SBA与整联蛋白之间没有发生直接连接作用,但是从检测结果中发现了整联蛋白连接蛋白,α-辅肌动蛋白-2(ACTN2,Accession:F1RHL9),且SBA会显著降低ACTN2的mRNA表达量(P<0.05)。除此之外,ACTN2基因沉默后,α2,α3,α6,β1及β4 mRNA表达量也随着显著降低(P<0.05),表明SBA可能

关键词： 脱氢表雄酮   鸡胚原代肝细胞   脂滴沉积   细胞增殖   线粒体功能  

摘要： 脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)作为机体胆固醇醇代谢过程中最重要的中间产物,可直接或在靶器官相关酶系的转化下而间接发挥其广泛的生物学作用。研究表明,DHEA降低机体脂肪沉积的作用已较为肯定,但其具体的生物学机制尚不明确。机体脂肪的沉积取决于脂肪细胞数量的增加和脂肪细胞的肥大。已有对DHEA调节脂代谢的研究主要集中在与脂肪代谢直接相关的因子方面,往往忽视了其对细胞生物学特性的影响。因此,本文以鸡胚原代肝细胞为研究对象,在分析DHEA对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积和脂代谢相关因子的影响基础之上,探讨DHEA对鸡胚原代肝细胞增殖、细胞周期和线粒体功能的影响,以期为从细胞生物学特性的角度阐明DHEA调节机体脂肪沉积的机制。研究结果将为揭示DHEA的生物学功能及其作用机制提供重要的理论依据,同时对提高畜禽产品品质及营养代谢病的防控也具有一定的指导性意义。***对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的影响及其机制本实验以鸡胚原代肝细胞为研究对象,探讨不同浓度DHEA对鸡胚原代肝细胞脂沉积和脂肪代谢关键因子mRNA表达的影响,以期阐明DHEA对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的影响及其机制。鸡胚原代肝细胞用含终浓度分别为0μmol·L-1、0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·I-1 和 100 μmol·L-1 的 DHEA 培养液分别孵育 1 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后,收集细胞。采用MTT法检测细胞相对活力,试剂盒测定甘油三酯(TG)含量,油红染色检测脂滴沉积,Real-time PCR检測鸡胚原代肝细胞脂肪合成关键因子ACC和FAS、脂肪分解关键因子CPT-I mRNA及相关转录因子PPARα、SRE P-1c 和 AMPK的 mRNA 表达水平。结果表明,0.1 μmol·L-1～50 μmol·L-1的DHEA处理1-48 h均可显著增加鸡胚原代肝细胞活力(P<0.05)。0.1～100 μmol·L-1的DHEA处理1～48 h,可显著降低鸡胚原代肝细胞中TG含量(P<0.05)。油红染色分析表明,0.1～100 μμmol L-1的DHEA处理可显著降低鸡胚原代肝细胞中脂滴数目和脂滴总面积(P<0.05)。脂代谢相关基因分析结果表明,0.1～100 μmol·L-1的DHEA处理能极显著降低FAS、ACC和SREBP-1c mRNA的表达水平,显著升高CPT-ImRNA的表达(P<0.05)。与对照相比,PPARα mRNA的表达水平在50μmol·L-1和1OOμmol·L-1的DHEA处理组显著升高(P<0.05)。0.1～100μmol ·L-1的DHEA处理可显著升高AMPKαl和AMPKα2mRNA的表达水平(P<0.01),但不同浓度DHEA处理组对AMPKβ1、AMPKβ2、AMPKγ1、AMPKγ2和AMPKγ3mRNA的表达水平并无显著影响(P>0.05)。以上结果提示,DHEA处理可通过抑制脂肪合成相关基因的表达、增强脂肪分解相关基因的表达,从而抑制鸡胚原代肝细胞内脂滴的沉积,且其机制可能与DHAE增强AMPKα的表达有关。***对鸡胚原代肝细胞增殖特性的影响本实验以鸡胚原代肝细胞为研究对象,探讨DHEA对鸡胚原代肝细胞增殖特性、细胞周期和周期相关因子表达的影响,以期从细胞增殖特性的角度阐明DHEA调节鸡胚原代肝细胞脂肪沉积的影响及其机制。选用终浓度分别为0μμmol·L-1、0.1 μμmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μμmol.L-1、50 μmol·L-1 和 100 μmol·L-1 的 DHEA 培养液孵育鸡胚原代肝细胞24 h。采用EDU法检测鸡胚原代肝细胞的增殖,流式细胞术分析鸡胚原代肝细胞细胞周期各期比例,Real-timePCR检测细胞周期因子CyclinA、CyclinB和CDK2 mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,1～100μomo·L-1的DHEA处理组能明显降低鸡胚原代肝细胞的总细胞数和新增殖细胞《数,且呈现出明显的剂量效应。流式细胞术分析结果表明,1～100 μmol·L-1的DHEA处理可极显著增加S期细胞比例(P<0.01),极显著降低G2/M期细胞比例(P<0.01)。与对照组相比,1～100μmol·L-1的DHEA处理组能显著降低CyclinAmRNA的表达水平(P<0.05),1 μmol·L-1、50μmol.I-1 和 100 μmol·L-1 DHEA 处理组显著降低 CDK2 mRNA 的表达水平(P<0.05),但不同浓度DHEA处理组对CyclinB mRNA表达水平无显著性影响(P>0.05)。以上结果提示,DHEA处理可通过降低Cyclin

