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关键词： 胎盘特异蛋白8   肾透明细胞癌   细胞增殖   细胞侵袭   RNA干扰   预后   通路  

摘要： 肾细胞癌（RCC）是成人泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤之一,发病率稍低于膀胱癌,占所有肾脏全部恶性肿瘤的90%-95%。肾细胞癌主要包括以下三种病理类型,其中透明细胞癌（ccRCC）是发病率最高的病理类型,约占所有报道病例的65%,其次是乳头状肾细胞癌（pRCC）和嫌色肾细胞癌,分别占15%20%和5%。近年来肾细胞癌发病率呈现逐年上升趋势。超过一半以上的早期肾细胞癌发病时无明显症状,17%以上的肾细胞癌确诊时已经出现远处转移,出现远处转移的肾细胞癌五年生存率小于10%,其中位生存期小于一年。目前手术依然是肾细胞癌最好的的治疗方式,对于已经存在有远处转移的肾细胞癌患者,细胞免疫治疗和肿瘤靶向药物治疗得到越来越多的应用。对于肾透明细胞癌行外科手术治疗后复发的患者目前暂无十分有效的临床治疗方法。因此,对于肾透明细胞癌的具体发生机制的研究具有重大意义,可以提高肾透明细胞癌的诊断与治疗。胎盘特异蛋白8（Placenta specific 8,PLAC8）,以前又叫onzin,是一种富含有半胱氨酸的蛋白,首次发现于人类胎盘组织中。PLAC8广泛分布于人体免疫系统及多种组织的上皮细胞中,PLAC8可以参与调节细胞的分裂、分化和细胞凋亡,与人体内多种肿瘤的发生有密切关系。但其在肾细胞癌中的作用尚未见报道。本论文主要目标是研究PLAC8在肾透明细胞癌发生发展中的作用及其可能的作用机制。本论文总共分为四大部分。第一部分通过Real-Time PCR及免疫组化法分析研究PLAC8在肾透明细胞癌及癌旁组织中的表达,发现在肾透明细胞癌组织中,PLAC8蛋白及mRNA表达高于正常肾脏组织。第二部分结合肾透明细胞癌患者临床病例资料,分析研究肾透明细胞癌中PLAC8高表达与患者临床预后之间的关系。得出PLAC8的表达与肾透明细胞癌的疾病进展、预后生存有关,PLAC8表达的高低可以独立作为肾透明细胞患者生存预后的标记物。第三部分主要研究分析PLAC8表达量对肾透明细胞癌细胞生物学行为的影响,肾透明细胞癌细胞中PLAC8表达水平降低后可以降低肾透明细胞癌细胞体外的侵袭和增殖能力,抑制细胞的生存力,并增加肾透明细胞癌对化疗药物（顺铂）的敏感性,增加化疗药物（顺铂）对癌细胞的杀伤性。第四部分主要探讨PLAC8影响肾透明细胞癌细胞生物学行为的可能机制,通过RNA-seq分析我们发现PLAC8下调基因有697个、上调基因有829个;通过Gene Ontology（GO）和KEGG通路富集分析,我们发现PLAC8参与肾透明细胞癌的疾病发生发展最相关的三个通路反应分别是刺激反应,化学物质反应和免疫反应,PLAC8可能在调节肾透明细胞癌炎症微环境中发挥重要作用。

关键词： 思维导图   细胞生物学   教学模式  

摘要： 为有效提高教学效果,针对目前细胞生物学教学中存在的主要问题,将思维导图应用于课堂教学实践,循序渐进地传授学生绘图方法,进一步组织小组协作学习,并引入考核机制,这些措施有效地激发了学生学习细胞生物学课程的兴趣,提高了教学效果。

关键词： Calponin   Cancer   Cell biological function   Isoform   Protein structure   亚型   癌症   类肌钙蛋白   细胞生物学功能   蛋白质结构   Calponin   Cancer   Cell biological function   Isoform   Protein structure   Language of Keywords: English   Chinese  

摘要： Calponin is an actin filament-associated regulatory protein expressed in smooth muscle and many types of non-muscle cells. Three calponin isoforms 1, 2, and 3 are encoded by three homologous genes CNN1, CNN2 and CNN3 in vertebrate species with cell type-specific expression and functions. Besides modulating the activity of smooth muscle myofilaments and contractility, calponin also regulates the functions of actin cytoskeleton in non-muscle cells during cell proliferation, adhesion, migration, differentiation, phagocytosis and fusion. This review focuses on the evolution, tissue and cell type-specific expression, structure-function relationships, transcriptional regulation and relevant mechanisms. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

