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关键词： 正弦电磁场   软骨细胞   细胞形态   细胞生长   去分化   基因表达   正弦电磁场   软骨细胞   Lubricin   TGF-β/Smads信号通路   骨性关节炎  

摘要： 第一部分正弦电磁场对骨关节软骨细胞的软骨特征和形态学的影响及电磁场参数的确定目的:探讨正弦电磁场对大鼠骨关节软骨细胞的软骨特征和形态学的影响,并确定正弦电磁场作用的最佳参数。方法:1.大鼠骨关节软骨细胞的分离及培养:大鼠骨关节软骨细胞来源于SD大鼠关节软骨(Sprague Dawley,雄性,4-5周龄)。SD大鼠购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。***的构建及对细胞的刺激:SEMF由一对赫姆霍兹线圈,一个扩增器,一个波形发生器组合而产生。一个示波器用来显示波形的大小及形态。3.细胞活性检测:MTT法检测不同参数SEMF对大鼠骨关节软骨细胞增殖活性的影响,检测时间点分别为作用后第1d,3d,5d,7d,14d和21d。4.软骨细胞形态学观察:检测不同参数SEMF对骨关节软骨细胞形态学的影响,应用光学电镜以及鬼笔环肽染色了解软骨细胞形态及细胞骨架的改变。5.软骨细胞特征学观察:检测不同参数SEMF对骨关节软骨细胞的软骨特征的影响,分别检测软骨细胞总DNA、糖胺聚糖含量,通过RT-q PCR,Western-blot的技术检测相关软骨细胞特征分化基因(Ⅱ型胶原,聚集蛋白聚糖,SOX-9)以及去分化基因(Ⅰ型胶原)的表达变化情况。6.确定对软骨细胞影响的最佳正弦电磁场参数结果:实验结果显示不同参数SEMF对骨关节软骨细胞的软骨特征和形态学的影响存在差异。总体而言SEMF能够维持软骨细胞增殖活性,对软骨细胞总DNA含量、糖胺聚糖含量、以及相关软骨细胞特征分化基因具有积极的促进作用,对软骨细胞去分化基因有抑制作用。有利于维持软骨细胞形态及细胞骨架。其中以电磁场参数75Hz,2.3m T效果最为明显。结论:正弦电磁场对骨关节软骨细胞的软骨特征和形态具有积极的维持和促进作用,其中以电磁场参数75Hz,2.3m T效果最为明显。第二部分正弦电磁场对骨关节软骨细胞Lubricin代谢的影响及相关作用机制目的:探讨正弦电磁场(75Hz,2.3m T,SEMF)对大鼠骨关节软骨细胞lubricin代谢的影响及相关作用机制。方法:1.大鼠骨关节软骨细胞的分离及培养:大鼠骨关节软骨细胞来源于SD大鼠关节软骨(Sprague Dawley,雄性,4-5周龄)。SD大鼠购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。***的构建及对细胞的刺激:SEMF由一对赫姆霍兹线圈,一个扩增器,一个波形发生器组合而产生。一个示波器用来显示波形的大小及形态。3.细胞活性检测:MTT法检测不同作用时间SEMF对大鼠骨关节软骨细胞增殖活性的影响。4.检测SEMF对骨关节软骨细胞lubricin代谢的影响:通过RT-q PCR,Western-blot以及ELISA技术检测骨关节软骨细胞中lubricin在不同作用时间SEMF刺激下的表达变化情况。5.信号通路检测:RT-q PCR检测TGF-β1在不同作用时间SEMF影响下的表达情况;应用TGF-β1激酶抑制剂SB431542阻断TGF信号通路,检测骨关节软骨细胞中lubricin在SEMF刺激下的表达变化情况;以及应用Western-blot检测Smads蛋白了解TGF-β/Smads信号通路在SEMF刺激中的作用情况。结果:实验结果显示SEMF能够维持软骨细胞增殖活性、促进软骨细胞分泌lubricin,其效果随着暴露时间的延长呈正比。另外经过SEMF刺激以后TGF-β1合成也会增加。使用TGF-β1激酶抑制剂SB431542能够部分消除SEMF促进lubricin分泌的刺激作用。信号通路的研究提示SEMF能够促进Smad2的合成,但是对抑制性的Smads(Smad6和Smad7)的表达却没有观察到有影响。结论:SEMF能够维持软骨细胞增殖活性、促进软骨细胞分泌lubricin,效果与其作用时间呈正比。TGF-β/Smads信号通路部分参与到此生理效应过程中。据我们所知,本研究首次阐明了在SEMF作用下软骨细胞分泌lubricin的变化特点,为证实SEMF能够促进软骨细胞分泌lubricin提供了第一手研究资料。

