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关键词： 雄性生殖干细胞(mGSCs)   PLZF   生物学特性   奶山羊  

摘要： 雄性生殖干细胞(male Germline Stem Cells,mGSCs)是定位于雄性动物睾丸中的曲细精管基底膜上的成体干细胞。mGSCs不仅能够通过自我更新来维持自身群体数量的稳定,还可以通过定向分化产生精子,是唯一一种能够通过自然生殖过程将雄性动物的遗传信息传递到下一代的成体干细胞。PLZF是一种高度保守的多功能转录调控因子,其表达具有严格的组织特异性和时序特异性,参与机体的发育、分化等多种重要的生物学过程。近年来,PLZF作为非常重要的转录因子,已引起人们的广泛关注。PLZF表达于未分化的mGSCs,对其多能性的维持、自我更新和分化的平衡以及雄性个体的生育能力维持等具有重要的调控作用,是被广泛认可的mGSCs的标志基因。目前,虽然对PLZF调控mGSCs自我更新和分化的作用及作用机制的探索已经取得了一些进展,但这些研究都是在小鼠等模式动物中取得的。PLZF对山羊等家畜大动物mGSCs的作用及作用机制却知之甚少。本研究拟在已有基础上,探索PLZF对奶山羊mGSCs生物学特性的的影响,以进一步了解其对精子发生过程的调节机制。本实验通过构建PLZF超表达和干扰慢病毒载体,转导奶山羊mGSCs,并筛选得到了稳定超表达和干扰PLZF的奶山羊mGSCs细胞株。并通过免疫荧光染色,qPCR,Western blot,EdU染色,流式细胞检测等技术手段检测了PLZF对奶山羊mGSCs多能性、自我更新、增殖、分化和凋亡等生物学特性的影响。***超表达载体及干扰载体的构建和稳转细胞株的筛选我们构建得到了PLZF慢病毒超表达载体pPLZF-CDH和PLZF慢病毒干扰载体pshPLZF。然后将慢病毒载体包装病毒并转导奶山羊mGSC,通过筛选、鉴定得到了超表达PLZF的稳转细胞株mGSCs-oePLZF及其对照细胞株mGSCs-pCDH,干扰PLZF的稳转细胞株mGSCs-pshPLZF及其对照细胞株mGSCs-pSIH。***促进奶山羊mGSCs维持其自我更新和多能性并抑制其分化通过免疫荧光染色、qPCR和Western blot检测,研究发现GFRα1、Vasa、CD49f、CD90、Oct4、Etv5等与mGSCs自我更新和多能性相关的基因表达显著上调,而mGSCs的分化标志基因c-Kit表达水平显著下调。另外我们通过qPCR检测发现Tet1表达水平显著下调,同时Dnmt3a表达水平显著上调,说明PLZF可能促进奶山羊mGSCs的DNA甲基化修饰。***抑制奶山羊mGSCs增殖,促进其凋亡我们通过测定细胞生长曲线、CCK8检测、EdU染色、流式细胞周期检测、免疫荧光染色、qPCR、Western blot等实验方法,发现超表达PLZF的奶山羊mGSCs细胞增殖速度变慢、细胞周期在G0/G1期发生阻滞,细胞凋亡相关基因表达上调。通过细胞移植实验发现,移植PLZF超表达稳转细胞的白消安模型小鼠睾丸要明显比对侧移植对照细胞的睾丸小,且曲细精管内形成的细胞克隆也明显比对照组差;相应的,移植PLZF干扰稳转细胞的睾丸明显比对照组大,曲细精管内形成的细胞克隆也比对照组好。

