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关键词： 学习思维方式   问题表现   教学设计   教学方法  

摘要： 临床思维能力是医学院校培养学生的目标,以学生的学习思维方式设计课堂教学,培养学生掌握基础知识、更新知识的能力以及在实践中不断提高自身的专业技能,是实现这一教学目标的关键途径.文章针对目前教学中存在的突出问题、原因提出行之有效的课堂教学设计.以大学生的自主学习能力为核心,完成教师由传统的知识输出者转变为学生自主学习的指导者这一过程,使师生之间的关系更多地体现为合作与交流,使师生之间的课堂地位从传统的以教师为中心向以学生为中心的转移.

关键词： 细胞生物学   信号通路   乙酰化   分子机制  

摘要： 乙酰化是一种重要的翻译后修饰，在很多信号通路中都发现它的身影，尤其是在受体信号转导过程起到重要作用。本研究旨在探究乙酰化修饰是否参与调节与细胞增殖和分化相关的wnt和LIF等关键通路的上游信号。　　Wnt信号通路参与了多种生物学过程，包括但不限于胚胎发育，细胞的命运决定、分化以及很多疾病（包括癌症）的发生发展过程。在静息状态下，细胞中的β-catenin会被降解复合体降解，并维持在比较低的浓度。经典wnt信号通路激活时，可以抑制上述过程，使β-catenin在细胞质中积累。这一现象的机制还没有被完全揭示，并且存在很多未知的谜团。虽然科学家提出了各种各样的假说，大部分理论重点研究的是wnt信号一小时以上之后细胞以及蛋白质的反应。而wnt信号的起始在几十分钟之内就已经开始了。这一时间段里面，，迄今为止只有极少数的报道对它们做出了描述。　　另外一个在细胞分化过程中起到重要功能的通路是LIF-STAT3通路，LIF通过结合它的受体LIFR-GP130，激活下游STAT3。这一通路参与维持小鼠胚胎干细胞的自我更新，然而L2F受体不仅可以激活LIF-STAT3通路，还可以激活分化相关的MAPK等通路，关于LIFR如何在两种相反功能的激活状态切换一直悬而未决。　　在wnt通路中，分析了降解复合体内多种蛋白质的修饰状态，并发现了一个重要的骨架蛋白Axin1在第152位赖氨酸残基上的去乙酰化在wnt信号的顺利转导过程中起到了关键性作用。乙酰化修饰的Axin1可以促进β-catenin在静息细胞中的降解。这种修饰在细胞受到wnt信号刺激的时候会被SIRT4去除。Axin1的去乙酰化可以破坏Axin1与APC之间的相互结合，但是整个复合体的完整性并不受影响。在这种改变了构型的降解复合体中，β-TrCP无法识别磷酸化的β-catenin，所以β-catenin的降解也因此被抑制了。　　在LIF通路中，通过质谱分析结合序列比对，发现LIFR3K结构域上存在大量的乙酰化，乙酰化的3K结构域促进LIFR形成二聚体，并促进干细胞的自我更新。这种同源二聚体上还存在一种SPXX结构域，它的磷酸化会抑制STAT3的激活，而LIFR与GP130形成的异源二聚体则能够激活STAT3。在小鼠胚胎干细胞以及小鼠胚胎发育过程中证实了上述发现。　　因此，认为，Axin1在K152位的去乙酰化对调控经典wnt信号通路起到了至关重要的作用，Axin1的去乙酰化很可能是细胞对wnt信号做出的最早期的一批反应。也证明了乙酰化对于促进LIF-STAT3通路的重大作用，揭示了LIFR在受到LIF刺激的情况下是如何形成二聚体并激活下游通路的。对wnt和LIF信号如何起始，降解复合体以及LIF受体发生了什么变化提出了新的理论和假说，并且发现了持续性激活、持续性抑制wnt或者LIF信号的突变体。　　这一发现有为治疗结肠癌以及其他wnt信号失调导致的疾病提供了潜在的靶点和研究方向。关于LIF信号通路的研究对于研究干细胞和再生医学提供了良好的理论支持。

