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关键词： 胃癌干细胞   周期素依赖性激酶5激活结合蛋白3   PI3K/AKT信号通路   EMT   生存  

摘要： 目的:胃癌是常见消化道恶性肿瘤之一,占全球恶性肿瘤的第五位,也是位列第三的恶性肿瘤相关死亡疾病。在我国,大多数的患者在首次就医时即已经为进展期的胃癌,虽然以手术为主的综合治疗得到了一定的发展,但是患者的远期预后仍未能达到预期。对于复发转移的晚期胃癌患者,虽然可有超过50%的患者对多药联合的化疗具有反应,但是几乎所有的患者最终都将发生化疗耐药,中位生存时间也仅为10-12个月。因此,针对胃癌发生、发展,以及化疗耐药等的科学研究是提高患者预后的最重要手段之一。近年来,随着肿瘤干细胞研究的深入,胃癌干细胞也逐渐被证实。胃癌干细胞是一类特殊的恶性肿瘤细胞群,它们具有较强的自我更新能力和高致瘤性,而且具备多向分化的潜能,对化疗药物也具有较高的耐受性,许多研究发现其与肿瘤的复发转移和化疗耐药等生物学特性关系密切。CDK5RAP3是一种可以与细胞周期素依赖性激酶5的激活蛋白P35、P39结合的蛋白。目前关于CDK5RAP3对胃癌干细胞生物学特性的作用和机制的研究尚未见报道。本研究首先在胃癌病人组织中检测CDK5RAP3与胃癌干细胞标志物CD44的表达情况和相关性,并且分析两者表达与临床病理因素和患者远期生存的关系。其次,利用体内外细胞功能实验探究CDK5RAP3对胃癌干细胞成球生长能力、侵袭迁移能力、类器官形成、致瘤能力和化疗耐药性等的作用。最后,利用分子生物学实验研究其对胃癌干细胞生物学特性作用的潜在分子机制。本研究旨在明确CDK5RAP3对胃癌干细胞生物学特性中的作用及其调控机制,以期为胃癌干细胞的研究提供新的理论和思路,有助于胃癌治疗新靶点的研究。方法:1.通过IHC检测CDK5RAP3和CD44在胃癌及癌旁组织中的表达,分析两者的相关性及其与患者临床病理因素和预后的关系;*** Blot检测不同培养模式胃癌细胞中CDK5RAP3和胃癌干细胞标志物等的变化;3.利用包装好的慢病毒构建CDK5RAP3稳定过表达或下调表达的胃癌细胞株,并观察其对细胞成球生长能力的影响;4.在侵袭小室实验中观察CDK5RAP3对胃癌干细胞侵袭迁移能力的作用;5.构建稳定过表达CDK5RAP3的鼠源性胃癌细胞,观察其对胃癌干细胞类器官形成能力的影响;6.通过裸鼠皮下成瘤模型,验证CDK5RAP3对胃癌干细胞在体内致瘤性的作用;7.体内、外实验研究CDK5RAP3对胃癌干细胞化疗耐药性的作用;8.利用分子生物学技术探讨CDK5RAP3对胃癌干细胞生物学作用的潜在分子机制,分析CDK5RAP3对PI3K/AKT信号通路关键分子和EMT相关蛋白的影响。***检测EMT转录因子Snail在胃癌中表达的情况,并结合CD44与CDK5RAP3的表达,观察其与患者预后的作用。结果:***检测结果发现在胃癌组织中CDK5RAP3的表达低于其对应的癌旁组织,而CD44在胃癌组织中的表达则高于其对应的癌旁组织,且两者在胃癌组织中的表达呈明显的负相关。2.预后分析显示CDK5RAP3和CD44均是患者预后的独立影响因素,并且仅在CD44高表达患者中,CDK5RAP3高、低表达患者的生存差异具有统计学意义。3.体外细胞功能实验发现,CDK5RAP3的表达抑制了胃癌干细胞成球生长、侵袭迁移和类器官形成等的能力。4.裸鼠皮下移植瘤实验发现,CDK5RAP3能够降低胃癌干细胞的致瘤能力,并且显著降低了胃癌干细胞的化疗耐药性。***3K的抑制剂能够抑制胃癌干细胞侵袭迁移的能力,并且使CDK5RAP3的蛋白表达水平升高,AKT磷酸化水平降低,同时EMT转录因子Snail和相关蛋白发生改变。6.过表达CDK5RAP3可以抑制AKT(S473)位点的磷酸化水平而降低EMT转录因子Snail的表达,从而介导胃癌干细胞的EMT活性。7.在CD44高表达患者中,CDK5RAP3高表达能够改善EMT转录因子Snail高表达对患者不良预后的作用。结论:***5RAP3与胃癌干细胞标志物CD44在胃癌中的表达呈负相关,两者均是患者预后的独立因素,有望成为胃癌预后预测的联合指标;***5RAP3不仅能够抑制胃癌干细胞成球生长、侵袭迁移和类器官形成能力,而且抑制了胃癌干细胞致瘤能力和化疗耐药性。***5RAP3能通过抑制AKT磷酸化水平从而降低EMT转录因子Snail的表达,降低了胃癌干细胞EMT活性,发挥抑癌作用。***44高表达的患者中,CDK5RAP3的表达在能够改善Snail高表达患者的远期预后,在临床上可以作为治疗胃癌的潜在靶点。