关键词： 寻常性银屑病   血热证   细胞生物学   mRNA表达水平   凉血药物  

摘要： 目的:筛选寻常性银屑病血热证清热凉血药物敏感基因，并验证其在寻常性银屑病血热证中的细胞生物学机制　　方法:采用在体与离体实验相结合，运用Solexa高通量测序技术，Real-timePCR，免疫组化，Western blot等技术，系统观察银屑病“血热证”患者与正常人组织中相关基因、蛋白表达差异，并以正常人血清、银屑病血热证患者血清、含药血清培养的人角质形成细胞HacaT细胞株、人T淋巴细胞Jurkat细胞株为研究对象，以正常人血清、寻常性银屑病血热证患者血清及清热凉血药物含药血清进行细胞培养，采用shRNA干扰技术，造成相关基因沉默，运用流式细胞仪观察细胞凋亡及增殖结果，Real-time PCR技术观察敏感基因mRNA表达水平，Western Blot技术观察敏感基因蛋白表达水平。　　结果:89例寻常性银屑病血热证患者经凉血治疗8周后，根据治疗结局分为愈显组（32例）、有效组（47例）、无效组（10例）。运用Solexa高通量测序技术，检测寻常性银屑病血热证患者皮损组织及健康受试者皮肤组织，将差异基因聚焦于PD-1/PD-Ls通路。经Real-timePCR技术验证，结果显示寻常性银屑病血热证患者愈显组皮损组织中CTLA-4mRNA、PD-1 mRNA、PD-L2mRNA高表达(P＜0.01)，经免疫组化定量分析及Western blot技术验证，结果发现结果显示寻常性银屑病血热证患者愈显组皮损组织中PD-1、PD-L2蛋白高表达(P＜0.05)。细胞培养结果发现，转染PD-L1shRNA后，经流式细胞仪检测，各组细胞凋亡率无显著性差异(P＞0.05)，含药血清组细胞增殖明显降低，寻常性银屑病血热证患者血清组染空质粒(vector)和转染PD-L1 shRNA后，HacaT细胞增殖率均升高，与不转染干预因素存在显著性差异(P＜0.05);清热凉血中药含药血清组与正常受试者组，不转染、转染空质粒(vector)与转染PD-L1 shRNA均存在显著性差异(P＜0.05)。　　结论:推测PD-1、PD-L2、CTLA-4可作为寻常性银屑病凉血药物治疗的敏感基因，银屑病血热证患者由于皮损处PD-1、PD-L2基因的下调，PD-1/PD-L2结合下降，树突状细胞活化，分泌IL-23，促进T细胞向Th17分化，分泌IL-17，招募炎症细胞到皮损处聚集;另一方面，由于上述基因的缺乏，其负性调控机制受到抑制，导致细胞增殖过度。

关键词： 非小细胞肺癌   RNA干扰   eIF3d   慢病毒  

摘要： 目的构建LV-eIF3d-shRNA质粒并研究eIF3d敲减后对肺癌细胞的影响。方法通过数据库筛选针对目的基因的siRNA序列的相关信息。序列设计并合成后,通过Ecor I和Bam HI位点将目标序列克隆入p GP载体,并测序确定序列。共转染病毒包装颗粒和shRNA质粒至293T细胞,在48h后收集培养基,将收集到的培养基进行过滤、离心、浓缩,并测定滴度。将肺癌细胞A549和95D分为实验组和对照组。实验组:用LV-eIF3d-shRNA质粒转染对应细胞;对照组:空白慢病毒质粒转染对应细胞。转染后,进行以下实验:1、釆用q PCR和Western blot分别检测细胞中eIF3d-m RNA和相应蛋白的表达量;2、利用MTT实验检测各组细胞的增殖能力;3、克隆形成实验检测群落形成能力。4、Transwells实验和划痕实验检测各组细胞的迁移能力。5、流式细胞术检测细胞周期变化;6、蛋白质芯片技术检测下游分子表达。结果经基因测序确认,重组质粒序列正确。通过GFP表达观察,显示转染效率超过90%。滴度测定结果:sh Con:7.0×106Tu/ml;sheIF3d(S1):1.3×1 06Tu/ml;sheIF3d(S2):7.0×106Tu/ml,符合后续实验要求。在A549和95D中;证实实验组细胞中eIF3d的m RNA和相应蛋白的表达量较对照组明显下调;MTT实验和克隆形成实验结果显示实验组细胞的增殖和群落形成能力减弱;Transwells实验和划痕实验显示细胞迁移能力也受到明显抑制;流式细胞术结果显示实验组细胞发生了G2/M期阻滞。蛋白质芯片结果显示敲减eIF3d后影响了AKT,HSP27和SAPK/JNK的激活。结论LV-eIF3d-shRNA质粒构建成功。eIF3d与人肺癌细胞株A549和95D中,起到了癌基因的作用。通过下调eIF3d的表达可降低细胞的增殖和迁移能力,影响细胞周期,以及相关信号通路的激活。