关键词： 深低温冷冻   肌腱干细胞   肌腱缺损   同种异体肌腱移植   成肌腱分化  

摘要： 目的:探究深低温冷冻处理对大鼠髌腱组织中肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)的细胞存活率、细胞活力、细胞早期凋亡率、细胞迁移能力及肌腱相关基因表达的影响。方法:实验组将6只4月龄SD大鼠的髌腱组织取出,置入含有冷冻保护液的冻存管中,放入冰箱4℃中2小时,-80℃中过夜,投入液氮中保存一星期后取出进行细胞培养。对照组将相同条件的大鼠髌腱组织取出后不作任何处理直接细胞培养。无菌条件下将两组髌腱组织用I型胶原酶(3mg/ml,Sigma)消化获得有核细胞,分别用台盼蓝染色检测有核细胞存活率;结晶紫染色检测有核细胞克隆形成能力;同等条件下将细胞培养到第3代(P3),用Alamar Blue法检测肌腱干细胞体外增殖能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡状态;Transwell法检测细胞迁移能力;实时定量荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)检测细胞肌腱相关基因Coll α 1、Scx和Tnmd的mRNA表达。结果:与对照组相比,经深低温冷冻后的髌腱组织来源的有核细胞存活率下降,差异有统计学意义(P<0.05);实验组和对照组原代有核细胞中均有细胞克隆的形成,证实均可成功分离培养鉴定出具有克隆形成能力的肌腱干细胞,但髌腱组织经深低温冷冻后肌腱干细胞数量下降,差异有统计学意义(P<0.05);实验组及对照组肌腱干细胞(P3)培养14天过程中观察到细胞增殖活力相近,差异无统计学意义(P>0.05);同时,实验组和对照组第3代肌腱干细胞早期凋亡率、细胞迁移能力、肌腱分化相关基因表达量相近,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:深低温冷冻使大鼠肌腱组织内有核细胞的存活率降低,但肌腱组织仍保留大量有活性的干细胞。尽管实验组中肌腱干细胞的数量有所下降,但和对照组中肌腱干细胞相比,其细胞增殖能力(P3)、早期凋亡率、体外迁移能力及成肌腱分化能力未见明显异常。研究可为临床应用深低温冷冻保存的同种异体肌腱移植修复肌腱缺损提供相关的理论依据。

关键词： 师范类   细胞生物学实验   教学改革  

摘要： 细胞生物实验教学是理论与实践相结合的重要环节,是培养学生实验能力和科研创新能力的有效途径。本文通过改善细胞生物实验教学的现状;加强实验教学条件建设,增加实验教学学时;优化实验内容等几个方面入手,为提高师范类生物实验教学质量提供了可行的方案。