关键词： 精原干细胞   支持细胞   过表达   FGF2  

摘要： 水牛睾丸支持细胞(Sertoli cells)以及其分泌物对于水牛精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)的增殖有重要的影响。支持细胞环绕在精原干细胞周围,为精原干细胞的正常生长提供稳定的空间,同时参与形成血睾屏障,保护精原干细胞环境的稳定,为精原干细胞的增殖提供物理支持,其分泌的生长因子如GDNF和FGF2等,对精原干细胞的增殖具有重要作用,FGF2是干细胞培养过程中重要组成成分,对于处在未分化状态的干细胞是必需的,并且对中胚层和外胚层来源的细胞具有促分裂作用。本论文探索了水牛支持细胞分离纯化方法,对比了幼牛及成年牛支持细胞中FGF2表达差异并观察了它们作为饲养层培养水牛SSCs的效果,构建了支持细胞FGF2过表达细胞系,以期为建立优化的水牛精原干细胞体外培养系统奠定基础。现将本论文的研究结果简述如下:第一章:开展了水牛睾丸支持细胞组织定位及分离纯化研究。研究结果显示:以anti-DDX4作为生殖系细胞特异性标记抗体,anti-WT1作为支持细胞特异性标记抗体,对水牛睾丸组织进行组织免疫荧光分析,发现青春期前水牛睾丸曲细精管靠近基底膜位置上的细胞胞质呈现DDX4阳性,而睾丸曲细精管靠近基底膜位置上细胞的细胞核呈现WT1阳性,定位结果与预期一致。接着利用差异贴壁法纯化水牛睾丸支持细胞,并在体外贴壁培养不同时间段收集细胞,利用real-time PCR及WB分析贴壁细胞和悬浮细胞相关转录本和蛋白表达情况,结果显示,体外培养1h至2 h或3 h至4 h两个时间段悬浮细胞wt1表达皆呈现显著降低趋势,而贴壁培养5 h的贴壁细胞wt1表达显著高于贴壁培养1h的贴壁细胞。对差异贴壁纯化后的细胞进行RT-PCR以及WB检测结果显示,纯化后细胞表达支持细胞的标记WT1、GATA4、SOX9,不表达间质细胞标记3β-HSD以及管周肌样细胞标记α-SMA,并且纯化后细胞WT1蛋白表达量高于纯化前细胞。第二章:开展了不同年龄水牛睾丸支持细胞FGF2表达差异及其对水牛SSCs培养效果影响的研究。利用real-time PCR分析成年水牛睾丸支持细胞与幼年水牛睾丸支持细胞相关转录本表达状况,发现成牛睾丸支持细胞FGF2及LIF表达显著高于幼年牛,而幼牛与成年牛睾丸支持细胞GDNF及SCF的表达差异不显著。以成年水牛及幼年水牛睾丸支持细胞作为饲养层共培养精原干细胞,幼年水牛支持细胞更有利于维持精原干细胞的增殖,与幼牛水牛睾丸支持细胞共培养的水牛精原干细胞PLZF、NANOS2、GFRα1表达显著高于成年水牛睾丸支持细胞共培养的精原干细胞。第三章:开展了构建FGF2基因过表达水牛睾丸支持细胞系的相关研究。使用PEGFP-N1质粒,构建PEGFP-N1-FGF2重组质粒,利用x-fect将重组质粒转染到支持细胞,并使用G418筛选,得出FGF2过表达细胞系。以体外正常培养水牛睾丸支持细胞为对照,将FGF2过表达支持细胞与精原干细胞共培养,与过表达FGF2细胞系共培养的精原干细胞OCT4、PLZF、GFRα1和NANOS2的表达量显著高于未转染细胞共培养精原干细胞。综上所述,使用差异贴壁法可成功纯化获得水牛支持细胞,幼年牛睾丸支持细胞作为饲养层更有利于水牛精原干细胞的体外增殖,成功构建过表达FGF2基因幼年牛睾丸支持细胞系,该细胞系作为饲养层有利于促进水牛精原干细胞的体外增殖。