关键词： 关节软骨再生   关节软骨细胞   间充质干细胞   细胞共培养   旁分泌效应  

摘要： 关节软骨组织自我修复能力有限,但目前在临床上仍缺乏有效的治疗手段。近年来发展起来的组织工程和细胞治疗技术有望能真正实现软骨组织再生,其中细胞是这一新技术的核心要素之一,目前最具应用前景的细胞包括关节软骨细胞(Articular chondrocytes,ACs)和间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)。但是,这两种细胞在实际应用中各有优点,也各有不足,因此有研究者提出将两种细胞相结合,并已经开展了一系列将MSCs与ACs进行共培养的相关研究工作,期望深刻理解两种细胞的相互作用并实现合理调控,从而为基于细胞的软骨再生治疗策略提供一种新的途径。2016年所报道的MSCs与ACs混合体临床试验具有可行性的结果更是令人鼓舞。然而,由于实验设计的千差万别,尤其是共培养方式、培养基成份以及细胞来源的不同,导致了对相关实验发现的直接比较非常困难,因而到目前为止对于MSCs与ACs之间相互作用的认识并不系统,并且大多数研究只关注共培养中ACs对MSCs的单向作用,而普遍忽略了 MSCs对ACs可能存在的调节作用。为此,本文将以我们团队的前期研究工作为基础,采用Transwell共培养方法开展针对MSCs调控ACs生物学行为的研究,验证MSCs调控软骨表型的普遍性,剖析MSCs调控ACs的相关作用机理,表征共培养的ACs生物学特征,并在复杂共培养方式包括混合共培养模式和海藻酸钙凝胶微球包裹细胞的Transwell共培养模式中探讨其相互作用。首先,基于Transwell间接共培养体系,实验发现兔骨髓来源的MSCs(Rabbit bone marrow-derived MSCs,rbBMSCs)能够显著调控兔 ACs(Rabbit ACs,rbACs)的分化表型,主要表现在rbBMSCs能够诱使rbACs的形态由圆形转变为成纤维细胞样,同时显著下调rbACs分泌基质的能力,并且能刺激其增殖,结果证明这一调控作用主要源于rbBMSCs的旁分泌作用。