关键词： 白细胞介素-4受体   HepG2细胞   siRNA   信号通路  

摘要： 目的:检测沉默白细胞介素-4受体(Interleukin-4 receptor,IL-4R)基因对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响及潜在的作用机制。方法:1.用含IL-4的培养基体外培养HepG2细胞,设计并合成针对IL-4R基因的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)及空载siRNA,设置Normal组、Control siRNA组及IL-4R siRNA1、IL-4R siRNA2、IL-4R siRNA3转染组,利用阳离子脂质体法进行瞬时转染。2.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫蛋白印迹(Western blot)法分别检测转染24h和72h后,各组细胞中IL-4R在mRNA和蛋白水平中的变化,并以此筛选出干扰效果最佳的IL-4R siRNA序列用于后续实验。***8法、Transwell法用于检测沉默IL-4R基因后对HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。4.通过流式细胞学的方法检测下调HepG2细胞中IL-4R的表达对细胞凋亡和细胞周期的影响。5.运用Western blot法检测沉默IL-4R后,HepG2细胞中金属蛋白酶2(MMP2)、金属蛋白酶9(MMP9)及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,以及JAK1/STAT6、PI3K/AKT/mTOR、MAPK三条信号通路中各相关蛋白的表达。结果:***-PCR和Western blot检测显示IL-4R siRNA1组、IL-4R siRNA2组和IL-4R siRNA3组细胞中IL-4R的mRNA和蛋白水平均低于Normal组和Control siRNA组,且IL-4R siRNA3组下调最明显。***8法显示,沉默IL-4R可以使IL-4R siRNA3组中HepG2细胞的增殖能力较Normal组和Control siRNA组明显下降。***法显示,IL-4R siRNA3组中HepG2细胞的侵袭和迁移能力较Normal组和Control siRNA组显著受到抑制。4.流式细胞学检测显示,与Normal组和Control siRNA组相比,干扰HepG2细胞中IL-4R基因的表达可以促进细胞的早期凋亡,而不影响细胞周期的分布。*** blot检测结果显示,IL-4R siRNA3组中MMP2和Bcl-2的表达较Normal组和Control siRNA组显著下降,但MMP9蛋白的表达无明显变化。*** blot检测结果显示,与Normal组和Control siRNA组相比,IL-4R siRNA3组细胞中p-JAK1及p-STAT6蛋白的表达显著下降,PI3K、AKT、mTOR及JNK蛋白的磷酸化也受到明显抑制,但p-ERK1/2和p-P38蛋白表达的变化无统计学意义。结论:***-4R引起的信号传导不仅可以促进HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移,还可以抑制细胞凋亡,且对HepG2细胞迁移、侵袭和凋亡的影响至少部分归结于细胞中MMP2和Bcl-2蛋白表达的变化。***1/STAT6、PI3K/AKT/mTOR和JNK信号通路可能共同参与IL-4R对HepG2细胞生物学行为的影响。