关键词： 翻转课堂   细胞生物学   实验   教学设计与改革  

摘要： 随着新课改的推进,细胞生物学教学有了很大的突破。现阶段,很多生物教师为了提升课堂教学效率,开始通过翻转课堂模式(The mode of overturning the classroom teaching)进行教学。翻转课堂教学模式,能够有效提升教师的课堂教学效率,克服传统教学方式的弊端,存进学生对细胞生物学的理解。基于此,本文研究翻转课堂下细胞生物学实验教学设计与改革,以期促进我国细胞生物学的发展。

关键词： 糖尿病视网膜病变   层粘连蛋白α1   细胞生长   生物学行为  

摘要： 目的：　　糖尿病性视网膜病变是糖尿病患者非常常见的微血管并发症，高血糖可以引起细胞外基质组份的增加，层粘连蛋白作为重要的细胞外基质组份之一，还参与基底膜和血管的构成，并通过细胞膜上的受体影响细胞的生物学行为，如细胞的粘附、迁移、增殖等，而其中α链是层粘连蛋白的主要构成之一，我们想探究不同糖浓度培养液对层粘连蛋白α1（Laminin alpha 1LAMA1）的表达以及对细胞生长、粘附、迁移、增殖等常见生物学行为的影响，证明LAMA1是否在糖尿病性视网膜病病变的发生发展中起到一定作用。　　方法：　　1、预先配置好4种不同糖浓度细胞培养液（5mM、15mM、25mM、35mM），其中5mM组作为对照组（正常糖浓度组），使用不同糖浓度培养液常规培育ARPE-19 和 RF/6A 两种细胞，显微镜下观察相同位置、不同时间（0d、1d、2d、3d、4d）各组糖浓度下的细胞生长情况，并做拍照记录加以比较。　　2、利用 Western Blot、qRT-PCR、IF免疫荧光技术检测在不同糖浓度下和时间梯度下（处理24h、48h后）的LAMA1的表达情况（包括蛋白水平、核酸水平、细胞水平）。　　3、通过细胞划痕实验、CCK-8实验、细胞粘附实验分别检测两种细胞的迁移能力、增殖能力、粘附能力的变化，从而反映高糖对细胞生物学行为产生的影响。　　结果：　　本次研究我们发现，随着糖浓度增加，高糖组两种细胞的生长速度都较对照组（正常糖浓度5mM）加快，在处理相同时间情况下是糖浓度越高细胞生长越快。同样的，高糖组细胞的增殖、迁移、粘附能力都较正常组有不同程度提高：在细胞增殖能力方面，三个高糖组都较正常组提高，且之间差异具有统计学意义（P＜0.05）;在细胞水平迁移方面，处理24h后，高糖组有较正常组提高，但无统计学意义（P＞0.05），随时间延长，25mM 和 35mM 组较对照组之间有明显差异，且差异具有统计学意义;在细胞粘附水平上，高糖组稍有提高，但无明显统计学差异，仅在处理8h后个别高糖组较低糖组间差异有意义。但非常有趣的是，随着糖浓度增加，两种细胞LAMA1蛋白的表达是先轻微升高,然后开始出现明显下降趋势，在ARPE-19组尤甚，细胞免疫荧光上差异不是太明显，但蛋白和核酸水平变化是有差异的且有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　高糖环境不同程度的增加了ARPE-19和RF/6A细胞的增殖、迁移、粘附能力，但降低LAMA1蛋白的表达。这些细胞生物学行为的改变，为糖尿病性视网膜病变的发生发展提供了可能，所以上述结果表明LAMA1可能在糖尿病视网膜病变发生发展中起到了一定作用。因此LAMA1未来或许可作为糖尿病视网膜病变的诊断或治疗的一个潜在靶点。