关键词： 大黄黄连泻心汤   附子理中丸   巨噬细胞表型   六神丸   胃癌  

摘要： 1 实验目的研究经典古方在体内、体外实验中通过肿瘤相关巨噬细胞对人胃癌MGC-803细胞增殖及皮下移植瘤的影响。2 实验方法2.1体外实验具体研究方法如下:①检测经典古方对人胃癌MGC-803细胞毒性及增殖抑制作用;②PMA诱导人白血病细胞THP-1和人淋巴瘤细胞U937向巨噬细胞分化,并用LPS和IL-4分别激活为M1型和M2型巨噬细胞,再用ELISA检测不同表型巨噬细胞IL-10和IL-12p70分泌情况;③将不同表型的巨噬细胞和MGC-803细胞共培养,检测其对MGC-803细胞的影响;④检测经典古方对巨噬细胞表型的影响。2.2体内实验具体研究方法如下:①建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型;②将造模一周后的裸鼠分为三批,每批分为对照组、中药低剂量组和中药高剂量组三组,三批分别给予大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸灌胃,连续灌胃28天,期间测量裸鼠体重及皮下移植瘤瘤径;③裸鼠麻醉后取材,测量瘤重及肿瘤长径和短径,计算抑瘤率;④通过免疫组化法检测肿瘤组织及瘤旁组织中 HIF-1α、IL-4、IL-10、IL-12、MCP-1、TGF-β1、TNF-α 的表达;⑤通过Western Blot检测肿瘤组织中Arg-1和iNOS的表达。3 结果3.1体外实验体外实验证明:①经典古方对MGC-803细胞均有毒性作用,大黄黄连泻心汤浓度≤50μg/ml,附子理中丸≤1000μg/ml,六神丸≤100ng/ml,48h后细胞存活率仍>80%;②经典古方排除毒性作用对MGC-803细胞的增殖均有抑制作用,大黄黄连泻心汤浓度≥10μg/ml,附子理中丸800～1000μg/ml有效,六神丸为100ng/ml有效;③M1型巨噬细胞较高表达IL-12p70、低表达IL-10,M2型巨噬细胞较低表达IL-12p70、高表达IL-10,Mφ型巨噬细胞介于两者之间,更倾向于M1型巨噬细胞;④M1型巨噬细胞抑制MGC-803细胞增殖,M2型巨噬细胞促进MGC-803细胞增殖,Mφ型巨噬细胞更倾向于M1型巨噬细胞,对MGC-803细胞增殖有轻度抑制作用;⑤经典古方对巨噬细胞表型有一定影响,大黄黄连泻心汤促进不同表型的巨噬细胞分泌IL-10,抑制其分泌IL-12p70,六神丸与之作用相反,附子理中丸促进Mφ、M1型巨噬细胞分泌IL-10,抑制其分泌IL-12p70,但对M2型巨噬细胞作用相反。3.2动物实验体内实验证明:①裸鼠一般情况随肿瘤负荷加重而变差,各批对照组在第10天出现精神不振,14天部分有脱肛现象,大黄黄连泻心汤、附子理中丸各剂量组与对照组基本一致,大黄黄连泻心汤初期可致裸鼠饮食减少、反应、活动降低,后可恢复,六神丸各剂量组裸鼠无明显精神不振现象,且裸鼠反应性、活动度增加;②各组裸鼠体重、皮下移植瘤体积稳步增加,期间存在上下波动,但差异无统计学意义(P>0.05);③按照大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸三批、每批按照低剂量组、高剂量组的顺序,各组抑瘤率分别为-9.20%、-13.83%、30.54%、5.84%、12.96%、55.77%,仅附子理中丸低剂量组和六神丸高剂量组与其对应对照组间瘤重的差异有统计学意义(P<0.05);④按照大黄黄连泻心汤、附子理中丸、六神丸三批、每批按照对照组、低剂量组、高剂量组的顺序,在各组肿瘤组织中HIF-1α的阳性表达率分别为80.2%、69.3%、65.4%、75.6%、96.5%、98.8%、78.4%、60.3%、64.2%,与各批对照组相比,各中药剂量组的差异均有统计学意义(P<0.01);IL-4 的阳性表达率分别为 63.24、63.7%、69.1%、67.7%、46.7%、41.1%、60.2%、46.0%、40.1%,与各批对照组相比,大黄黄连泻心汤高剂量组、附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义(P<0.01);IL-10的阳性表达率分别为76.3%、75.3%、76.5%、74.1%、75.9%、78.4%、78.7%、49.6%、51.9%,与各批对照组相比,六神丸各剂量组的差异有统计学意义(P<0.01);IL-12的阳性表达率分别为68.7%、68.4%、73.8%、62.2%、73.1%、78.4%、71.0%、80.4%、80.1%,与各批对照组相比,大黄黄连泻心汤高剂量组、附子理中丸、六神丸各剂量组的差异有统计学意义(P<0.05);MCP-1 的阳性表达率分别为 55.1%、56.9%、57.1%、54.6%、53.4%、53.2%、52.8%、70.2%、79.8%,与各批对照组相比,六神丸各剂量组的差异有统计学意义(P<0.01);TGF-β1 的阳性表达率分别为 52.0%、60.9%、69.4%、50.0%、51.4%、56.4%、51.3%、34.4%、30.3%,