在此基础上,为了进一步验证这一调控现象的普遍性,实验选取了不同种属及组织来源的MSCs(人骨髓MSCs、人脂肪MSCs和大鼠骨髓MSCs),分别与不同来源的软骨细胞(rbACs、牛ACs和鼠软骨肉瘤细胞ATDC5)在Transwell体系中进行间接共培养,结果发现三种来源的MSCs均能诱使不同来源的软骨细胞发生形态变化,使细胞更加趋向于成纤维细胞样形态,这些MSCs均促进了软骨细胞的增殖,而且抑制了所有软骨细胞分泌透明软骨特征基质(糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAG)和Ⅱ型胶原)的能力。这些结果表明MSCs调控软骨细胞的作用具有一定的普遍性。当然,不同MSCs的调控能力以及不同软骨细胞的响应程度均有差别,这可能与不同种属和组织来源的细胞存在差异有关。为了探讨MSCs调控ACs生物学行为的作用方式和机制,本文以rbBMSCs与rbACs在Transwell体系中的间接共培养方式为代表,将不同接种量的rbBMSCs(2×104、2.5×105、5×105和1×106 cells/well)分别与rbACs进行共培养,发现无论是rbACs的形态转变程度还是细胞增殖能力,都与rbBMSCs的接种量正相关,这也间接证实了 rbBMSCs作用于rbACs的方式源于rbBMSCs的旁分泌因子。通过在共培养体系中添加ROCK抑制剂Y27632,发现Y27632能够阻止rbACs形态的转变,同时rbACs的基质分泌能力能够部分维持,特别是在rbBMSCs接种量较低的情况下能保持与单独培养组类似,而且添加了 Y27632的共培养条件下rbACs的基因表达水平与单独培养的rbACs 一致,但细胞增殖没有变化,这表明RhoA/ROCK信号通路参与了 rbACs的形态变化。通过在共培养体系中添加FGFR1/2/3、VEGFR1/2/3和PDGFRα/β的共同抑制剂BIBF1120,同样能够抑制rbACs的形态改变,上调GAG合成能力,显著抑制细胞增殖,而且相关基因表达也更趋于与单独培养的rbACs 一致,说明生长因子FGF、VEGF和PDGF可能参与了rbBMSCs对rbACs的调控作用。通过在单独培养的rbACs中加入FGF-1、VEGF-A和PDGFbb及其组合,发现尽管基因表达变化并不完全一致,但同时添加FGF-1、VEGF-A和PDGFbb三种因子最能模拟与rbBMSCs共培养的作用效果。因此可以推测,rbBMSCs是通过分泌旁分泌因子介导对rbACs生物学行为的调控,而这些因子可能就包括了FGF-1、VEGF-A 和 PDGFbb 等生长因子。为了进一步认识rbACs在共培养条件下的生物学特征变化,本文从三个方面对共培养的rbACs进行了深入表征。(1)将与rbBMSCs