关键词： 梅山猪   冷冻保存   耳成纤维细胞   生物学特性   维生素E   DNA甲基化  

摘要： 我国地方猪种资源十分丰富,拥有很多独特的遗传特性,受到国内外育种者的高度重视。然而由于各种原因,有些地方猪种数量急剧下降,甚至绝种,因此需要应用生物技术来保存地方猪种种质资源。体细胞冷冻因简单、有效和更具可操作性,且采集时不影响动物健康,越来越受到重视,在优良种畜资源、濒危物种保种中具有广泛的应用前景。梅山猪是我国一个优良的地方品种,以其繁殖力高、肉质鲜美而著称。为保存梅山猪种质资源,本研究采用组织块培养法建立了梅山猪耳成纤维细胞系,并对所建细胞系进行生物学特性研究,以期使这一优良资源得到妥善保护,也为其他动物保种提供借鉴。以梅山猪耳缘组织为研究材料,采用组织块培养法建立了梅山猪耳成纤维细胞系,并对所建细胞系进行生物学特性研究。结果表明:所建立的梅山猪耳成纤维细胞系生长态势良好,冷冻前后的平均细胞存活率分别为95.21%、90.08%,解冻后细胞的生长曲线呈“S”型;细菌、真菌和支原体3类微生物检测结果均为阴性,细胞没有受到微生物的污染;细胞中期染色体二倍体（2n=38）占主体约为92.31%,达到了建立成纤维细胞系的要求;苹果酸脱氢同工酶和乳酸脱氢同工酶电泳结果表明,该细胞系没有被其他细胞污染,细胞纯度较高;绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染耳成纤维细胞,5个细胞系的阳性率为45.23%67.32%。经G418筛选后,各个细胞系均能有效形成单克隆集落。本试验中梅山猪成纤维细胞系的建立使梅山猪种质资源在细胞水平得到有效保存,并可为其他动物成纤维细胞系的建立以及种质资源保存提供参考。探究不同浓度的抗氧化剂维生素E（VE）对梅山猪耳成纤维细胞传代过程中抗凋亡能力的影响。采用MTT法检测细胞增殖,JC-1检测线粒体膜电位,Annexin V-EGFP/PI检测细胞凋亡率,以及RT-PCR检测BAX、Caspase-3、BCL-2、SOD-1基因m RNA表达水平的变化。结果表明,加入维生素E培养细胞,细胞相对增值率和线粒体膜电位比对照组明显升高,细胞凋亡率明显降低,BAX、Caspase-3基因表达量和对照组（0μmol/L VE）没有明显差异（P<0.05）,而BCL-2、SOD-1基因表达量比对照组明显升高,其中100μmol/L VE处理组的BCL-2基因表达量极显著高于对照组和50μmol/L处理组（P<0.01）,并与150μmol/L VE处理组无显著差异（P>0.05）;100μmol/L VE处理组的SOD-1基因表达量极显著高于其他三组（P<0.01）。本试验表明,细胞培养过程中添加100μmol/L的维生素E能够提高线粒体功能、抑制细胞凋亡和促进细胞增殖。探索冷冻保存对猪梅山猪耳成纤维细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化的影响。采用亚硫酸氢盐测序和RT-PCR技术,检测了新鲜和冷冻保存细胞中H19和IGF2R基因的DNA甲基化状态和表达量,并对甲基化相关基因的表达水平进行分析。结果显示,冷冻组中H19基因DMR1和DMR3的甲基化率（84.48%,69.17%）极显著高于新鲜组的甲基化率（58.28%,48.33%,P<0.01）,H19基因DMR2表现为去甲基化,极显著低于新鲜组中的甲基化率（26.40%vs 48.00%,P<0.01）,且该基因表达量极显著高于新鲜组（P<0.01）;IGF2R基因DMR2表现为超甲基化,极显著高于新鲜组中的甲基化率（75.88%vs 42.94%,P<0.01）,但IGF2R基因表达量并没有显著差异（P>0.05）。冷冻组中DNMT3A和DNMT1的基因表达量极显著高于新鲜组（P<0.01）,DNMT3B基因表达量则没有显著差异（P>0.05）。本试验结果提示:冷冻保存影响了H19和IGF2R基因甲基化控制区的DNA甲基化状态,从而影响了该基因的表达水平。