关键词： 儿童患者   细胞生物学   原发性肾病综合征   尿源干细胞   生物学特征  

摘要： 第一部分 儿童原发性肾病综合征尿源干细胞分离培养技术研究　　目的：研究探讨建立儿童原发性肾病综合征尿源干细胞（urine-derived stem cells from pediatric patients with Primary Nephrotic Syndrome;p-USCs）分离培养技术方法。　　方法：通过离心、贴壁等方法体外分离培养p-USCs;使用光学显微镜观察细胞形态;利用CCK-8试剂盒绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞周期及p-USCs表面标志物表达;利用茜素红染色及油红O染色检测p-USCs成骨成脂分化潜能。　　结果：通过离心、贴壁等方法从 PNS 患儿尿液中成功分离出p-USCs;外观米粒样;呈对数生长;p-USCs表达间充质干细胞表面标志物CD24、CD29、CD73、CD90;少数P-USCs表达CD105;周细胞表面标志物CD146表达均呈阳性;造血干细胞标志物CD34表达均呈阴性;p-USCs经成骨成脂培养基诱导后;茜素红和油红O染色均呈阳性。　　结论：以上结果表明;本研究成功建立了PNS患儿p-USCs分离培养的方法;为探讨p-USCs用于儿童PNS早期肾损伤的诊断及难治性肾病的治疗研究提供前期技术方法。　　第二部分 儿童原发性肾病综合征尿源干细胞生物学特征研究　　目的：探讨原发性肾病综合征患儿尿源干细胞（urine-derived stem cells from Pediatric Patients with Primary Nephrotic Syndromin;p-USCs）生物学特征;比较p-USCs与正常儿童尿源干细胞（urine-derived stem cells from normal children;USCs）差异。分析在患儿体内环境影响下p-USCs的干性是否受损;为进一步利用自身尿源干细胞治疗患儿相关肾脏疾病奠定前期基础。　　方法：利用离心、贴壁等方法体外分离培养原发性肾病综合征患儿尿源干细胞（p-USCs）及正常儿童尿源干细胞（USCs）;对两者克隆数特点进行比较;使用光学显微镜观察p-USCs及USCs两种细胞形态差异;通过绘制生长曲线及检测细胞倍增时间分析比较两种细胞增殖能力;利用流式细胞术检测两种细胞凋亡、间充质干细胞表面标志物（CD24、CD29、CD34、CD73、CD90、CD105）及周细胞表面标志物（CD146）表达差异;Western blot检测两种细胞Pax2表达及自噬水平。　　结果：1、收集正常儿童尿源干细胞（USCs）15例;PNS尿源干细胞（p-USCs）14例。2、总克隆数/100ml 尿液：与正常儿童（14.85 ±10.85）相比;PNS单纯型患儿（52.13±62.52）有增加趋势;但无统计学差异;PNS肾炎型患儿（455.50±190.80）增加更明显（P<0.001）;PNS肾炎型较PNS单纯型患儿显著增加（P<0.001）;USCs克隆/100ml尿液：与正常儿童（4.25±3.60）相比;PNS单纯型患儿（21.46±21.86）有增加趋势;但无统计学差异;PNS肾炎型患儿（242.80±156.10）增加更明显（ P<0.001 ）;PNS 肾炎型较 PNS 单纯型患儿显著增加（P<0.001）。与正常儿童相比;PNS肾炎型患儿首次出现USCs克隆时间提前（P<0.05）。3、PNS单纯型组患儿尿液中发现两种形态USCs：p-USCs Ⅰ、p-USCs Ⅱ;p-USCsⅠ指形态与正常USCs相似;呈米粒样;胞体较小;排列紧密;p-USCs Ⅱ指少数细胞胞体可见少量空泡;胞体较大;散在排列。USCs、p-USCs Ⅰ及 p-USCs Ⅱ最多可传代数分别是：11代、8代及5代。4、与USCs相比较;p-USCs （p-USCsⅠ及 p-USCs Ⅱ）增殖减弱;p-USCsⅡ减弱更加明显。5、与 USCs相比较;p-USC（p-USCsⅠ及p-USCs Ⅱ）细胞凋亡率、间充质干细胞及周细胞表面标志物表达无明显差异。6、与USCs相比较;p-USCs Ⅰ表达Pax2有下降趋势;p-USCs Ⅱ表达Pax2减少更明显（P<0.01）;且p-USCs Ⅱ较p-USCs Ⅰ表达Pax2减少更显著（P<0.01）。7、与USCs相比较;p-USCs Ⅰ及p-USCs Ⅱ自噬水平下降（均P<0.01）。　　结论：1、PNS患儿尿源干细胞原代克隆数增加;提示尿源干细胞克隆数多少可能与肾脏疾病严重程度有关。2、PNS单纯型患儿体内环境可能影响PNS患儿尿源干细胞（p-USCs）增殖及自我更新能力;不影响p-USCs凋亡率、MSCs及周细胞标志物表达。3、受PNS单纯型患儿体内影响;部分 p-USCs Pax2 表达水平及自噬水平下调;可能参与