关键词： NK92细胞   K562细胞   SENP1   细胞增殖   细胞凋亡  

摘要： 自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)细胞是一种是机体重要的免疫细胞,其增殖、成熟和存活等生物学特性受细胞内外复杂的信号调控。细胞信号分子的调控除了受磷酸化等调控外,蛋白水平的翻译后修饰也非常重要。小类泛素化修饰(small ubiquitin-like modifier,SUMO)蛋白化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰方式,影响细胞转录因子的活性和细胞信号的传导。SUMO特异性蛋白酶1(SUMO-specific proteinase 1,SENP1)是一个调控蛋白SUMO化的重要蛋白酶,能够促进SUMO的成熟和将SUMO分子与蛋白解离,通过调控细胞信号蛋白稳态而影响细胞的增殖、分化和周期。已知SENP1调控低氧诱导因子HIF等影响红系造血细胞的生成,但其对NK细胞生物学特性影响并不清楚。白细胞介素21(IL-21)是近年来新发现的一种细胞因子,主要由激活的CD4+细胞产生。NK细胞IL-21R在静息和激活状态下的NK细胞都有表达,IL-21对NK细胞的增殖和功能起到调节作用。但SENP1是否参与IL-21的信号转导及调控NK细胞的生物学特性作用有待阐明。本文从IL-21对NK细胞SENP1的表达调控及其对增殖、存活和杀伤活性等方面进行了阐述。研究目的:(1)观察IL-21对NK92细胞表达SENP1的诱导作用(2)检测干涉SENP1对NK92细胞凋亡、增殖的影响(3)探究干涉SENP1对NK92细胞杀伤活性的影响。研究方法:(1)在缺乏IL-2的培养体系中加入IL-21刺激NK92细胞,用CCK8试剂盒检测不同时间点细胞的增殖情况;用利用Annexin V-APC/PI标记检测细胞的凋亡;并使用qRT-PCR、免疫印迹的方法检测SENP1在NK92细胞中的表达情况。(2)使用携带Senp1-shRNA的慢病毒感染NK92细胞后,使用流式细胞仪以及荧光显微镜检测感染效率,并同时使用qRT-PCR、免疫印迹的方法确认干涉效率。(3)以感染对照病毒的NK92细胞为参照,使用慢病毒shRNA干涉Senp1后利用CCK8试剂盒检测不同时间点NK92细胞系的增殖情况,利用Annexin V-APC/PI标记细胞,流式细胞术检测干涉Senp1后NK92细胞凋亡。(4)使用慢病毒shRNA干涉Senp1后用qRT-PCR方法检测杀伤因子的表达。(5)将带荧光素酶标记的K562细胞与NK92细胞共培养,用荧光素酶报告基因的方法检测NK92细胞的杀伤活性。研究结果:(1)IL-21刺激能够明显上调NK92细胞表达SENP1,并且IL-21上调NK92细胞表达SENP1具有量效关系。(2)IL-21抑制NK92细胞的凋亡,能够减缓乏IL-2导致的NK92细胞死亡的数目,且与IL-21的浓度具有相关性。(3)与感染对照病毒NK92细胞比较发现,在感染慢病毒shRNA后,NK92细胞Senp1在mRNA表达降低,差异具有统计学意义;在蛋白水平中,SENP1的表达也受到了明显的抑制。(4)慢病毒感染细胞凋亡24h,Senp1干涉组细胞凋亡率与对照组比较,干涉Senp1可以促进NK92细胞凋亡。(5)使用CCK8方法检测细胞的增殖变化后发现干涉Senp1后可以显著抑制NK92细胞增殖,差异具有统计学差异。(6)与病毒感染对照组比较,Senp1干涉组NK92细胞对K562细胞的杀伤活性增强,颗粒酶B、IFN-γ表达降低,穿孔素的表达显著升高。结论:IL21能够提高NK92细胞表达SENP1,抑制NK92细胞的凋亡,减少乏IL-2导致的NK92死亡的数目。干涉Senp1不仅促进NK92细胞凋亡,还能抑制增殖,同时影响穿孔素表达和对肿瘤细胞的杀伤活性。