关键词： 肺肿瘤   脂肪细胞   细胞增殖   迁移   侵袭  

摘要： 背景与目的肺癌是世界范围内发病率与死亡率最高的恶性肿瘤,并呈显著上升趋势。由于没有特异性症状与体征,大部分患者在诊断阶段已发生远处转移,其诊断后的5年生存率不到20%。因此,对肺癌相关危险因素的研究以及对其复发转移机制的深入了解在肺癌的防治中有着重要意义。脂肪细胞在肿瘤微环境中可通过提供代谢燃料或信号传导媒介等方式以促进多种恶性肿瘤细胞的增殖与侵袭,但其在肺癌细胞演进过程中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨脂肪细胞对肺癌细胞生物学行为的影响。实验方法1.根据“鸡尾酒”诱导法将3T3-L1细胞诱导分化为成熟脂肪细胞。2.应用Transwell间接共培养模型,将3T3-L1细胞、体外诱导成熟脂肪细胞分别与肺腺癌A549细胞间接共培养。3.应用显微镜成像与油红O染色实验对细胞进行形态学观察。4.应用MTT法与平板细胞克隆形成实验检测A549细胞的增殖能力。5.应用划痕实验与Transwell迁移实验分别检测A549细胞的横向迁移能力与纵向迁移能力,应用Transwell侵袭实验检测A549细胞的侵袭能力。6.应用蛋白质免疫(Western Blot,WB)印迹检测肺腺癌A549细胞的EMT相关蛋白的表达情况。7.应用比色分析法检测脂肪细胞胞质内的甘油三酯含量与游离脂肪酸分泌量、肺腺癌A549细胞胞质内的甘油三酯含量、葡萄糖摄取率及乳酸分泌率。实验结果1.3T3-L1细胞成功诱导分化为成熟脂肪细胞。与成熟脂肪细胞共培养后,肺腺癌A549细胞的增殖与克隆形成能力明显增强(P<0.05)。2.与成熟脂肪细胞共培养后,肺腺癌A549细胞的形态变得更加纤长,EMT相关蛋白E-cadherin的表达水平下调,vimentin的表达量增加。3.成熟脂肪细胞明显增强了肺腺癌A549细胞的横向迁移能力(P<0.05)、纵向迁移能力(P<0.01)以及侵袭能力(P<0.01)。4.在A549细胞的长期作用下,脂肪细胞胞质内的脂滴逐渐减少。此外,通过比色定量分析实验发现,与A549细胞共培养48 h后的脂肪细胞胞质内的甘油三酯含量明显减少(P<0.05),同时,肿瘤细胞的条件培养基亦能促进脂肪细胞分泌大量游离脂肪酸(P<0.001)。5.与成熟脂肪细胞共培养后,肺腺癌A549细胞胞质内的脂质得以明显累积(P<0.05),葡萄糖摄取率(P<0.05)与乳酸分泌率(P<0.01)明显增加。结论肿瘤微环境中的脂肪细胞可促进肺腺癌A549细胞的增殖、迁移与侵袭,且这一促进作用可能与糖脂代谢相关。研究肿瘤微环境中的脂肪细胞与肿瘤细胞之间的关系将为更好地明确肿瘤转移的机制提供实验依据,而且有可能成为未来肺癌治疗的新靶点。