关键词： 甲状旁腺激素   绝经后骨质疏松   骨髓间充质干细胞   增殖凋亡   多向分化  

摘要： 研究背景:绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO),又被称为Ⅰ型骨质疏松,是一种与体内雌激素水平缺乏有关的常见代谢性骨疾病。慢性牙周炎是PMO的常见伴发疾病,临床上表现为进行性牙周附着丧失和牙槽骨吸收,这对口腔正畸、种植、修复等学科的治疗有不同程度的影响。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)具有自我更新能力以及多向分化潜能,在不同的体外诱导条件下,能够分化为成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞等。因此,BMMSCs在骨组织代谢以及稳态平衡中发挥重要作用。有学者认为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)功能异常在PMO的发生发展过程中发挥重要作用。骨质疏松来源的BMMSCs增殖和成骨分化能力降低、但成脂能力升高,这与骨质疏松状态下骨髓腔中骨量减少脂肪量增加这一现象相符。甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是一种调节体内骨代谢的重要激素,具有促进骨形成和骨吸收的双重效应:大剂量持续给予PTH诱发骨吸收,小剂量间断给予PTH刺激骨生成。但相关作用机制尚不十分明确,这影响了PTH治疗骨质疏松的临床应用。以往PTH调节骨代谢的研究大多关注的是成骨细胞,关于PTH对BMMSCs的生物学特性影响,我们知之甚少。研究目的:本研究拟观察去势大鼠体内小剂量间断注射PTH后,骨髓微环境尤其是BMMSCs增殖分化等生物学特性的改变,从细胞水平揭示小剂量间断PTH促进骨形成的相关机制,从而为其临床应用提供更多的实验依据。研究内容:(1)研究小剂量间断PTH刺激对去势大鼠骨量和骨组织形态的影响;(2)研究小剂量间断PTH刺激对去势大鼠BMMSCs增殖凋亡特性的影响;(3)研究小剂量间断PTH刺激对去势大鼠BMMSCs多向分化能力的影响。研究方法:(1)通过卵巢切除法建立绝经后骨质疏松大鼠模型,去势术后6周开始皮下注射PTH1-34,持续5周。采用Micro-CT和组织染色相结合的方法对模型进行评估,并比较假手术组(Sham组)、去势组(OVX组)和去势后加PTH1-34组(OVX+PTH1-34组)的骨量和骨组织形态。(2)采用全骨髓贴壁法分离培养Sham组、OVX组、OVX+PTH1-34组BMMSCs,并从细胞形态学和细胞免疫分子表型等方面对获得的细胞进行鉴定。(3)通过流式细胞术、生长曲线、体外成骨成脂诱导分化实验,比较三组BMMSCs的生物学特性。研究结果:(1)通过Micro-CT扫描和三维重建,发现OVX组较Sham组骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(***)、骨表面积/骨体积(BS/BV)明显降低,同时骨组织HE染色可见OVX组大鼠骨小梁排列紊乱且数目减少,这提示骨质疏松动物模型构建成功。OVX加PTH1-34组骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(***)、骨表面积/骨体积(BS/BV)明显大于OVX组,同时骨组织HE染色显示OVX加PTH1-34组大鼠骨小梁数目较OVX组增加,排列也较规整,进一步证实了PTH1-34的促骨形成作用。(2)光学显微镜下可见三组BMMSCs均呈典型的纺锤形漩涡状细胞形态,但OVX组较Sham组BMMSCs细胞体积略大且更圆,OVX加PTH1-34组BMMSCs细胞形态更接近Sham组。流式细胞仪分析三组实验细胞均表达正常间充质干细胞表面标志物,不表达造血系细胞标志物,提示实验获取细胞是高纯度BMMSCs。(3)通过比较三组BMMSCs的生长曲线、S期细胞比例以及凋亡率发现,OVX加PTH1-34组BMMSCs的增殖能力较OVX组明显增强,凋亡率明显降低;三组BMMSCs成骨诱导后,ALP染色、茜素红染色、钙结节定量分析以及成骨相关基因检测显示,OVX加PTH1-34组BMMSCs成骨能力明显高于OVX组;成脂诱导后,油性O染色以及成脂相关基因检测显示OVX加PTH1-34组BMMSCs成脂能力明显低于OVX组。结论:(1)小剂量间断PTH刺激可以有效改善去势大鼠骨量和骨组织形态;(2)小剂量间断PTH刺激可以明显增强去势大鼠BMMSCs的增殖能力,并对其凋亡有一定的抑制作用;(3)小剂量间断PTH刺激可以显著增强去势大鼠BMMSCs的成骨分化能力,并可抑制其成脂分化能力。

