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关键词： 成年小鼠   原代皮肤成纤维细胞   酶消化法   组织块贴壁法  

摘要： 目的:建立一种周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法,并探索其生物学特性。方法:取8~12周龄BALB/c小鼠背部、尾尖、耳部皮肤,配制2种血清的细胞培养液,采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度;通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别。结果:背部皮肤组织块贴壁使用Gibco胎牛血清培养7 d无细胞游出,CLARK特级胎牛血清细胞游出较多。背部皮肤经酶消化法得到细胞贴壁少;经组织块贴壁法细胞生长慢,培养周期长;酶消化组织块贴壁法细胞游出速度快、数量多、呈长梭形。尾尖取材量少,得到细胞少;耳部皮肤取材方便,但细胞纯度低。CCK8增殖曲线呈S型;相较于对照组,UVB辐照后细胞凋亡率增高17%。结论:CLARK特级胎牛血清、背部皮肤取材、酶消化组织块贴壁法是培养成年小鼠原代皮肤成纤维细胞最优的方案,可增加细胞得量、缩短培养周期,降低成本。

关键词： 肝细胞癌   BEL-7404细胞   锌  

摘要： 目的:观察外源锌对原发性肝细胞癌(HCC)BEL-7404细胞生物学行为的影响。方法:应用TSQ锌离子荧光探针、MTT法、DNA倍体法、吖啶橙/溴乙啶双荧光染色法和Transwell小室法分别检测不同浓度硫酸锌刺激下BEL-7404细胞内锌离子含量、细胞活力、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移和侵袭能力的变化。应用real-time PCR和Western blot法分别检测不同浓度锌离子对BEL-7404细胞白蛋白的mRNA和蛋白表达的影响。结果:随着培养环境中锌离子浓度的升高,BEL-7404细胞内的锌离子含量增加,细胞的存活率和细胞迁移与侵袭能力降低,凋亡率升高(P<0.05);G0/G1期细胞比例降低,G2/M期细胞比例升高(P<0.05);细胞白蛋白的mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05)。结论:外源性给予锌离子可抑制HCC细胞的活力、迁移与侵袭能力,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期在G2/M期,并可能降低细胞的恶性表型。

关键词： 地西他滨   A431   增殖   凋亡   转移  

摘要： 目的检测地西他滨对A431细胞生物学功能的影响并初步探讨其机制。方法将0、5、10和20μmol/L的地西他滨分别作用于A431细胞,通过MTT法观察地西他滨对细胞增殖的影响,通过Western blotting和实时PCR检测地西他滨作用于A431细胞后细胞增殖相关蛋白Cyclin B1、PCNA和CDC2的改变。通过Hoechst 33258染色检测0、5和10μmol/L地西他滨对A431细胞凋亡状态的影响,采用Western blotting和实时PCR检测地西他滨对A431细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的影响。采用transwell实验检测细胞侵袭转移情况,并通过Western blotting和实时PCR检测0、5和10μmol/L的地西他滨对侵袭转移相关蛋白MMP2的影响。结果 MTT检测发现,5、10和20μmol/L的地西他滨作用于A431细胞24 h后对细胞增殖的抑制率分别为(43.81±1.53)%、(48.64±4.65)%和(50.69±4.99)%,随着药物的浓度增加,对A431细胞的增殖抑制率显著增加(P<0.05)。Hoechst 33258染色发现,地西他滨可以显著促进细胞凋亡,transwell实验也证明地西他滨可以明显抑制A431细胞的转移能力。Western blotting和实时PCR结果显示,地西他滨影响A431细胞中Cyclin B1、CDC2、PCNA、Bax、Bcl-2和MMP2蛋白及m RNA水平,地西他滨处理组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论地西他滨对外阴鳞状细胞癌的生物学功能有很强的抑制作用,可以作为治疗外阴鳞状细胞癌的化疗药物。