关键词： 结直肠癌   FAM83D   细胞增殖   细胞凋亡   侵袭   结直肠癌   FAM83D   细胞增殖   细胞凋亡   侵袭  

摘要： 近年来,我国结直肠癌(colorectal cancer,CRC)新发病例逐年增加,已成为临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一。然而,由于结直肠癌早期检出率不高且易发生复发转移,许多患者被确诊时已是晚期,错过了最佳治疗时机,导致结直肠癌患者死亡率很高。因此,探索结直肠癌发生发展的分子机制,寻找可提供早期诊断的分子标记物,对于诊断和治疗该病具有重要的意义。研究证实,在肿瘤的发生发展过程中,有一系列基因的差异表达贯穿始终,FAM83D(Family with sequence similarity 83D,FAM83D)即是其中之一。FAM83D是FAM83家族成员之一,定位于人类20q染色体中;其主要功能是编码纺锤体相关的蛋白,与有丝分裂密切相关。另外,FAM83D在各种癌症如乳腺癌、肝癌以及肺癌中差异性表达,不仅是诊断和预后潜在的候选基因,而且参与调节癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移,因此,FAM83D可能成为肿瘤基因治疗的新靶标分子。然而,迄今为止,鲜见有关FAM83D在结直肠癌发生发展过程中的生物学功能及其分子机制的研究报道。为探索其作为新靶标分子的可能性,本课题首先采用qRT-PCR技术检测了 36对结直肠癌组织和正常结直肠组织中FAM83D mRNA的表达水平,然后应用qRT-PCR以及Western blotting技术检测了 7株结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480 和 HCT116)和一株正常结直肠上皮细胞(NCM460)中FAM83D mRNA及蛋白质的表达。结果表明,FAM83D在结直肠癌组织和细胞中均显著上调。接着,通过观察调控FAM83D表达对结直肠癌细胞SW480和HCT116的增殖、凋亡、侵袭及EMT的影响,初步探讨FAM83D在结直肠癌中发挥生物学功能的分子机制。第一部分FAM83D在结直肠癌组织和细胞中的表达情况方法1.收集标本,36例结直肠癌组织标本及癌旁正常结直肠组织标本。2.细胞培养,7株结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480和HCT116)和一株正常结直肠上皮细胞(NCM460)。3.采用qRT-PCR检测36例结直肠癌组织与对应的36例癌旁正常组织标本中FAM83D mRNA的表达情况。4.采用qRT-PCR和Western blotting方法检测结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中FAM83D mRNA和蛋白质的表达情况。5.统计学分析:所有实验数据采用均数±标准差方式表示,并使用SPSS 17.0软件对得到的数据进行统计分析。另外,单因素方差分析和t检验分析组间差异,其中,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果1.与正常结直肠组织比较,在结直肠癌组织中FAM83DmRNA表达显著上调。2.与正常结直肠上皮细胞(NCM460)比较,在结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480 和 HCT116)中 FAM83D 蛋白质和 mRNA表达显著上调,尤其是在SW480和HCT116细胞中(P<0.01)。第二部分FAM83D对结直肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响方法1.结直肠癌细胞 SW480 和 HCT116 经 FAM83D siRNA、negative control siRNA、pcDNA3.1-FAM83D 质粒以及空质粒 pcDNA3.1 negative control 转染构建FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞。qRT-PCR和Western blotting方法检测转染后FAM83D mRNA和蛋白质表达情况确定。2.实验分组:Control组:结直肠癌细胞(SW480和HCT116)正常培养,未做处理;pcFAM83D组:仅转染pcDNA3.1-FAM83D质粒;siFAM83D组:仅转染FAM83DsiRNA;过表达对照组(pcNC):仅转染pcDNA3.1-空载质粒;沉默对照组(siNC):转染 siRNAnegative control。***法检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的增殖。4.克隆形成实验检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的克隆形成能力。*** Death Detection ELISA检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡。6.应用Transwell实验检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的侵袭能力。*** blotting和qRT-PCR检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中相关凋亡和EMT基因的蛋白质和mRNA表达。8.统计学分析