关键词： 宫颈癌   潜在抑癌基因   生物学特性   作用机制  

摘要： 目的：　　1.构建并鉴定 PIRES2-EGFP-eIF4E3(野生型，简称 eIF4E3)、PIRES2-EGFP-eIF4E3C69a（突变体，简称 eIF4E3C69a）、PIRES2-EGFP-eIF4E3w86a（突变体，简称eIF4E3 w86a）真核过表达载体。　　2.建立eIF4E3野生型和突变体稳定转染宫颈癌细胞株【Hela（HPV18+）细胞株和C33a（HPV-）细胞株】，明确其内源性和外源性eIF4E3基因及突变体的mRNA和蛋白的表达情况。　　3.探讨转染eIF4E3野生型和突变体质粒对宫颈癌细胞株增殖、克隆形成率、细胞周期、凋亡、侵袭能力的影响。　　方法：　　1.通过PCR在人细胞cDNA库中扩增eIF4E3全基因，人工化学合成突变体eIF4E3C69a和eIF4E3w86a。将目的片段和空载质粒PIRES2-EGFP分别进行双酶切后进行连接，重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，摇菌扩增，提取质粒，利用双酶切跑胶、菌液及质粒PCR、DNA测序等进行鉴定。　　2.对宫颈癌细胞株 Hela和 C33A瞬时转染 eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a表达质粒，24小时后，用G418药物筛选阳性克隆细胞，qRT-PCR、WesternBlot检测内源性、外源性eIF4E3和突变体在宫颈癌细胞中mRNA和蛋白的情况。　　3.采用CCK-8、平板克隆、流式细胞术、Transwell小室等技术分别检测eIF4E3野生型和突变体宫颈癌细胞株的增殖、克隆形成能力、细胞周期、凋亡及侵袭能力的情况。　　结果：　　1.成功构建eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a真核表达载体　　重组质粒双酶切、质粒及菌液PCR结果显示插入片段大小正确，测序结果通过Blast比对NIH基因库的eIF4E3基因序列显示eIF4E3、 eIF4E3C69a、eIF4E3w86a序列准确且编码框架正确插入PIRES2-EGFP中。　　2.稳定转染eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3w86a真核表达载体的宫颈癌细胞株的内源性、外源性野生型eIF4E3和突变体eIF4E3的 mRNA和蛋白的表达情况　　（1）RT-qPCR结果：内源性eIF4E3 mRNA在Hela和C33A宫颈癌细胞中呈低水平表达;与空载组相比，转染eIF4E3、eIF4E3c69a、eIF4E3w86a表达质粒后，Hela细胞的eIF4E3或突变体mRNA水平分别提高了4705.88、7083.51、8307.79倍(P<0.01)，C33a细胞分别提高了3467.99、2592.06、6038.12倍(P<0.01)。　　（2）Western Blot结果：内源性eIF4E3蛋白在Hela和C33A宫颈癌细胞中呈低表达水平;与空载组相比，转染eIF4E3、eIF4E3C69a、eIF4E3C w86a表达质粒后, eIF4E3或突变体蛋白分子量稍大（含EGFP），在Hela细胞中其水平分别提高了6.24、40.10、38.60倍(P<0.01），在C33a细胞中其水平分别提高了7.30、25.03、17.21倍(P<0.01）。　　3.转染eIF4E3野生型和突变体质粒后对宫颈癌细胞增殖、克隆形成率、细胞周期、凋亡、侵袭能力的影响　　（1）与空载组相比，按24h、48h、72h、96h顺序，稳转过表达eIF4E3后， Hela细胞的增殖抑制率分别为20.60%、35.86%、24.58%、23.50%（P﹤0.01）， C33a细胞的增殖抑制率分别为16.50%、31.86%、24.15%、17.91%（P﹤0.01）;稳转过表达eIF4E3C69a后，Hela细胞的增殖抑制率分别为16.43%、31.33%、20.23%、21.15%（P﹤0.01），C33a细胞的增殖抑制率分别为16.25%、24.47%、18.79%、12.60%（P﹤0.01）;稳转过表达eIF4E3C w86a后，Hela细胞的增殖抑制率分别为2.31%、4.53%、10.15%、12.29%（P﹥0.05），C33a细胞的增殖抑制率分别为2.72%、5.53%、8.10%、10.24%（P﹥0.05）。　　（2）与空载组相比，稳转过表达eIF4E3后，Hela细胞克隆形成率下降56.09%（P<0.01），C33A细胞克隆形成率下降56.06%（P<0.01）;稳转过表达eIF4E3C69a后，Hela细胞克隆形成率下降37.44%（P<0.05），C33A细胞克隆形成率下降28.79%（P<0.05）;稳转过表达eIF4E3C w86a后，Hela细胞克隆形成率下降14.39%（P﹥0.05），C33A细胞克隆形成率下降15.18%（P﹥