关键词： Girdin基因   肝癌   增殖   凋亡   酪氨酸激酶2/信号转导与转录激活因子3信号通路  

摘要： 目的观察Girdin基因在肝癌细胞表达及抑制其表达对癌细胞增殖、凋亡的影响。方法Western blot检测人正常肝细胞HL-7702及肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H、HCCLM3细胞Girdin的蛋白表达；Girdin的小干扰RNA（siRNA）通过Lipofectamine？2000转染HCCLM3细胞，并设置阴性对照组和空白对照组，收集转染48 h的细胞，Western blot检测Girdin、细胞核增殖抗原（Ki-67）、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）家族含Caspase-3、B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）家族促凋亡基因bcl-2相关X蛋白（bax）及酪氨酸激酶2（JAK2）/信号转导与转录激活因子3（STAT3）通路磷酸化的酪氨酸激酶2（p-JAK2）、磷酸化的信号转导与转录激活因子3（p-STAT3）的蛋白表达；细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测转染的24、48、72 h各组细胞的活力；流式细胞术检测转染48 h的细胞凋亡率。结果Girdin在HepG2（0.355±0.043）、HCCLM3（0.599±0.068）、MHCC97H（0.462±0.055）、Huh7（0.378±0.049）肝癌细胞中的表达均显著高于在正常肝细胞HL-7702（0.112±0.013）的表达（PHepG2＝0.001；PHCCLM3＝0.000；PMHCC97H＝0.000；PHuh7＝0.001）；Girdin-siRNA组在24 h（0.247±0.032）、48 h（0.477±0.043）和72 h（0.666±0.073）的细胞活力均显著低于空白对照组（0.385±0.045）、（0.711±0.068）、（0.936±0.096），在48 h的细胞凋亡率（16.18±1.38）%显著高于空白对照组（1.87±0.39）%，Ki-67（0.162±0.019）、p-JAK2（0.096±0.011）、p-STAT3（0.057±0.009）蛋白表达显著低于空白对照组（0.626±0.073）、（0.170±0.021）、（0.145±0.018），Caspase-3（0.257±0.032）和bax（0.279±0.032）的蛋白表达显著高于空白对照组（0.120±0.013、0.135±0.015）（PKi-67＝0.000；Pp-JAK2＝0.006；Pp-STAT3＝0.002；PCaspase-3＝0.002；Pbax＝0.002）。结论Girdin基因在肝癌细胞高表达，通过RNA干扰抑制其表达通过下调JAK2/STAT3信号降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡。

关键词： 涎腺   腺样囊性癌   放疗敏感性   miRNA-21  

摘要： 目的:研究放疗对人涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83和SACC-LM的影响以及与miRNA-21表达的相关性。方法:用Varian 23 EX对培养中的SACC-83和SACC-LM予从0(对照)、2、6、10 Gy照射,CCK-8检测、流式细胞仪观察放射处理后SACC-83、SACC-LM的细胞增殖和凋亡的变化;使用qRT-PCR法分析不同剂量放疗后SACC-83、SACC-LM细胞miRNA-21的表达变化。结果:SACC-LM细胞放射处理48 h后增殖能力随放疗剂量的增大而降低(F=1321.646,P=0.000),早期凋亡率(F=354.484,P=0.039)、晚期凋亡率(F=254.278,P=0.042)和异倍体比例(F=1562.991,P=0.001)随着放疗剂量的增大而升高,且miRNA-21的相对表达量随放疗剂量的增大而减小(F=177.964,P=0.011);SACC-83细胞放疗48 h后6 Gy放疗组细胞增殖能力明显低于其他各放疗组(F=1537.214,P=0.013),6 Gy剂量下早期凋亡率(F=88.579,P=0.006)、晚期凋亡率(F=1391.345,P=0.033)、异倍体比例(F=250.461,P=0.004)最高,miRNA-21的相对表达量最低(F=134.868,P=0.017)。结论:miRNA-21可能与SACC-LM、SACC-83细胞的放疗敏感性呈负相关。