关键词： 胆管肿瘤   一氧化氮合酶   酶抑制剂   肿瘤侵润  

摘要： 第一部分iNOS在人类胆管癌QBC939细胞系中的表达目的:研究iNOS受体在人胆管癌QBC939细胞系细胞中的表达情况。方法:体外培养人胆管癌QBC939细胞系细胞,免疫荧光法检测iNOS在胆管癌细胞中的表达情况。结果:胆管癌QBC939细胞系中iNOS受体异常表达。结论:人胆管癌QBC939细胞中表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。证明本课题组选用QBC939细胞系来进行后续体外实验的可行性。第二部分诱导型一氧化氮合酶抑制剂对胆管癌细胞生物学行为的影响目的:探讨诱导型一氧化氮合酶抑制剂（iNOS）对胆管癌细胞生物学行为的影响。方法:不同浓度iNOS抑制剂1400W孵育人胆管癌QBC939细胞24 h后,分别用硝酸还原酶法、MTT比色法检各组细胞中NO浓度与增殖情况,并计算半抑制浓度(IC50);根据IC50值,选择合适浓度的1400W处理QBC939细胞24 h后,分别用划痕试验、Transwell小室法检测细胞迁移及侵袭情况。以上实验均以未加1400W培养基处理的QBC939细胞为空白对照。结果:与空白对照组比较,各1400W处理组QBC939细胞中NO含量及增殖率均呈浓度依赖性降低（均P<0.05）,IC50值为51。24μmol/L;用50μmol/L的1400 W处理QBC939细胞24 h后,实验组的细胞划痕愈合率（61.7%vs.92.3%）和细胞侵袭数（72.7个vs.128.0个）均较对照组明显降低（均P<0.05）。结论:iNOS抑制剂1400w能抑制胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与NO下游的信号分子变化有关。

关键词： 脂肪间充质干细胞   羊膜间充质干细胞   分离培养   生物学特性   细胞治疗  

摘要： 畜禽遗传资源一直以来就是农业生产的基石,是人们生活的保障,它影响着社会与经济的发展,家养动物遗传资源理应受到重大的保护。干细胞所具有的自我更新和多向分化能力,为畜禽遗传资源的保护开辟了新思路。由于间充质干细胞所具有的优点,在遗传资源保护与利用、组织工程学等方面得到广泛认可。本实验以肉鸡脂肪和绵羊羊膜来源的间充质干细胞为实验对象,进行了细胞分离培养、生物学特性、诱导分化及移植治疗小鼠肝损伤的研究,得到以下结果:1.利用胶原酶Ⅰ分离得到肉鸡ADSCs,并在体外培养37代,主要呈现长梭形;经RT-PCR和免疫组化检测,细胞表达CD29、CD44、CD71和CD73,而不表达CD31,分离培养的确实是脂肪来源的MSCs。通过流式细胞仪分析,CD29、CD44、CD71和CD73在肉鸡ADSCs中高表达。ADSCs经历潜伏期、对数期、稳定期和衰亡期,生长曲线呈典型的“S"形,符合细胞在体外增殖的一般规律。群体倍增时间和克隆形成能力表明随着代次提高,细胞增殖能力减弱。通过细胞周期分析,发现G0/G1期的ADSCs所占的比率,随着传代次数的提升而提升,而S期的细胞比率逐渐减小。通过对ADSCs进行了诱导分化,分别在不同诱导条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞和肝样细胞,经过特异性染色、RT-PCR和免疫组织化学的证明,诱导形成的确实是目的细胞。验证了ADSCs的多向分化能力。2.利用胶原酶II和胰蛋白酶分离得到绵羊AMSCs,并在体外培养25代,主要呈现梭状;经RT-PCR和免疫组化检测,细胞表达CD29、Oct-4、CD71、CD44、Rex-1、CD90和CD73,分离培养的确实是羊膜来源的MSCs。通过流式细胞术分析,Oct-4、CD44、CD73和CD90在绵羊AMSCs中高表达。AMSCs经历潜伏期、对数期、稳定期和衰亡期,生长曲线呈典型的“S"形,符合细胞在体外增殖的一般规律。群体倍增时间和克隆形成能力表明随着代次提高,细胞增殖能力减弱。在体外对绵羊AMSCs进行诱导分化研究,在适宜的体外条件下,通过特异性染色、RT-PCR和免疫组织化学证明,绵羊AMSCs能分化成为成骨细胞、脂肪细胞和肝样细胞,验证了AMSCs的多向分化潜能。3.利用顺铂损伤小鼠肝脏,发现肝质地变硬,形态改变,有散在出血点产生;查看切片发现其正常构造被损害,纤维组织出现增生;血清学发现肝指标均表现明显的升高。将培养的ADSCs用荧光标记,经尾静脉注射到小鼠体内,发现ADSCs能定植到肝小叶中央静脉周围和肝小叶的结缔组织中,组织切片观察和血清学分析表明,ADSCs对肝损伤有一定的治疗效果。综上所述,本实验成功分离培养了肉鸡ADSCs和绵羊AMSCs,进行了生物学特性和诱导分化研究;细胞移植治疗肝损伤研究表明ADSCs能一定程度修复受损的肝。所示数据可得干细胞的生物学特点,对畜禽种质资源的保护和利用具有重要意义,并为MSCs在组织工程学和再生医学中应用提供实验依据。