关键词： 中国细胞生物学学会   细胞生物学  

摘要： 所属学科:动植物微生物学,细胞生物学开始日期:2018-04-10结束日期:2018-04-13所在城市:江苏省南京市具体地点:南京国际博览会议中心主办单位:中国细胞生物学学会协办单位:南京大学-南京生物医药研究院、江苏省细胞与发育生物学会承办单位:医药生物技术国家重点实验室、模式动物与疾病研究教育部重点实验室、南京大学模式动物研究所、南京

关键词： 热塑牙胶   牙根表面温度   根管壁厚度   热刺激   NLRP3/Caspase-1炎症体通路  

摘要： 现代根管治疗理念要求根管彻底的消毒和严密的充填,与侧方加压充填技术相比,热垂直加压技术可以提供高密度的充填以及在根管口及根尖孔处良好的封闭性,尤其适用于形态复杂的根管,如不规则的狭部、侧副根管、弯曲根管、根管内吸收等。另外,作为牙胶的整体充填,避免了冷侧压充填容易出现的牙胶尖之间的空隙,并明显降低了牙胶与根管壁之间的缝隙,降低微渗漏问题[1,2]。然而,由于是热牙胶加压充填,在充填过程中由于加热引起牙根表面温度增加,从而有可能会对牙周组织造成损伤,这一问题始终是临床研究的热点。目前认为:10℃阈值是衡量这种充填技术是否安全的主要标准,若牙根表面温度升高超过10℃,则可能会对牙周组织造成不可逆性损伤[3]。许多研究表明,在使用已经商品化的根管充填设备以及温度设置进行根管充填时,可引起牙根表面温度升高6.5-22.1℃[4,5]。说明如果操作不当,就可能会因为根管充填时牙根表面的温度过高而损伤牙齿周围组织。牙周膜是致密的纤维结缔组织,用以连接牙骨质和牙槽骨,将牙齿“悬吊”于牙槽窝中,牙根表面的温度会直接传递给牙周膜,当牙周膜细胞受到热刺激后,细胞会发生一系列的胞内活动,应对热刺激等不良的应激刺激。然而热刺激对正常牙周膜细胞和炎症牙周膜细胞的生物学特性有何影响,相关的研究较少。我们之前有研究显示,牙周膜细胞中存在着炎症体(inflammasomes)以及炎症体通路,我们推测,热刺激时,牙周膜细胞的炎症体信号系统会出现相应的变化,然而这种变化是否会加剧患牙牙周炎的发展?是一过性的还是不可逆的?细胞内免疫系统的炎症体调控机制是如何进行的?这些都值得我们进一步探讨,以期根据临床现象为基础,从细胞学层面上为临床热塑牙胶充填系统的选择以及温度的控制提供参考。本实验共分三部分:实验一:B&L热塑系统充填时牙根表面温度测定分析收集获得117颗单根直根管离体牙,符合纳入条件60颗离体牙。分别在釉牙骨质界处水平截除牙冠,疏通预备根管,藻酸盐印模材料均匀包绕各牙根,分别在冠部、根中部、根尖上4mm位置留一检测孔,用以放置热电偶金属感应端。B&L热塑系统分别设置230℃、200℃、180℃温度根管充填。检测结果发现,根管充填时,三测量点牙根表面温度均升高,其中230℃充填时冠部、根中部、根尖上4mm位置表面温度平均升高值分别为:12.84℃、9.68℃、7.28℃;200℃充填时分别为10.37℃、8.76℃、6.67℃;180℃充填时分别为:9.42℃、8.63℃、6.61℃。不同充填温度导致牙根表面的温度升高值之间有统计学差异(P<0.05)。同一充填温度牙根表面三个测量点温度升高值之间有统计学差异(P<0.05)。结果提示,230℃、200℃充填时,在冠部牙根表面温度平均值升高超过10℃,应引起临床操作者注意。实验二:不同根管壁厚度在进行充填时牙根表面温度变化的差异分析60颗牙齿根管充填完成后,在上述三个监测点处截开牙根,测得根管壁厚度,并分组为1.0mm组(0.8～1.2mm)、1.5mm组(1.3～1.7mm)、2.0mm组(1.8～2.3mm)。分析不同充填温度、不同监测点和不同根管壁厚度的温度变化。结果显示,冠部根管壁厚度1.0mm组、1.5mm组和2.0mm组在230℃充填时牙根表面温度平均升高值分别为:13.74℃、12.25℃、10.23℃,200℃充填时分别为:10.77℃、9.98℃、8.73℃,180℃充填时分别为:9.86℃、9.08℃、8.57℃。冠部根管壁1.0mm组与2.0mm组厚度牙根表面温度升高值之间具有显著差异(P<0.05)。随着根管壁增厚,温度升高值降低。由此可看出,冠部根管壁厚度1.0mm组,230℃、200℃充填时,牙根表面温度升高超过10℃。因此建议对于根管壁较薄的牙齿,更应适当降低充填温度,避免对牙周组织造成不可逆性损伤。实验三:热刺激对正常和炎症牙周膜细胞生物学特性影响的初步探究本实验使用LPS和ATP刺激牙周膜细胞(PDLCs)来模拟炎症环境。取37℃培养第3～5代的人正常牙周膜细胞,分为八组:正常对照组、ATP刺激组、LPS刺激组、ATP+LPS刺激组、正常+热刺激、ATP+热刺激、LPS+热刺激、ATP+LPS+热刺激。5mmol/L ATP预刺激2小时后,加入终末浓度10ug/ml LPS刺激6小时,然后放入45℃孵箱中热刺激2小时。正常和炎症牙周膜细胞置于37℃和45℃孵箱中培养,测得6小时细胞活性曲线。结果显示,正常牙周膜细胞第2个小时开始,细胞生长活性明显降低;炎症牙周膜细胞第1小时细胞活性明显降低,第2小时细胞活性降至50%左右。ATP和LPS共同刺激后,qRT-PCR检测牙周膜细胞中NLRP3、caspase-1 mRNA及其相关炎性因子IL-1β、IL-18 mRNA表达量均呈现明