关键词： 人羊膜上皮细胞   生物学特性   免疫调节功能   细胞治疗   组织再生  

摘要： 人羊膜主要是由上皮层、致密层、纤维母细胞层、海绵层以及基底膜构成,属于胎儿附属物之一。而人羊膜上皮细胞主要来源于上皮层,是经胚胎内细胞团发育而成。此外,人羊膜上皮细胞是一种处于特殊分化阶段的干细胞,其在特定的环境中可向三个胚层组织分化,同时还表现出独特的免疫调节功能,提示了其在细胞治疗和组织再生等领域具有广阔的应用前景,可能成为重要的组织来源之一。且随着临床上对人羊膜上皮细胞的生物学特性以及免疫调节功能研究的逐渐深入,其在相关疾病治疗方面的应用价值也日益凸显。鉴于此,本研究通过对近年来人羊膜上皮细胞的生物学特性以及免疫调节功能的研究进展进行综述,目的在于为相关领域的研究提供参考依据。

关键词： 胃肿瘤   细胞迁移   肿瘤侵袭   瓣状核酸内切酶1  

摘要： 目的 探讨瓣状核酸内切酶1（FEN1）小干扰RNA（FEN1 siRNA）对胃癌细胞生物学特性的影响及机制.方法 培养胃癌细胞SGC7901,转染FEN1 siRNA和阴性对照序列（siRNA control）分别命名为干扰组和NC组,同时以不做处理的胃癌细胞SGC7901作为对照组.采用实时荧光定量PCR和Western blot检测FEN1 siRNA的转染效果,细胞划痕实验检测胃癌细胞SGC7901迁移能力,Transwell小室检测胃癌细胞的侵袭能力,Western blot检测胃癌细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、β-连环蛋白（β-catenin）的蛋白相对表达水平.结果 干扰组细胞中FEN1 mRNA和蛋白水平明显低于对照组及NC组,差异均有统计学意义（P值均〈0.01）,而NC组细胞中FEN1 mRNA和蛋白水平与对照组比较,差异均无统计学意义（P值均〉0.05）.干扰组细胞迁移能力、侵袭能力及MMP-2、MMP-9、β-catenin蛋白相对表达水平均明显低于对照组及NC组,差异均有统计学意义（P值均〈0.01）;而NC组细胞迁移能力、侵袭能力及MMP-2、MMP-9、β-catenin蛋白相对表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义（P值均〉0.05）.结论 转染FEN1 siRNA能够抑制胃癌细胞中FEN1的表达,可抑制胃癌细胞的迁移能力、侵袭能力,其作用机制可能与抑制MMP-2、MMP-9、β-catenin蛋白的表达水平有关.

关键词： 口腔鳞状细胞癌   微小RNA   miRNA-182  

摘要： 目的检测microRNA-182(mi R-182)在口腔鳞癌组织中的表达,探讨miR-182对口腔鳞癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法收集2015年7月~2016年10月哈尔滨医科大学附属口腔医院住院患者10例鳞状细胞癌标本和配对组织,实时荧光定量PCR方法检测miR-182 m RNA在口腔鳞癌组织中的表达水平。培养舌鳞状细胞癌细胞系TCA8113,分四组:空白对照组(Control组)、空载体组(Vehicle组)、阴性对照组(miR-182-NC组)和miR-182-inhibitor组(miR-182-i组)。利用MTT法和Transwell小室方法分别检测TCA8113细胞转染mi R-182-inhibitor后的增殖和迁移能力的变化。结果口腔鳞癌组织与配对组织比较,miRNA-182的表达显著增高(P<0.05)。转染mi R-182-inhibitor后,miR-182-i组细胞的增殖能力和细胞迁移数显著低于Control组、(P<0.05)。结论mi R-182的高表达可能与口腔鳞癌的发生发展有关,下调miR-182的表达可抑制TCA8113细胞的增殖迁移能力,其作用机制尚需进一步研究。