关键词： 外周血造血干细胞   微泡   免疫调节   造血  

摘要： 造血干细胞(hematopoietic stem cells)是一类异质性的、具有自我更新和多向血细胞分化潜能的成体干细胞。根据来源不同,其可分类为骨髓造血干细胞,脐血造血干细胞,胎肝造血干细胞和外周血造血干细胞。因外周血造血干细胞(Peripheral blood hematopoietic stem cells,PB-HSC)具有采集方法简便,短期内可重复采集,受者输注后造血、免疫功能重建快,且植入率高等优点,在移植和细胞免疫治疗方面发挥日益重要的作用。微泡(microvesicles,MV)是细胞分泌的亚微米双层膜结构,包括从内涵体分泌的外泌体,以及从绝大多数细胞膜表面分泌的微粒。其含有母体细胞的蛋白质、脂质、mRNA以及microRNA等成分,通过与其它细胞融合,将其内容物释放到靶细胞,影响其功能,从而在不同细胞间信息传递过程中发挥重要作用。微泡可由多种细胞分泌,并广泛分布于血浆、唾液、乳汁、汗液等各种体液中。不仅正常细胞可分泌微泡,肿瘤细胞也可以分泌微泡:在肿瘤病人的体液中可以检测到微泡。因此在生理和病理状态下,不同细胞分泌的微泡是一个混合的群体。微泡随着细胞的来源、数量、大小和抗原成分的变化而不同。外周血造血干细胞具有免疫调节,促进造血恢复等作用。因为微泡带有母体细胞的信息,所以我们推断外周干来源的微泡可能也具有同样的功能。而且研究表明,微泡没有或者具有很小的免疫原性,如果其具有一定的功能,可具有广泛的临床应用。但是,目前对外周血造血干细胞来源的微泡研究甚少。本研究旨在对外周血造血干细胞来源的微泡进行生物学特性探究,尤其对其免疫调节和促造血功能加以探索。研究目的提取并鉴定正常人外周血造血干细胞来源的微泡,并研究其生物学特性:包括探究正常人外周血造血干细胞来源的微泡的免疫调节功能及对造血集落形成的影响。研究内容将正常人外周血造血干细胞提取并培养,从培养上清中提取出外周血造血干细胞来源的微泡并鉴定,研究其生物学特性:探究正常人外周血造血干细胞来源的微泡对外周血单个核细胞是否具有免疫调节功能?及正常人外周血造血干细胞来源的微泡是否对造血集落形成有影响?研究方法(1)利用密度梯度离心法分离正常人动员后外周血造血干细胞,收集培养第48小时上清液,超速离心法分离提取微泡;(2)通过电子显微镜观察微泡形态;采用bicinchoninic acid(BCA)法标定微泡数量;采用流式细胞仪检测其表面标志物;(3)将微泡与正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PB-MNC)共培养12h后,通过共聚焦扫描电镜观察微泡与单个核细胞的作用方式;共培养48h后采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)法检测上清中IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,IFN-γ及TNF-α的分泌量;共培养48h后采用流式细胞仪检测T细胞亚群及T细胞激活变化;共培养48h后采用流式细胞仪检测不同亚群细胞胞内细胞因子染色情况;(4)采用甲基纤维素半固体培养基检测微泡及微泡与单个核细胞共培养48小时后上清液对外周血造血干细胞集落形成的影响。研究结果通过密度梯度离心法可提取出动员后外周血造血干细胞。利用超速离心法可成功提取出外周血造血干细胞来源的微泡。透射电子显微镜观察分离得到的微泡为卵圆形膜性小囊泡。流式细胞术测得微泡高表达其特异性标志CD63(85.86%),并带有其母体细胞标志如干细胞标志CD34(33.52%),T细胞标志CD3(43.98%)、CD45RA(23.54%)、CD45RO(68.3%),NK细胞标志CD56(32.32%)等。共聚焦扫描电镜显示微泡可以与外周血单个核细胞相融合并促进其分泌IL-6,IL-8,IL-10与TNF-α细胞因子。流式细胞仪检测结果显示T细胞亚群及T细胞激活无明显改变。胞内因子染色结果表明CD4+,CD8+,CD11c+细胞内因子无明显改变。集落培养实验表明微泡及微泡与单个核细胞共培养48小时后上清液很可能具有促进造血集落形成的作用。研究结论外周血造血干细胞来源的微泡具有免疫调节及可能促进造血集落形成的作用。