关键词： 宫颈癌   HLA-G   增殖   凋亡   侵袭  

摘要： 目的:宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤。人乳头瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)的感染是宫颈病变发展过程中的必要步骤,事实上,HPV感染通常是短暂的,宿主免疫系统可以抵抗病毒入侵,导致病变消退,而持续感染的维持还需要其他多种因素的调控。人类白细胞抗原-G(Human leukocyte antigen G,HLA-G)蛋白表达与病毒感染密切相关,研究可知HPV病毒可诱导HLA-G分子的表达,肿瘤或病毒感染细胞的微环境均可上调HLA-G的表达,HLA-G可能与HPV感染(特别是HPV18基因型)和持续易感性相关。从癌前病变进展到癌变,HLA-G抗原的表达量是一个循序渐进的过程,HLA-G与肿瘤或病毒调节的表达之间的平衡可以导致感染的不同结果,促进或消除病毒感染的持续性。显然,HLA-G的表达与HPV病毒的感染之间的关联,对子宫颈肿瘤的发生发展、预测等具有重要意义。HLA-G基因是一种具有免疫抑制功能的非经典的主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)I类分子,正常生理条件下,HLA-G仅分布在母体与胎儿界面的绒毛膜外滋养层细胞等少数免疫豁免组织,是诱导和维持母胎免疫耐受的一个重要因素。有报道,HLA-G在胃癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞和肿瘤微环境中侵入的炎性细胞中有异常表达,可能与肿瘤细胞免疫逃逸相关。另外,现在已经证实,异常的HLA-G在宫颈癌中也有明显表达。然而,关于HLA-G与宫颈癌相互作用的关系仍不明确。本课题旨在通过体外实验,研究HLA-G对宫颈癌HPV18基因型hela细胞增殖活性、凋亡水平及侵袭能力的影响,探究宫颈癌细胞中HLA-G的生物学作用。方法:(1)HLA-G真核表达载体转染及鉴定将构建好的真核表达质粒pc DNA3.1(-)/HLA-G通过lipofectamineTM 2000瞬时转染宫颈癌hela细胞,并设空载体质粒转染组(阴性对照)和未转染组。通过计数镜下带有EGFP荧光标记的细胞比例,计算转染效率。并进行RT-PCR、Western blot法检测癌细胞HLA-G基因在m RNA和蛋白水平上的表达。(2)通过四甲基偶氮哇蓝(MTT)比色法检测3组细胞的生长活性。(3)采用流式细胞术分析3组细胞的凋亡情况。(4)采用transwell细胞体外培养实验检测3组细胞的侵袭能力。结果:(1)转染后,绿色荧光细胞所占比率判断出转染效率约达80%,RT-PCR和Western blot证实转染后宫颈癌hela细胞株中HLA-G m RNA、蛋白表达量增加(p<0.05)。(2)MTT法显示:过表达HLA-G组与空质粒组和未转染组相比,细胞增殖最快,差异有统计学意义(p<0.01)。而未转染组和空质粒组相比也存在差异(p<0.05),考虑可能是由于脂质体和质粒的毒性所致。(3)流式细胞仪检测结果显示:与空质粒组相比,过表达HLA-G组细胞凋亡减少,差异有统计学意义(p<0.01)。而未转染组和空质粒组相比也存在差异(p<0.05),考虑可能是由于脂质体和质粒的毒性所致。(4)经transwell细胞体外培养,结果显示,空质粒组和过表达HLA-G组细胞体外侵袭能力具有显著差异((p<0.01)。结论:过表达HLA-G可能促进宫颈癌hela细胞的增殖和侵袭,减少其凋亡。