关键词： 根尖牙乳头干细胞   细胞膜片   组织工程技术   牙髓再生   生物学特性  

摘要： 目的:以组织工程技术为基础的牙髓再生为年轻恒牙感染牙髓的治疗提供了新的方向。细胞膜片技术主要通过刺激细胞外基质的合成使细胞排列紧密形成膜片状结构。在细胞膜片中，细胞间富含细胞外基质、粘附蛋白等，有利于细胞发挥生物学特性。本课题拟在对根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）分离、培养与鉴定的基础上，构建SCAP细胞膜片，并对其组织学形态和生物学性能进行研究，为SCAP细胞膜片应用于年轻恒牙牙髓再生提供实验基础。　　研究方法:分离年轻恒牙第三磨牙牙乳头进行SCAP原代培养，采用流式细胞术检测SCAP表面标记物，茜素红S染色检测其成骨/成牙本质分化。取第3代SCAP，细胞膜片诱导液培养14天，形成细胞膜片。对SCAP细胞膜片进行HE染色，组织学观察;流式细胞术检测SCAP细胞膜片细胞周期的变化。实时定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测细胞膜片中Runx2、ALP、Col-Ⅰ基因表达;Western Blot检测细胞膜片Runx2、ALP蛋白表达水平。实验结果用SPSS17.0软件包进行分析，两样本细胞周期检测均数比较用t检验;qRT-PCR基因检测均数比较用Wilcoxon秩和检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　结果:HE染色组织学显示SCAP细胞膜片由5-6层细胞组成，细胞量大，细胞之间排列紧密，且富含细胞外基质。SCAP细胞膜片细胞周期G2+S期所占比例较低，而G1期比例较高，提示SCAP细胞膜片增殖性能受到抑制，而分化性能显著增强(P＜0.05)。同时，qRT-PCR和Western Blot结果显示，与SCAP相比，SCAP细胞膜片成骨/成牙本质分化能力显著升高（P＜0.05）。　　结论:SCAP细胞膜片富含细胞外基质，且成骨/成牙本质分化能力高于单纯的SCAP，SCAP细胞膜片应用于牙髓再生更具有优势。

关键词： AZD8055   自噬   胆管癌细胞   Akt/mTOR信号通路  

摘要： 目的:探讨mTOR抑制剂AZD8055对胆管癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。材料和方法:MTT法检测不同浓度的AZD8055对HuCCT1胆管癌细胞体外增殖能力的影响;平板克隆形成实验检测不同浓度的AZD8055对HuCCT1细胞集落形成能力的影响;划痕愈合实验检测AZD8055对胆管癌细胞HuCCT1横向迁移能力的影响;流式细胞仪检测AZD8055对细胞凋亡的影响;蛋白印迹实验检测AZD8055对胆管癌细胞自噬和凋亡相关蛋白表达的影响及Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达水平。结果:*** 检测实验结果显示:经 25nM、50nM、100nM、200nM、400nM 的 AZD8055处理胆管癌细胞24h、48h、72h后,与对照组相比其增殖率明显降低,呈剂量依赖性(P<0.05);2.平板克隆形成实验结果显示:与对照组相比,25nM、50nM和100nM作用于HuCCT1细胞14天后,均显著抑制细胞集落形成能力(P<0.05);3.细胞划痕实验检测结果显示:经100nM和200nM浓度的AZD08055处理细胞后,与对照组相比胆管癌细胞迁移距离明显缩短(P<0.05);4.流式细胞仪检测结果显示:50nM、100nM、200nM浓度AZD8055处理胆管癌细胞48h后,与对照组相比,其诱导凋亡效果不明显;5.蛋白印迹实验结果显示:与对照组相比,Cleaved caspase 3和促凋亡蛋白Bax下调,抗凋亡蛋白Bcl-2上调,且呈浓度依赖性(P<0.05);与对照组相比,经100nM、200nM、400nM浓度AZD8055处理胆管癌细胞24h后,自噬相关标记物BeclinⅠ蛋白的表达增高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例也增高(P<0.05);与对照组相比,Akt、S6、4EBP1的磷酸化蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:***8055可抑制胆管癌细胞增殖能力,其机制与诱导细胞自噬和下调Akt/mTOR信号通路相关;***8055可抑制胆管癌细胞的横向迁移能力,其机制与下调Akt/mTOR信号通路相关。