关键词： 金纳米颗粒特性   细胞毒性   自噬效应  

摘要： 纳米材料的生物安全性因其在医学诊断和治疗方面的广阔应用前景引起了人们的高度关注。纳米材料的生物学效应很大程度上会受到纳米材料特性如尺寸、形貌、表面修饰等的影响。目前针对这些特性的研究主要集中在纳米材料尺寸、表面修饰与细胞毒性方面,对于分散性这种特性的关注还比较少。此外,自噬效应与许多疾病的发生和发展密切相关,逐渐成为生物学领域的热门研究对象,因此深入研究这些特性与自噬效应的关系有助于为纳米材料的合成和应用提供科学指导。本文选取易于合成控制、生物安全性高的金纳米颗粒,全面探究了其尺寸、形貌、表面修饰和分散性这四种特性与细胞毒性和自噬效应的相关性,主要内容概括如下:第一章:简要概括了纳米材料特性及表征方法,总结了不同特性与细胞毒性和自噬效应方面的研究进展,并简要阐述本论文的选题依据和研究内容。第二章:探究分散性对细胞毒性的影响。选用12 nm DMSA修饰的金纳米颗粒,通过是否与培养基吹打混合来获得两组分散性显著不同的实验组。检测各项毒性指标,结果表明聚集的金纳米颗粒更显著地引发细胞毒性。聚集的金纳米颗粒通过巨胞饮进入细胞,有更高的细胞摄入量,并引发细胞内活性氧水平的增高。第三章:综合考虑四种纳米特性与自噬效应的关系。选用稳定表达GFP-LC3蛋白的HeLa细胞与具有不同形貌、相似体积的金纳米颗粒孵育。实验表明无论大尺寸组还是小尺寸组,柠檬酸钠修饰的金纳米球所引发的自噬水平显著高于金纳米棒,同时通过表面修饰、分散性和抑制剂都表明金纳米颗粒引发的自噬效应和细胞摄入量是高度正相关的。第四章:探究金纳米颗粒引发自噬效应的机理。通过免疫荧光,细胞切片等方法确定金纳米颗粒摄入细胞后基本位于溶酶体中。统计溶酶体的数目、尺寸、水解酶活性和线粒体的去极化程度,表明金纳米颗粒会导致溶酶体肿大,降低溶酶体水解酶的活性,因此降低了自噬溶酶体的降解速度,导致自噬体的积累。