关键词： 退变椎间盘   髓核   干细胞   生物学特性   间充质干细胞表面标志物  

摘要： 目的:运用组织块贴壁法从脊柱内镜微创手术摘除的退变椎间盘髓核组织中高效分离培养间充质干细胞样细胞,并从细胞形态、细胞表型、增殖能力、三系分化潜能、多能性基因和髓核细胞标志基因表达等方面对从不同个体退变椎间盘髓核组织样本来源的髓核干细胞(nucleus pulposus derived stem cells,NPSCs)进行深入研究。方法:组织块贴壁法高效分离人退变椎间盘髓核组织来源干细胞。将获得的细胞通过传代进行纯化和扩增培养,进行形态学观察,取第2代生长良好的干细胞,流式细胞术检测NPSCs表面标志物的表达情况,并进行成骨成脂分化潜能鉴定及成软骨分化潜能鉴定。分别取生长良好的第2代的不同个体退变椎间盘髓核组织来源的干细胞,利用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物、髓核细胞表面标志物CD24的表达,以及细胞周期和细胞凋亡情况。利用CCK8试剂盒(Cell Counting Kit,CCK-8)检测比较细胞活力,细胞计数法检测比较细胞的倍增时间,并绘制细胞生长曲线。qRT-PCR检测比较髓核细胞相关标志基因COL2A1、Aggrecan和SOX9,髓核干细胞标志基因Tie2,以及多能性基因NANOG和OCT4的表达水平。茜素红S染色法鉴定比较成骨分化潜能,油红O染色法鉴定比较成脂分化潜能。阿利新蓝染色法鉴定比较成软骨分化潜能。使用Image J软件计算向成骨成脂成软骨诱导分化后茜素红S、油红O和阿利新蓝染色定量分析。结果:组织块贴壁法分离的NPSCs,形态多为典型梭形细胞,少数为多边形或圆形;流式细胞术检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105呈阳性表达,细胞表面标志物CD11b、CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性表达;经过21天的成骨成脂成软诱导分化后,茜素红染色、阿利新蓝染色及油红O染色均呈阳性,说明NPSCs具有向成骨、成软骨和成脂肪诱导分化的能力。进一步对不同个体退变椎间盘髓核组织来源的干细胞比较研究发现,根据MSC特异性表面标志物的表达水平可分为两组:MSC表面标志物高表达组(H-NPSCs)和MSC表面标志物低表达组(L-NPSCs),流式细胞术检测结果显示CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表面标志物表达率均大于95%,与之相应的是其传代后的细胞形态均一,呈成纤维细胞样的长梭形。而L-NPSCs的MSC特异性表面标志物CD29和CD105表达率显著低于H-NPSCs,CD29的表达率为36.52±0.14%,CD105的表达率为46.58±0.15%,细胞形态表现多样性,除典型梭形细胞外,可见多边形或圆形出现。两组都不表达CD11b、CD14、CD24、CD34、CD45和HLA-DR(表达率低于1%)。CCK8检测的细胞活性和细胞周期结果表明:与L-NPSCs相比,H-NPSCs具有更强的增殖能力。与细胞周期结果分析一致,L-NPSCs中G0/G1和G2/M期停滞增加,S期的进入量低于H-NPSCs,细胞凋亡、细胞倍增时间结果分析表明H-NPSCs的凋亡率和倍增时间都要低于L-NPSCs。qRT-PCR检测这三种细胞髓核细胞标志基因COL2A1、Aggrecan、SOX9的表达情况显示:L-NPSCs的三种标志基因的表达量都显著高于H-NPSCs的表达量。髓核干细胞标志基因Tie2的表达情况显示:H-NPSCs的表达量的显著高于L-NPSCs的表达量。而多能性基因NANOG和OCT4的表达情况显示:L-NPSCs的表达量显著高于H-NPSCs的表达量。诱导分化后特异性染色检测显示,L-NPSCs的多向分化能力明显弱于H-NPSCs。结论:1.组织块贴壁法可从人退变椎间盘髓核组织中分离出间充质干细胞样细胞,表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达造血干细胞表面标志物CD11b、CD14、CD34、CD45和HLA-DR,并具有向成骨成脂及成软骨多向分化潜能。2.退变椎间盘髓核组织来源的NPSCs可根据其间充质干细胞表面标志物的表达水平分为高表达组(H-NPSCs)与低表达组(L-NPSCs)。与H-NPSCs相比,L-NPSCs的增殖能力、细胞活力和多向分化潜能明显减弱,而L-NPSCs的髓核细胞标志基因表达水平显著高于H-NPSCs。髓核干细胞的MSC表面标志物的表达水平与细胞增殖能力、多向分化潜能和髓核细胞特异性标志基因表达水平相关。

