关键词：
非小细胞肺癌
Brf1
Pol Ⅲ基因
CRISPR/Cas9
生物学功能
摘要：
目的:肺癌在我国恶性肿瘤中死亡率位居首位,发病率也是逐年上升,主要以非小细胞肺癌为主,约占肺癌发病率的80%左右。Brf1作为PolⅢ基因的特异性调控因子,在肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤中表达水平上调,并促进细胞转化及肿瘤的发生。但其在非小细胞肺癌中的作用尚不明确。本研究通过检测Brf1在非小细胞肺癌组织及癌旁肺组织中的表达情况,验证Brf1是否在非小细胞肺癌中存在高表达。然后应用CRISPR/Cas9系统特异性沉默人非小细胞肺癌细胞中BRF1基因的表达,观察其对非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响。探讨Brf1成为非小细胞肺癌治疗靶点的可能性,为后续研究提供参考。方法:1.免疫组化法（S-P法）用于检测非小细胞肺癌组织和癌旁肺组织中Brf1的表达,比较Brf1表达水平与临床病例参数和预后之间的关系。通过Western blot法等验证Brf1是否在非小细胞肺癌细胞株中高度表达。2.根据BRF1基因的序列设计sgRNA,与经BsmBI酶切后的lenti-CRISPR v2质粒进行重组,得到特异性针对BRF1基因的CRISPR/Cas9重组质粒,利用该载体含有嘌呤霉素抗性的特性,筛选出敲除BRF1基因表达的非小细胞肺癌细胞株。3.运用qRT-PCR、Western blot、CCK8法、Transwell小室等实验方法,验证干扰BRF1基因表达后对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭、迁移等生物学功能的影响。结果:*** blot法检测Brf1在非小细胞肺癌组织中的表达较癌旁肺组织明显增高,差异有统计学意义（t=31.17,P<0.01）。qRT-PCR结果显示非小细胞肺癌组织中BRF1 mRNA表达水平较癌旁肺组织升高,差异具有统计学意义（t=11.68,P<0.01）。免疫组化比较非小细胞肺癌组织与癌旁肺组织中Brf1的表达,结果显示Brf1在非小细胞肺癌组织中存在高表达。2.根据Brf1的表达强度,对96例非小细胞肺癌组织标本进行分类,Brf1阳性表达率为72.9%（70/96）,其中弱阳性16.7%（16/96）,中等阳性25.0%（24/96）,强阳性31.2%（30/96）。分析Brf1表达水平与临床病例特征之间的关系,发现Brf1表达强度在低分化组比在中-高分化组中更强（秩均值62.33>43.89,Z=-2.914,P=0.004）,有淋巴结转移组强于无转移组（秩均值60.34>42.58,Z=-3.055,P=0.002）。而在其他的临床病例参数如性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、病理类型和TNM分期,与Brf1表达强度无显著差异,均P值>0.05。3.应用Kaplan-Meier法绘制非小细胞肺癌患者生存曲线,结果显示Brf1阳性表达组术后生存率明显低于阴性组,Log-rank分析其差异有统计学意义（?2=7.560,P=0.006）,把单因素分析中P<0.05的因素纳入Cox回归模型进行多因素分析,肿瘤中Brf1阳性表达（HR=2.043,P=0.028）可作为非小细胞肺癌患者预后的独立预测因子。通过比较公共数据库中肺癌患者的Brf1表达生存曲线,发现Brf1的高表达会降低肺癌患者的生存率,差异有统计学意义（P<0.05）。*** blot结果显示非小细胞肺癌细胞中存在BRF1的高表达,且明显高于人胚肺成纤维细胞MRC-5（P<0.05）。CRISPR/Cas9沉默BRF1后筛选出稳转细胞株,经qRT-PCR及Western blot法验证BRF1基因敲除情况,结合CCK8法及Transwell实验结果显示敲除BRF1基因表达后将减弱非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力（P<0.05）。结论:1.非小细胞肺癌组织中Brf1表达情况总体上调,且与患者预后密切相关,提示Brf1的高表达可能作为非小细胞肺癌的早期筛查及预后评估指标。***1在一定程度上参与非小细胞肺癌的发生发展,抑制BRF1的表达会降低非小细胞肺癌细胞的生物学功能。
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