关键词： 软骨组织工程   聚乙烯醇   卡拉胶   生物相容性  

摘要： 目的:探讨PVA/ι-CA软骨组织工程支架对ATDC-5细胞生物学行为的影响,评价其用于构建组织工程软骨的可行性。方法:采用物理共混技术和反复冷冻-解冻方法,将聚乙烯醇(PVA)和卡拉胶按照一定比例制作成复合支架材料PVA/ι-CA并测定其孔径和孔隙率。将ATDC-5细胞接种于支架材料,观察细胞的黏附生长情况;免疫组织化学法和免疫荧光法检测ATDC-5细胞中Ⅱ型胶原的表达情况;甲苯胺蓝检测ATDC-5细胞形态表现;扫描电镜(SEM)下观察细胞生长及细胞外基质(ECM)分泌情况。将ATDC-5细胞分为阴性对照组(加入空白培养液)和实验组(加入含材料的培养液),MTT法检测支架材料上2组ATDC-5细胞的增殖率。将支架材料植入SD大鼠皮下,评价该支架材料的组织相容性和血管化能力。结果:PVA/ι-CA软骨组织工程支架平均孔隙率为(86.88±3.88)%,平均孔径为20~40μm。HE染色,ATDC-5细胞在支架材料上贴附生长良好,呈多角形,形态饱满;免疫组织化学和免疫荧光染色,ATDC-5细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白;甲苯胺蓝染色,ATDC-5细胞在支架材料上保持软骨细胞的特性,随着培养时间的延长,支架材料上阳性细胞数量明显增加;ATDC-5细胞与支架材料共培养7d时,SEM下可见少量细胞呈多角形;培养14d时细胞数量增多,形态饱满、相互融合,伸入材料间形成锚状结构,牢固地黏附于材料表面;培养21~28d时材料上附着的细胞分泌大量的ECM包裹材料;ATDC-5细胞在材料上于7~14d增殖较快,21~28d增殖较慢,实验组增殖率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。皮下包埋早期有轻微的炎症反应,随着时间延长而消退;后期有血管化发生,材料降解吸收比较缓慢。结论:PVA/ι-CA支架材料有望成为的软骨组织工程支架材料。

关键词： 胰腺癌   Hedgehog信号通路   Smoothened基因   小干扰RNA  

摘要： 目的采用携带Smoothened（SMO）基因靶向小干扰RNA（siRNA）的慢病毒表达载体转染胰腺癌细胞后体外观察其对细胞生物学特性的影响。方法依据前期研究方法合成3条携带SMO siRNA慢病毒表达载体（滴度：5×108、6×108、5×108 TU/ml），分别转染Patu-8988细胞后采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）法检测细胞中SMO基因的表达并计算基因表达抑制率；筛选抑制率最高干扰表达载体转染Patu-8988细胞72 h，采用噻唑蓝（MTT）实验检测细胞生长情况、流式细胞仪检测细胞凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭转移能力、Western blot法检测通路靶基因B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）表达情况。结果构建的3条SMO siRNA慢病毒表达载体对Patu-8988细胞SMO基因表达的抑制率分别为82.4%、93.1%及89.1%，选择抑制效率最高的干扰载体转染Patu-8988细胞72 h后，细胞生长状况良好；与阴性对照组比较，转染组Patu-8988细胞第1天至第5天细胞生长抑制率分别为（7.46±0.32）%、（25.41±0.28）%、（25.94±0.51）%、（26.01±0.94）%及（43.23±0.88）%。；细胞凋亡率为（1.35 ± 0.11）%低于对照组但可视为未发生显著凋亡（t＝－4.523，P＝0.011）；转染组侵袭小室与Transwell小室细胞数分别为（38.00±4.73）个/高倍视野与（78.00±3.71）个/高倍视野，明显低于对照组[（128.00±10.91）个/高倍视野与（306.00±9.12）个/高倍视野；t＝－22.808，P＝0.000；t＝－69.256，P＝0.000]；转染后细胞内bcl-2蛋白的相对表达量为0.24 ± 0.01明显下调（t＝－27.386，P＝0.000）。结论SMO siRNA慢病毒表达载体可有效阻断Hedgehog信号通路并显著抑制Patu-8988细胞的生长及其侵袭转移能力。