关键词： 细胞自噬   水通道蛋白   ROS转运   细胞生物学  

摘要： 目的：AQP1是位于不同细胞的膜蛋白，控制水的流入以及细胞体积，其在不同的器官中参与各种生理功能以及病理变化的作用。AQPs尚能转运其他小分子以及气体，包括二氧化碳，氨，一氧化氮和过氧化氢。过氧化物(O2-)分子是活性氧(ROS)的重要组成部分，是线粒体ATP合成的副产品，越来越多的证据表明ROS是细胞损伤甚至死亡的重要原因，参与各种生理过程，显然需要严格监管ROS的水平。自噬是细胞在缺乏能量及氧气等代谢条件下出现的生理过程，自噬可以将ROS降解从而避免细胞进一步的损伤。所以如何调控自噬的发生、发展将对于我们治疗疾病、维持身体机能有着重要意义。本实验在探讨碘乙酰胺(iodoacetamide，IA)通过导致细胞发生ATP转运障碍进而诱导Balb/c3T3细胞ROS的生成而影响水通道蛋白1(AQP1)的表达的基础上，进一步说明AQP1与ROS的关系。通过比较细胞内ROS水平及自噬的变化进一步说明AQP1与自噬的关系。　　方法：⑴应用IA(30μmol/L)造成细胞能量缺乏，作用于Balb/c3T3细胞0、4、6小时后，Western Blot检测AQP1的表达以及自噬标记物LC3Ⅱ、自噬流的改变。⑵NAC(2.5mmol/L)拮抗上述实验IA所造成的ROS的大量生成，DCFH-DA检测细胞内ROS的水平变化，同时Western Blot检测AQP1的表达。⑶应用AQP1特异装载的慢病毒感染HUVEC细胞使细胞AQP1过表达，用Western blot验证AQP1的表达。HUVEC细胞成功过表达AQP1后加IA(30μmol/L)模拟细胞内低氧环境，DCFH-DA检测细胞内ROS水平变化同时观察细胞功能变化。⑷用siRNA转染技术敲除Balb/c3T3细胞中的AQP1，应用Western-Blot检测AQP1转染是否成功。应用IA(30μmol/L)处理siRNA-AQP1转染成功细胞，Western-Blot检测自噬标记物LC3Ⅱ及自噬流的改变。　　结果：①利用IA模拟线粒体低氧环境导致细胞内ROS的大量产生，同时AQP1的表达量也大量增加，与IA处理时间成正比，各时间组有显著性差异(P＜0.05)。②利用抗氧化剂NAC拮抗IA模拟的低氧环境所造成的ROS的大量产生，结果表明ROS的生成量有所降低，且随时间改变更加明显，同时AQP1表达量随ROS生成量的降低而下降，差异有显著性(P＜0.05)。③利用特异性AQP1-慢病毒感染HUVEC细胞使AQP1过量表达，应用Western-Blot法验证，结果表明，AQP1过表达组较各对照组细胞AQP1表达显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。④HUVEC细胞过表达AQP1后，应用30μmol/L IA刺激细胞，模拟线粒体低氧环境，DCFH-DA检测ROS的产生量与正常细胞相比产生量显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。⑤利用siRNA转染技术特异敲除Balb/c3T3细胞中的AQP1，同时应用Western-Blot验证表达，差异有统计学意义(P＜0.05)。应用30μmol/L IA处理AQP1敲除的细胞，显微镜下观察处理4h后的细胞形态可见细胞明显变圆、皱缩，此时检测自噬标记物LC3-Ⅱ的表达，与对照组相比有显著上调，差异有统计学意义(P＜0.05)。6h后观察细胞大量死亡同时检测LC3-Ⅱ的表达与4小时相比，差异没有显著性(P＞0.05)。　　结论：⑴应用IA导致细胞内ROS的大量产生，应用抗氧化剂NAC拮抗IA所导致的ROS的大量产生，结果表明AQP1的表达量与ROS的增减成正相关，进一步说明AQP1对内源性ROS有转运作用。⑵利用特异性AQP1-慢病毒感染HUVEC细胞使细胞过量表达AQP1，在IA作用下，AQP1过表达组与正常组相比ROS的生成量显著降低，结合实验1进一步说明AQP1对ROS的转运起着决定性作用。⑶应用siRNA技术可以使Balb/c3T3细胞AQP1基因沉默，AQP1沉默组与正常组细胞在加入IA处理后，ROS的生成量有显著性增加，AQP1沉默组自噬的改变与各对照组相比有显著性差异，且发现随时间的变化各时间组自噬改变也有明显的差异，而正常细胞自噬随药物处理时间的变化没有差异，进一步说明AQP1有通过对内源性ROS的运输的功能，进而影响自噬的发生。