关键词： 重度慢性牙周炎   牙髓细胞   细胞膜片   成骨能力  

摘要： 目的：利用重度慢性牙周炎患牙分离培养炎症牙髓间充质细胞;健康牙齿分离培养的牙髓间充质细胞作为对照组。体外进行MTT检测、与Bio-Oss骨粉复合培养、细胞膜片的制备、成骨诱导等相关检测，以对重度慢性牙周炎患牙牙髓中牙髓间充质细胞生物学特性初步研究。　　方法：在临床收集重度慢性牙周炎患者因牙周破坏严重需要拔除的松动牙齿，同时收集临床患者需要拔除的健康阻生智齿作为对照组，利用组织块法体外分离培养牙髓间充质细胞。待原代细胞培养成功后利用胰酶消化进行传代培养，P3-P4代细胞用于实验室研究。在细胞培养基中加入系列浓度的维生素C（0，10，20，40μg/ml），利用 MTT法检测其对细胞增殖的影响;将牙髓间充质细胞制备成1×106/ml的细胞悬液，细胞体外将牙髓间充质细胞与Bio-Oss骨粉复合培养，利用扫描电镜检测细胞与骨粉生物复合情况;利用 MTT检测结果选择最适浓度的Vc体外诱导细胞膜片的形成，扫描电镜及HE染色检测细胞膜片组织情况;在体外对牙髓间充质细胞进行成骨诱导，通过茜素红染色、ALP活性检测及qPCR检测重度慢性牙周炎对患牙牙髓组织中炎性因子和骨代谢相关基因表达的影响。　　结果：共收集25名重度慢性牙周炎患者拔除的患牙47颗，体外进行牙髓间充质细胞培养，细胞培养成功率为34/47（72%）;对照组共收集3位患者因阻生需要拔除的健康智齿进行牙髓间充质细胞培养，细胞培养成功率为100%。牙周炎组和健康组的原代细胞从组织块爬出的时间分别为7-14天和3-5天。MTT检测提示两组细胞增殖能力无明显区别，Vc对于牙髓间充质细胞的增殖影响具有浓度依耐性，当Vc浓度为20μg/ml时可明显促进细胞的增殖（P＜0.05），但是当Vc浓度增加到40μg/ml时，可明显抑制细胞的增殖（P＜0.05）。当细胞达到近融合后，利用20μg/ml的Vc对细胞进行连续培养2-3周后，两组细胞均可形成完整的细胞膜片。对两组细胞膜片倒置显微镜下观察、HE染色检测、扫描电镜检测可见细胞复层生长，细胞间紧密连接，有大量细胞间质保留，两组细胞膜片的镜下形态无明显区别。体外将细胞与骨粉复合培养一周后形成生物复合物，扫描电镜检测可见两组细胞均可以黏附生长于骨粉上，形态良好。对两组细胞进行体外成骨诱导，茜素红染色提示均可见明显的成骨结节;ALP活性检测提示其随着成骨诱导时间增加，其ALP活性增强。q-PCR检测两组细胞炎性因子和骨代谢相关基因提示：相对于健康牙髓间充质细胞，牙周炎组牙髓间充质细胞的 IL-1β，IL-6，IL-8,和TNF-α的mRNA相对表达量明显较高，差异有统计学意义（P＜0.001）。经成骨诱导后，两组细胞的成骨相关基因（ALP，OCN，BMP2，RUNX2）均出现明显上调（P＜0.05），组间比较发现，相对于健康牙髓间充质细胞，炎症牙髓间充质细胞的成骨基因表达较低（P＜0.05）。　　结论：因重度慢性牙周炎致牙周破坏严重无法保留的患牙，在体外依然可以分离培养出牙髓间充质细胞，且其与正常牙髓间充质细胞具有相似的增殖能力及形成细胞膜片能力;经与骨粉复合培养后能在骨粉上粘附生长;体外成骨诱导后，可形成明显的成骨结节，但与正常牙髓间充质细胞相比，其成骨能力较低。