关键词： 传奇式在线开放学习系统   基础医学   成人教育   乡村医生  

摘要： 我院首次在成人教育乡村医生中利用传奇式在线开放学习系统开展基础医学教学.借助该系统我们开发《医学细胞生物学与遗传学》在线学习平台,该平台最大优势可解决学员学习不受时间和空间的限制,巩固所学知识,师生交流互动有更大的自由度.实践表明,该在线学习平台具有可操作性,也取得良好的教学效果.

关键词： 基质金属蛋白酶1   乳腺癌MCF-7细胞   MDA-MB-231细胞   肿瘤转移   RNA干扰  

摘要： 背景:在世界范围内乳腺癌是女性最常见的癌症,占所有女性癌症发病率的16%。乳腺癌的发病受多种环境和遗传因素的影响,遗传性状、年龄和激素被认为是最主要的易感危险因素。女性乳腺癌为包括多种特征的肿瘤,其在形态学、生物学及分子学特征上各有不同,进而导致了临床预后和患者生存期的不同。目前,我们已经有很多较好的用来诊断以及判断预后的方法和分子标志物,如肿瘤分期和分级,P53,Bcl-2,Ki-67,激素受体等。然而迫切的需要我们鉴别乳腺癌的分子亚型(例如,luminal A and B,基底细胞样型,三阴乳腺癌型等),这些乳腺癌的分子亚型与治疗密切相关,不同的分子亚型对于相同的治疗有不同的预后和治疗反应。三阴乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人类表皮生长因子受体(HER-2)的表达均为阴性的乳腺癌,其易复发、转移,缺少有效的治疗方式。每年可有高达40%的乳腺癌患者出现复发转移,这是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因。转移性乳腺癌治疗棘手,预后很差,平均生存率低。在研究乳腺癌新的分子标志物中,已经证实MMP家族与乳腺癌的浸润和转移密切相关。MMP家族是锌依赖的肽链内切酶,属于超家族。参与生理过程(例如组织重建、干细胞分化和增殖、凋亡)和病理过程(例如炎症、变性、恶变和癌症)中的关键事件。MMP家族包含多种类型的蛋白酶,分解大部分的细胞外基质成分和一些蛋白,产生对肿瘤发生和进展重要的生长因子,这些数据表明MMP家族可能会成为肿瘤重要的生物学标志和治疗靶点。人类至少有24种MMP基因,产生23种MMP蛋白,包括17种可溶性的分泌蛋白和6种膜相关蛋白酶。MMPs包括多种结构域,其底物特异性和组织特异性的表达模式不同。MMPs是根据其作用的细胞外基质优势底物而命名。胶原裂解作用的MMPs(MMP-1、MMP-8、MMP-13)称为胶原裂解酶。明胶裂解作用的MMPs(MMP-2、MMP-9)被称为明胶酶,广谱的降解ECM蛋白作用的称为间质溶解素(MMP-3、MMP-10、MMP-11)或是基质溶解因子(MMP-7)。随着其他旁系同源MMP的发现,包括膜相关的MMPs,MMP家族不断的增大。MMPs可作为肿瘤的分子生物学标记物和预测转移的指标,对诊断和预后是有帮助的。