关键词： 内皮集落形成细胞   利那鲁肽   血管内皮生长因子   血管生成素   沉默信息调节因子1  

摘要： 研究背景及目的近年来糖尿病的发病率不断攀升,糖尿病血管并发症已严重威胁到糖尿病患者的生活质量。研究发现调节干细胞,替代、修复损伤细胞或者改变细胞生物学行为从而治疗或改善糖尿病血管并发症有着广泛的治疗前景。内皮集落形成细胞(ECFC)作为内皮祖细胞(EPCs)的一个亚型,在修复血管损伤、促进血管新生方面有着重要的作用。然而,在高糖情况下,ECFC的增殖、迁移、成管能力都有不同程度的损伤,但其具体机制尚不明确。最新的研究显示,利那鲁肽能够显著降低2型糖尿病患者的心血管患病风险,其在降糖、减轻体重等以外的作用机制还有待深入研究。因此,我们选择近年研究提示生物学活性更强的ECFC为对象,体外构建高糖模型,从检测ECFC的增殖、衰老、迁移、成管入手,探究其改变规律与沉默信息调节因子(Sirtuins)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Angiogenin)蛋白表达的关系;同时给予合适浓度利那鲁肽干预,探究利那鲁肽是否能通过Sirt1、VEGF、血管生成素调节ECFC的增殖、衰老、迁移、成管能力。研究方法实验首先采集健康成人外周血,利用密度梯度离心法分离获取人外周血中的单个核细胞,采用EBM-2全套培养基诱导培养出ECFC,并传代培养。分三组处理细胞,即正糖组(NG 5.5mmol/L D-葡萄糖×6d),高糖组(HG 30mmol/L D-葡萄糖×6d),渗透压组(OSM5.5mmol/L D-葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇×6d)。采用Ed U实验、β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)检测、Transwell实验、成管实验分别检测三组细胞的增殖、衰老、迁移、成管情况;采用免疫印迹法测定三组细胞Sirtuins(Sirt1-Sirt7)、VEGF、血管生成素蛋白表达水平;随后采用Western blot摸索高糖环境下(30mmol/L D-葡萄糖)利那鲁肽(Liraglutide)浓度梯度(0、25、50、75、100、125nmol/L)。在得到利那鲁肽干预最佳浓度后,分四组处理细胞,即正糖组(NG 5.5mmol/L D-葡萄糖×6d),正糖干预组(NG+Lira 5.5mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L Liraglutide×6d),高糖组(HG 30mmol/L D-葡萄糖×6d),高糖干预组(HG+Lira 30mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L Liraglutide×6d),以观察利拉鲁肽对细胞VEGF、血管生成素的蛋白表达水平和细胞的增殖、衰老、迁移、成管情况。研究结果1.与正糖组(5.5mmol/L D-葡萄糖)ECFC相比,高糖组(30mmol/L D-葡萄糖)细胞的增殖、迁移、成管能力下降,同时细胞衰老增加,差异具有统计学意义;且该变化与升高的渗透压浓度无关。2.