关键词： 糖原代谢   PYGL   结直肠癌   活性氧   肿瘤转移  

摘要： 研究背景:结直肠癌的发生发展机制目前尚不清楚。研究发现,肿瘤细胞物质代谢和相关酶学的改变在肿瘤的发生发展中发挥着重要的促进作用。近年来的研究发现,糖原代谢是肿瘤细胞的一种普遍的物质代谢途径,而调控糖原分解代谢的糖原磷酸化酶(GP),尤其是肝型糖原磷酸化酶(PYGL)的异常表达,可能与肿瘤的进展有关。既往的研究已发现,结直肠癌组织中的糖原含量与其肿瘤体积及细胞增殖率呈负相关,即结直肠癌组织内糖原水平越高,肿瘤体积越小,肿瘤细胞增殖率越低。这提示结直肠癌细胞可通过分解利用糖原来促进其恶性增殖。但是,目前对于调控糖原分解的关键酶GP,尤其是PYGL,在结直肠癌中的表达以及其对结直肠癌糖原代谢和肿瘤发生发展的影响尚不十分清楚。目的:检测结直肠癌组织PYGL及其同工酶脑型糖原磷酸化酶(PYGB)的表达情况,分析PYGL和PYGB的差异性表达与结直肠癌临床病理特征以及预后的关系,明确PYGL在结直肠癌发生发展中的关键作用;研究PYGL在不同的结肠癌细胞株中的表达情况,探讨PYGL表达对结肠癌细胞内糖原代谢水平的调控作用;研究PYGL的表达对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法:①纳入解放军总医院从2009年1月至2010年6月行手术治疗的结直肠癌患者的肿瘤组织110例,取对应的癌旁组织作为对照。采用免疫组织化学的方法检测PYGL和PYGB在癌组织及癌旁组织中的表达差异。②采用WB的方法检测结肠癌细胞株和正常结肠细胞系中PYGL的表达情况。设计三组PYGL-siRNAs(siRNA-1281、siRNA-343、siRNA-640)沉默HCT116 细胞,用 WB 筛选出沉默效率最高的片段,并作为靶基因构建慢病毒载体,包装慢病毒,感染HCT116细胞株并筛选稳转细胞系。③用酶联比色法检测细胞内糖原水平,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,并分别用MTT法和Transwell法检测细胞增殖和迁移能力。结果:①PYGL和PYGB在结直肠癌组织中的表达率均显著高于其在癌旁组织中的表达率(P<0.01),PYGL的表达与结直肠癌的淋巴结转移及OS有关,有淋巴结转移的病人PYGL的阳性表达率较高(P<0.01),COX单因素和多因素分析均显示PYGL表达阳性的患者OS较短(P<0.01);PYGB在分化程度好的结直肠癌组织中的表达率显著高于其在分化程度差的癌组织中的表达率(P<0.01),PYGB的表达与淋巴结转移和OS无关(P>0.05)。这提示PYGL可能在结直肠癌的发生发展中起关键作用。②PYGL在结肠癌细胞株HCT116、SW480、CaC02均有表达,而在正常结肠细胞株NCM46不表达。筛选出沉默效率最高的siRNA-640作为靶基因序列,用于构建慢病毒载体,WB检测shRNA可有效下调HCT116细胞中PYGL表达水平。③实验组HCT116细胞(shPYGL)与空载组(shCtr)和空白对照组比较,其细胞内糖原水平(32.6±4.7 vs 14.9±1.7vs 12.7±0.73ng/ul,P<0.01)和 ROS 水平(DCF 荧光相对强度:45.7±4.1 vs 11.8±3.3 vs 3.9±1.0,P<0.01),均明显上升。shPYGL 组细胞在第 2(0.35±0.02 vs 0.57±0.01 vs0.54±0.02,P<0.01),3(0.41±0.01 vs0.75±0.04 vs 0.75±0.05,P<0.01),4(0.50±0.04vs0.86±0.02vs0.86±0.03,P<0.01)天的吸光度(od)值,及穿过 transwell 膜的数目(37.00±5.29 vs 96.67士11.55 vs 103.33±7.02,P<0.01),与shCtr组和空白对照组比较,均明显降低,提示抑制PYGL,可抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力。结论:结直肠癌癌组织中PYGL表达水平上调,PYGL的表达水平上调与淋巴结转移及患者预后差相关;PYGL的高表达能够有效促进结肠癌细胞对糖原的利用,并降低结肠癌细胞内活性氧水平;PYGL通过动员糖原分解,促进了结肠癌细胞的生长和增殖,提高了结肠癌细胞的迁移能力,可能与结直肠癌的发生与转移机制有关。