关键词： RAW264.7   Rac1   细胞增殖   细胞迁移   IL-1β   IL-6  

摘要： 目的:以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,分析RAW264.7细胞的Rac1表达水平,通过构建Rac1载体和特异性si RNA探讨其对RAW264.7细胞生物学活性的影响,为进一步探讨Rac1的免疫调节作用奠定良好的基础。方法:(1)经反转录法克隆Rac1的c DNA并构建Rac1基因表达载体p CDNA3.1-Rac1,酶切鉴定并进行序列测定验证。(2)用脂质体将重组质粒p CDNA3.1-Rac1和si RNA转入RAW264.7,Western blot技术检测Rac1的蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)测定Rac1 m RNA以及IL-1β、IL-6、IL-33和TNF-α的m RNA表达水平。(3)CCK-8法检测细胞的OD值来观察细胞的增殖情况。(4)Transwell法观察细胞的迁移能力。(5)流式细胞仪分析细胞表面膜分子CD80、CD86、MHCⅡ表达的改变。(6)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-33和TNF-α的蛋白表达水平。结果:(1)经测序等手段鉴定表明,Rac1载体构建成功,且将Rac1载体转入RAW264.7细胞可见其m RNA和蛋白表达均明显上调。(2)CCK-8法分析显示,随着Rac1的表达水平升高,细胞增殖能力增强。(3)Transwell结果表明,Rac1的表达水平与细胞迁移能力呈现正相关。(4)Rac1对RAW264.7细胞膜表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ类分子的表达没有明显影响。然而,Rac1抑制剂及其特异性si RNA却可上调上述三种膜分子的表达。(5)Rac1转染的RAW264.7细胞,IL-1β、IL-6的m RNA和蛋白水平均显著低于si RNA处理组及Rac1抑制剂组,而IL-33、TNF-α的表达各组之间没有显著差异。结论:Rac1的表达有助于RAW264.7细胞的增殖和迁移,并能显著抑制IL-1β和IL-6的表达,而对细胞的抗原提呈作用无显著影响。