关键词： 肺腺肿瘤   细胞侵袭   蛋白表达   病理细胞学  

摘要： 背景：非小细胞肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国人口恶性肿瘤死亡原因中排名第一，严重威胁人类的生存和健康。HIF2α(Hypoxia inducing factor2 alpha, HIF2α)是细胞应对缺氧时的关键转录因子，在生物体的生理以及病理过程中有着重要的作用。有研究表明PI3K/AKT信号通路参与细胞增殖、凋亡、分化，还可以影响非小细胞肺癌的发展。低氧是肿瘤微环境标志性特征，但是HIF2α和PI3K/AKT信号通路在非小细胞肺癌发生发展的过程中是否发挥作用以及发挥什么样的作用，目前尚未清楚。　　目的：⑴探讨HIF2α对非小细胞肺癌A549细胞的影响。⑵阐明PI3K/AKT信号通路对非小细胞肺癌A549细胞的影响。3.探寻HIF2α与PI3K/AKT信号通路在非小细胞肺癌A549细胞中的关系，从而为临床提高非小细胞肺癌患者的生存率提供新思路。　　方法：①LY294002(PI3K/AKT信号通路阻断剂)10μM处理前后的非小细胞肺癌A549细胞在常氧条件培养一定的时间。Western blot检测 PI3K/AKT信号通路相关蛋白 PI3K-P110β和GSK3β的表达情况。Cell Counting Kit-8(CCK-8)增殖实验检测PI3K/AKT信号通路对非小细胞肺癌细胞 A549生长情况的影响。Transwell小室基质侵袭实验检测PI3K/AKT信号通路对非小细胞肺癌细胞A549侵袭能力的影响。划痕损伤实验观察PI3K/AKT信号通路对非小细胞肺癌细胞 A549迁移能力的影响。统计软件采用SPSS22.0，P＜0.05认为差异有统计学意义。②LY294002(PI3K/AKT信号通路阻断剂)10μM处理前后的非小细胞肺癌A549细胞、A549-Ri hHIF2α细胞、A549-Control细胞在常氧条件培养一定的时间。采用 Western blot检测 PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K-P110β和GSK3β以及HIF2α的表达。Cell Counting Kit-8(CCK-8)增殖实验检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白以及HIF2α对非小细胞肺癌A549细胞、A549-Ri hHIF2α细胞、A549-Control细胞生长情况的影响。Transwell小室基质侵袭实验检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白以及HIF2α对非小细胞肺癌A549细胞、A549-Ri hHIF2α细胞、A549-Control细胞侵袭能力的影响。划痕损伤实验观察PI3K/AKT信号通路相关蛋白和HIF2α对非小细胞肺癌A549细胞、A549-Ri hHIF2α细胞、A549-Control细胞迁移能力的影响。统计软件采用 SPSS22.0，P＜0.05认为差异有统计学意义。　　结果：⑴PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002阻断非小细胞肺癌A549细胞Western blot检测显示：GSK3β的表达逐渐降低，于48h时最明显(P＜0.05有统计学差异)。PI3K-P110β的表达变化无统计学差异(P＞0.05)。 PI3K/AKT信号通路抑制前后，CCK-8增殖实验检测两组细胞的增殖速度为对照组＞实验组，差异有统计学意义(P＜0.05)。Transwell小室基质侵袭实验对照组、实验组两组细胞穿膜数分别为(353.25±11.9268)、(75.00±4.3970)个，差异有统计学意义(P＜0.05)。划痕损伤实验结果对照组、实验组两组细胞24h的迁移宽度分别为(130.823±2.6508)、(95.898±8.1910);48h四组的迁移宽度分别是(222.295±3.6343)、(122.688±4.8677)，有统计学意义(P＜0.05)。⑵PI3K/AKT信号通路阻断剂 LY294002阻断非小细胞肺癌 A549细胞、A549-Ri hHIF2α细胞、A549-Control细胞前后Western blot检测显示：GSK3β的表达降低(与对应的对照组比较， P＜0.05，差异有统计学差异)。PI3K-P110β以及 HIF2α的表达变化无统计学差异(与对应的对照组比较，P＞0.05，差异无统计学意义)。PI3K/AKT信号通路抑制前后，CCK-8增殖实验检测六组细胞的增殖速度为 A549组＞A549+LY组、A549-Ri hHIF2α组＞A549-Ri hHIF2α+LY组、A549-Control组＞A549-Control+LY组(P＜0.05)。Transwell小室基质侵袭实验A549组、A549-Ri hHIF2α组、A549-Control组、A549+LY组、A549-Ri hHIF2α+LY组、A549-Control+LY组六组36h穿膜细胞数分别为(353.25±11