关键词： 炎症反应   烟酸受体   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：　　烟酸受体GPR109A在很多组织和细胞中都被证明有抗炎活性。发现小鼠胰岛β细胞及MIN6胰岛β细胞株表达烟酸受体GPR109A，并且证明在MIN6细胞上，通过激活GPR109A可以抑制IFN-γ和TNF-α诱导的细胞内NO累积，由此推测GPR109A在β细胞上同样也有抗炎活性。在这些研究基础上，本实验将利用棕榈酸对MIN6细胞进行炎症诱导后，观察 GPR109A的抗炎作用，并进一步探索它的抗炎机制。并在原代小鼠胰岛细胞上初步探讨是否存在着相同的抗炎机制。　　方法：　　培养MIN6细胞，通过RT-PCR及免疫细胞化学染色验证MIN6细胞上存在GPR109A的表达。分别予棕榈酸及棕榈酸+烟酸干预，蛋白免疫印迹法（western blotting）检测INF-γ及GPR109A的表达情况和Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平。为进一步验证GPR109A与Akt/mTOR信号通路的关系，分别予不同浓度的烟酸和3-羟基丁酸干预MIN6细胞，检测细胞内Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化水平。分离小鼠胰岛，予烟酸和3-羟基丁酸干预，荧光定量PCR分析mTOR、p70S6K的表达水平。　　结果：　　⑴MIN6细胞表达GPR109A mRNA。⑵MIN6细胞表达GPR109A蛋白。⑶烟酸可部分逆转棕榈酸诱导的MIN6细胞Akt和p70S6K的磷酸化和IFN-γ的表达。⑷烟酸抑制MIN6细胞内Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化。⑸3-羟基丁酸抑制MIN6细胞内Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化。⑹烟酸、3-羟基丁酸可抑制小鼠胰岛细胞mTOR、p70S6KmRNA的表达。　　结论：　　在MIN6细胞上，烟酸受体GPR109A可以通过抑制Akt/mTOR信号通路来抑制棕榈酸诱导的炎症因子表达。

关键词： 内皮细胞   水通道蛋白   ROS转运   细胞生物学  

摘要： 目的：探讨低氧状态下水通道蛋白1(Aquaporin1，AQP1)是否参与活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的转运。探讨化学性低氧刺激下AQP1是否存在谷胱甘肽化修饰以及AQP1与ROS之间的关系。　　方法：⑴构建AQP1过表达细胞株:通过慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)，转入带有AQP1的基因序列的质粒，建立稳定过表达AQP1的细胞株。⑵细胞低氧:AQP1过表达细胞与HUVEC正常细胞在96孔板中进行培养，待细胞80％-90％融合后更换培养基，在三气孵育箱（设置参数为:1％O2、5％CO2、94％N2）中分别按0、2、4、6小时进行低氧处理。⑶活性氧检测:低氧处理后细胞使用DCFH-DA探针孵育30min，洗去未进入细胞的DCFH，通过酶标仪在激发波长485nm，发射波长525nm条件下检测各组细胞的OD值。⑷30μM碘乙酰胺处理Balb/3T3成纤维细胞4小时。⑸免疫沉淀:裂解细胞后提取细胞内蛋白，通过蛋白A—琼脂糖珠连接抗体—抗原，纯化细胞内AQP1。⑹western blot:使用抗谷胱甘肽抗体或AQP1抗体检测免疫沉淀得到的蛋白样品。　　结果：①在荧光显微镜下观察慢病毒感染细胞的结果，与AQP1基因结合的GFP在细胞内呈绿色荧光，如图中所示，其余未转入AQP1基因序列的在图中呈黑色区域，图中大部分细胞发出绿色荧光，表明AQP1的基因序列成功导入宿主细胞。②无论是在生理状态还是低氧刺激下，AQP1过表达HUVEC与正常HUVEC其内活性氧浓度存在差异，2小时处我们发现AQP1过表达组细胞较HUVEC正常细胞ROS浓度低，但结果不具有统计学差异(P2=0.306)。而6小时处两组细胞间结果没有差异(P6=0.664)。③通过非还原SDS-PAGE于35Kd处沉淀所得AQP1，在同一位置处出现GSH条带，且与阴性对照有明显差别。　　结论：水通道蛋白1无论是在生理状态下还是细胞处于氧化应激时，其都能参与细胞内活性氧的转运，维持细胞内氧化应激水平。AQP1存在谷胱甘肽化修饰。