关键词： 白血病   细胞生物学   RUNX1蛋白   KLF4蛋白   LSD1抑制剂   抗白血病作用  

摘要： 本文主要从以下几个部分展开论述：　　第一部分 转录因子RUNX1与KLF4相互作用及转录调控对t(8;21)白血病细胞生物学功能的影响　　研究目的:实验室前期用组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(PB)诱导t(8;21)白血病细胞系Kasumi-1分化、凋亡时发现，RUNX1、KLF4和P57的表达水平明显升高，且通过生物信息学分析发现三者之间可能存在转录调控关系及蛋白质相互作用。本研究旨在分析RUNX1、KLF4和P57之间的相互作用关系，并通过体外、体内实验探讨RUNX1、KLF4和P57在t(8;21)白血病细胞中的生物学功能。　　研究方法:实时定量PCR技术和Western Blot技术检测PB处理Kasumi-1细胞后RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表达变化。构建包含RUNX1结合位点的KLF4启动子/增强子报告质粒和包含KLF4结合位点的P57启动子/增强子报告质粒，双荧光素酶报告基因系统分析RUNX1、RUNX1-ETO对KLF4的转录调控作用以及KLF4对P57的转录调控作用，并应用Western Blot技术在蛋白水平进行验证。免疫荧光共聚焦和免疫共沉淀技术检测转录因子RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4的共定位以及蛋白质相互作用，明确具体的结合结构域，并进一步探讨PB能否抑制RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4的结合。双荧光素酶报告基因系统分析RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4结合对KLF4转录调控功能的影响。构建RUNX1、KLF4和P57的慢病毒表达载体，包装病毒，感染Kasumi-1细胞，研究上述基因过表达对t(8;21)白血病细胞增殖、周期、凋亡和分化等生物学功能的影响。构建KLF4和P57逆转录病毒表达载体，包装病毒，感染t(8;21)白血病小鼠的骨髓白血病细胞，流式细胞仪分选阳性细胞，移植受体小鼠，研究KLF4和P57过表达对t(8;21)白血病小鼠发病率和生存期的影响。　　研究结果:PB处理Kasumi-1细胞后，RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。RUNX1以剂量依赖性的方式激活KLF4启动子/增强子报告质粒，而RUNX1-ETO对KLF4启动子/增强子报告质粒的转录激活作用明显减弱。KLF4对P57启动子/增强子报告质粒亦存在剂量依赖性的激活作用。在细胞系中过表达RUNX1可以上调KLF4和P57的蛋白表达;而过表达RUNX1-ETO对KLF4和P57的蛋白表达无明显影响;过表达KLF4，P57的蛋白表达升高。RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4均存在蛋白质相互作用，且共定位于细胞核内。RUNX1通过RUNT同源结构域(Runt homology domain，RHD)与KLF4结合，RUNX1-ETO除了通过RHD还通过ETO部分与KLF4结合。RUNX1-ETO竞争性地抑制野生型RUNX1与KLF4的结合，组蛋白去乙酰化酶抑制剂PB不影响RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4的结合。RUNX1与KLF4结合促进KLF4对下游靶基因的转录激活，而RUNX1-ETO与KLF4结合对下游靶基因转录并无明显的促进作用。在t(8;21)白血病细胞中过表达RUNX1、KLF4和P57均能抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡，此外，KLF4还具有诱导白血病细胞分化的生物学功能。体内实验结果表明，KLF4和P57过表达可以降低t(8;21)白血病小鼠的发病率。　　研究结论:本研究发现了t(8;21)白血病细胞系中RUNX1→KLF4→P57新的调控信号通路，RUNX1通过转录激活KLF4进而激活P57抑制t(8;21)白血病细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡。而当RUNX1发生染色体易位形成RUNX1-ETO融合蛋白时，上述作用消失。此外，RUNX1还通过与KLF4发生蛋白质相互作用，进一步增强KLF4对下游靶基因的转录激活，上述作用可以被RUNX1-ETO竞争性地抑制。本研究阐明了转录因子RUNX1与KLF4之间的作用关系以及RUNX1-ETO融合蛋白对这种作用关系的影响。　　第二部分 新型LSD1抑制剂JL1037的抗白血病作用及其机制研究　　研究目的:组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)在白血病中高水平表达且与预后不良相关，敲降LSD1的表达或药物抑制LSD1的活性可以显著降低白血病干细胞的集落形成能力，延长白血病小鼠的生存时间。因此，设计并合成高效低毒的LSD1抑制剂有望成为白血病治疗的新策略。JL1037是一个高效、高选择性、可逆性的新型LSD1抑制剂，本研究旨在探讨该化合物在体外和体内对于白血病细胞的杀伤作用以及相关分子机制。　　研究方法:实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LSD1在白血病细胞系和正常人骨