很多研究发现在MMPs蛋白和mRNA表达水平上的增加,是导致乳腺癌发生和进展的关键事件,通过MMPs可能促使乳腺癌转移。另一方面,最近的研究发现,一些MMPs(如MMP-8)的作用可能为机体提供主动防御性机制,而非刺激肿瘤的发生和发展,这些蛋白酶可能在癌症的过程中有保护的生物学作用。MMP-1作为胶原裂解酶,可以广泛的表达于细胞间质中,并降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原,参与机体的生理及病理过程。有研究表明MMP-1在胃癌、膀胱癌及前列腺癌中的高表达与患者的不良预后密切相关。MMP-1在乳腺癌中的生物学和分子学作用已经开始被研究和分析,很多体内和体外的实验来研究MMP-1在乳腺癌癌变发生中作用,亦发现MMP1在乳腺癌及癌间质中的表达与乳腺癌的进展和不良预后相关。但MMP-1的表达特点和调节机制尚不十分清楚且存在一定的争议。MMP-1在乳腺癌分子分型中的表达、与其他蛋白的相互作用、及MMP-1能否成为乳腺癌新的分子治疗靶点、能否用于治疗易复发转移的难治性乳腺癌等方面均值得我们进一步深入研究。目的:本实验主要研究MMP-1蛋白和mRNA在ER阳性组,HER-2(3+)组和TNBC组中的表达,了解MMP-1蛋白与乳腺癌患者临床病理特征的关系。采用RNA干扰技术使乳腺癌细胞MMP-1基因沉默,并检测MMP-1基因沉默后乳腺癌细胞生物学特性的变化和对乳腺癌细胞信号通路的影响。从而研究MMP-1在乳腺癌发生、发展过程中的作用,为MMP-1作为新的分子靶点引入乳腺癌,尤其是三阴乳腺癌的临床治疗提供理论依据。方法:1.采用免疫组织化学方法检测MMP-1蛋白在99例乳腺癌石蜡标本和15例癌旁组织中的表达情况。乳腺癌标本包括ER阳性组51例,HER-2(3+)组22例,TNBC组26例。观察MMP-1蛋白在乳腺癌细胞及间质中的表达,分析其与临床病理特征的关系及MMP-1蛋白与突变型P53蛋白和Ki67指数之间的关系。2.采用Western-blot方法检测MMP-1蛋白在28例乳腺癌新鲜标本中的表达情况。其中包括ER阳性组14例,HER-2(3+)组7例,TNBC组7例。观察MMP-1蛋白量在各组乳腺癌组织中的表达水平,分析MMP-1蛋白表达量与乳腺癌临床病理特征的关系及其在不同组乳腺癌之间的表达差异。3.采用RT-PCR方法检测MMP-1mRNA在17例乳腺癌新鲜标本中的表达情况。其中包括ER阳性组4例,HER-2(3+)组6例,TNB

关键词： 细胞生物学   课堂教学   科研创新   教学方法  

摘要： 学生科研创新思维能力的培养是当今高等教育的重要目标。作为现代生命科学的重要基础学科,细胞生物学是生命科学、医学及生物工程等专业的核心课程,在高等院校的知识和能力培养目标中占有重要地位。立足课堂,以细胞生物学课堂教学改革为抓手,优化教学内容,采用PBL及信息素质为导向的教学模式,改革课程考评方法,致力于激发学生的科研兴趣,培养学生的科研思维和科研技能,有利于培养具有一定科研能力的创新性人才。