与正糖组(5.5mmol/L D-葡萄糖)ECFC相比,高糖组(30mmol/L D-葡萄糖)细胞Sirtuins蛋白表达水平普遍下调,其中Sirt1、Sirt2、Sirt7差异具有统计学意义;VEGF和血管生成素的蛋白表达明显下降,差异均具有统计学意义;且该变化同样与升高的渗透压浓度无关。***经高糖(30mmol/L D-葡萄糖)+(0、25、50、75、100、125nmol/L Liraglutide)干预后,随着利那鲁肽浓度的升高,Sirt1的蛋白表达水平也呈升高趋势,从50 nmol/L时开始有统计学意义,且在100nmol/L时达到平台。4.与高糖组(30mmol/L D-葡萄糖)ECFC相比,高糖干预组(30mmol/L D-葡萄糖+100nmol/L Liraglutide)细胞VEGF和血管生成素的蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义;且细胞的增殖、迁移、成管能力提高,细胞衰老率下降,差异具有统计学意义;而正糖(5.5mmol/L D-葡萄糖)情况下,利那鲁肽则无此效应。结论1.高糖可加速ECFC衰老,引起增殖、迁移能力下降和血管生成障碍。***血管生成能力下降的同时,伴高糖诱导的Sirtuins、VEGF和血管生成素的表达下调3.利那鲁肽可显著改善高糖所致的ECFC衰老;增强增殖、迁移和血管生成能力,部分可能与上调Sirt1、VEGF和血管生成素的表达有关

关键词： 胶质瘤   骨髓间充质干细胞培养上清   细胞生物学   药理机制  

摘要： 背景：基于神经胶质瘤具有发病率高、局部易播散、术后易复发、临床治疗效果差、病死率高的特点。而骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-Mesenchymal stem cells,BM-MSCs)具有治疗神经系统性疾病的功能。　　目的：本实验从细胞的增殖、细胞的凋亡和细胞的侵袭三方面来观察人骨髓间充质干细胞培养上清液(Bone Marrow Mesenchymal stem cells conditioned medium,BMSCs-CM)对神经胶质瘤U87细胞的影响，从而探索BMSCs-CM对胶质瘤U87细胞是否存在抑制其细胞的增殖、促进其细胞的凋亡和抑制其细胞的侵袭的作用。　　方法：利用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM低糖培养基培养BMSCs与U87细胞和预先收集BMSCs-CM。CCK-8法检测细胞增殖抑制率：实验组加入U87细胞、BMSCs-CM，对照组加入U87细胞、不含FBS的低糖DMEM培养基，空白组不含任何细胞，只加入不含FBS的低糖DMEM培养基。流式细胞仪检测细胞的凋亡率：实验组加入BMSCs-CM,对照组加入不含FBS的低糖DMEM培养基。体外细胞划痕试验检测细胞的侵袭情况：实验组加入BMSCs-CM,对照组加入不含胎牛血清的低糖DMEM培养基。　　结果：实验组的U87细胞增殖明显受到抑制，凋亡率也明显增加，划痕修复试验则示实验组U87细胞24h后有少量细胞出现在划线区域，48h划线区域细胞并未见明显增加，以上结果均与对照组比较得出，有统计学意义。　　结论:BMSCs-CM具有抑制神经胶质瘤U87细胞的增殖、诱导U87细胞凋亡和抑制U87细胞侵袭的作用。这些研究发现为研究治疗胶质瘤的临床化疗药物方面提供了依据。