关键词： 口腔鳞状细胞癌   前列腺素E2   细胞生长   EP4受体  

摘要： 口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一,其发病率在全球呈现逐年上升的趋势。在过去的20年中,尽管针对OSCC的治疗方法不断发展,但OSCC的五年生存率无明显改善,因此发病机制、诊断及治疗仍是OSCC的研究热点。近年来,肿瘤微环境中炎症与恶性肿瘤关系的研究备受关注,尤其是环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)通路在介导炎症和癌症关系中的作用值得深入探究。研究表明,COX-2过表达与口腔癌的发生、侵袭以及化疗药物的耐药性相关,而针对COX-2的非类固醇消炎药(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可以抑制恶性肿瘤的发生发展,但它的长期使用会产生诸多副作用如胃溃疡和心肌梗死等,临床应用受限。前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)是COX-2通路的下游产物。研究表明,PGE2能促进多种恶性肿瘤的增殖及侵袭,其机制可能为抑制局部免疫反应。然而,PGE2及其受体4亚型(E-prostaglandin,EP4)对OSCC生物学特性的影响及机制尚未完全明了。为此,我们通过在OSCC细胞株中外源性添加PGE2及相应的拮抗剂来研究PGE2对OSCC细胞增殖及凋亡的影响并探讨其可能的机制,从而寻找OSCC治疗的潜在靶点。(1)我们采用cellcounting kit 8(CCK8)法检测外源源性PGE2对OSCC细胞株Tca8113增殖活性的影响,发现在作用48 h时,PGE2能显著地促进细胞增殖,效应呈现剂量依赖趋势,且在PGE2浓度为1.0μmol/L时出现峰值。(2)采取Western-blot(WB)的方法研究PGE2促Tca8113细胞增殖的作用机制,我们发现,外源性添加PGE2可激活ERK的磷酸化,而磷酸化过程可被MEK的抑制剂U0126拮抗;通过CCK8检测Tca8113细胞增殖,我们发现,外源性的U0126能拮抗PGE2对Tca8113细胞增殖的促进作用;上述结果表明PGE2可通过激活ERK的磷酸化促进Tca8113细胞的增殖。(3)WB法检测显示,4种类型的EP受体在Tca8113细胞中均有表达。(4)为确定与PGE2结合的EP受体类型,我们分别加入EP1、EP2及EP4受体拮抗剂,结果表明,EP4拮抗剂L-161,982可拮抗PGE2对Tca8113细胞的增殖作用,并呈现剂量和时间依赖性;进一步采用WB法检测,我们发现,L-161,982通过抑制PGE2对ERK磷酸化的促进作用,从而发挥拮抗作用,这也同样验证了 PGE2是通过激活ERK的磷酸化来促进细胞增殖。(5)为了进一步验证PGE 2是否通过结合受体EP4而起作用,我们在细胞中加入3种类型的EP受体激动剂,结果发现,仅有EP4激动剂PGE1-OH可以恢复被塞来昔布预处理的Tca8113细胞的增殖,并具有浓度依赖性趋势;进一步采用WB法,我们发现,PGE1-OH通过激活ERK磷酸化来促进细胞增殖,而MEK的抑制剂U0126可抑制此作用,提示PGE2可能通过结合受体EP4来促进细胞增殖的。(6)流式细胞仪检测显示,L-161,982可以诱导Tca8113细胞凋亡,并通过阻断s期来影响细胞周期,其作用具有浓度依赖趋势;WB法进一步检测发现,L-161,982通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白水平来诱导细胞凋亡,同时通过上调P21和下调CDK2及CyclinA2的蛋白表达影响细胞周期。综上所述,本研究发现PGE2可通过结合受体EP4来介导ERK磷酸化诱导的细胞增殖,并影响细胞凋亡及周期,因此,EP4受体可能成为OSCC的治疗靶点。