关键词： EGCG   NB4细胞   凋亡   p38αMAPK   Bax   EGCG   NB4细胞   凋亡   SHP-1  

摘要： 第一部分 EGCG通过活化p38αMAPK-Bax途径诱导NB4细胞凋亡目的:本实验主要探讨EGCG是否能够诱导NB4细胞凋亡及其可能的分子机制。方法:分别用不同浓度的EGCG处理NB4细胞,或预先用p38αMAPK的抑制剂PD169316处理NB4细胞半小时,再用相应浓度的EGCG处理NB4细胞。用CCK-8方法测定NB4细胞增殖状况,用FITC-Annexin V/PI双染色法测定NB4细胞凋亡状况,用Western-Blot检测p38αMAPK、p-p38αMAPK、Bcl-2和Bax蛋白质的表达水平。结果:随着EGCG浓度的增加,CCK-8结果显示EGCG依赖浓度梯度抑制NB4细胞增殖;流式细胞术发现EGCG能够明显促进NB4细胞凋亡;同时Western-Blot检测发现p-p38αMAPK和Bax蛋白质表达水平升高,与EGCG浓度呈正相关,然而Bcl-2蛋白质表达水平随EGCG浓度升高而降低。在用p38αMAPK抑制剂处理后,CCK-8结果表明EGCG抑制细胞增殖的能力明显减弱,同时流式细胞术显示EGCG促进细胞凋亡的能力也减弱;Western-Blot结果显示Bax蛋白质表达程度降低,但Bcl-2蛋白质表达程度无明显变化。结论:EGCG可能通过活化p38αMAPK-Bax途径诱导NB4细胞凋亡。第二部分 EGCG通过SHP-1调节的p38αMAPK-Bax途径诱导NB4细胞凋亡目的:本实验主要观察EGCG是否通过SHP-1调节的p38αMAPK-Bax途径诱导NB4细胞凋亡。方法:分别用不同浓度的EGCG处理NB4细胞,或预先用SHP-1的抑制剂NSC87877处理NB4细胞半小时,再用相应浓度的EGCG处理NB4细胞。用CCK-8方法测定NB4细胞增殖状况,用FITC-Annexin V/PI双染色法检测NB4细胞凋亡状况,用Western-Blot检测SHP-1、p38αMAPK、p-p38αMAPK和Bax蛋白质的表达水平。结果:Western-Blot检测结果显示EGCG能够促进SHP-1蛋白质表达。预先用SHP-1抑制剂NSC87877处理后,SHP-1蛋白质的表达水平明显降低;同时CCK-8结果显示EGCG抑制细胞增殖的能力减弱,流式细胞术结果表明EGCG促进细胞凋亡的能力也减弱,Western-Blot检测结果显示p-p38αMAPK和Bax蛋白质表达水平随之减少,但p38αMAPK蛋白质表达水平无明显变化。结论:EGCG通过SHP-1调节的p38αMAPK-Bax途径诱导NB4细胞凋亡。

关键词： 树突状细胞   甘草多糖   单核细胞   T细胞   增殖活性  

摘要： 目的：树突状细胞(dendritic cells，DCs)是迄今为止发现的功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，可有效启动机体的特异性免疫应答。DCs在人外周血中含量甚微，利用体外培养和扩增DCs制备抗肿瘤DCs疫苗是当前研究的热点。甘草多糖(Glycyrrhiza polysaccharide，GPS)是从中药甘草中提取出的一类α-D-吡喃多糖，具有增强免疫和抑制肿瘤作用。本课题通过从人外周血获取单核细胞，并利用GPS将其诱导分化为DCs，研究GPS对DCs分化成熟、表型、活性的影响，以及GPS所诱导的DCs对T细胞增殖能力的影响，为进一步探讨GPS抗肿瘤治疗的药理研究提供理论依据。　　方法：通过密度梯度离心法及细胞贴壁培养法获取人外周血单核细胞;用含或不含GPS的常规细胞因子诱导法，对不同分组（因子组、甘草多糖组、联合组）的单核细胞进行体外诱导培养;使用倒置相差显微镜、瑞氏-吉姆萨染色法观察各组DCs的形态变化，采用Western Blot对比各组DCs标志物蛋白的表达差异;用尼龙毛柱法获取T细胞，通过混合淋巴细胞反应对比各组DCs对T细胞的增殖影响，并采用MTT法测定GPS对DCs活性的影响。　　结果：各组单核细胞体外培养均可诱导为DCs。形态学观察，各组细胞符合DCs形态学特征，以联合组DCs数量最多、体积最大、突起最显，细胞染色强于它组。Western Blot显示各组细胞标志物蛋白(CD80、CD40、CD83、CD86)均符合DCs表型特征，并随细胞成熟而表达增强，其表达量以联合组最为明显。混合淋巴细胞反应对比各组DCs对T细胞的增殖影响结果发现，联合组刺激增殖能力最强，且与它组相比均有统计学意义(p＜0.05)，而因子组与多糖组相比无显著差异。MTT法检测各组DCs的活性，当各组统一初始单核细胞量并诱导为imDCs后，结果显示联合组活性最强，与其它两组相比均具有显著差异(p＜0.05)，而因子组与多糖组活性相比无差异;当各组统一imDCs接种量并诱导为mDCs后，结果显示各组之间活性对比无明显差异。　　结论：GPS能诱导DCs的分化成熟，提高DCs的活性，并可促进T细胞的增殖能力，且协同细胞因子效果更佳。这为进一步从DCs角度探讨GPS增强人体免疫和抗肿瘤机制提供了研究基础。