关键词：
H7N9流感病毒
Vero细胞
遗传重配
佐剂
大流行流感疫苗
摘要：
H7N9流感病毒已在一些国家和地区传播[1,3]。人感染H7N9禽流感病毒后死亡率高达30%。研究发现,病毒对人呼吸道上皮细胞主要受体α-2,6-唾液酸的亲和力不断增加[4.5],且部分毒株对现行的抗病毒药物已经产生了耐药性[4,6-8],WHO将H7N9禽流感病毒列为潜在的大流行流感病毒[7]。因此,研制人用H7N9禽流感疫苗具有重要战略意义。目前国内流感疫苗生产用病毒种子批均是从国外获得,如果将高致病禽流感病毒H7N9改造成疫苗株再返回国内用于疫苗生产,则我们很可能会错过防控流感大流行的最佳时机。此外,大多数现行流感疫苗基本是采用鸡胚生产,鸡胚供应周期长,尤其是当高致病性禽流感爆发时,种鸡有可能感染病毒死亡进而加剧鸡胚供应不足,造成疫苗生产困难。与鸡胚相比,非洲绿源猴肾细胞（Vero）可以采用发酵罐培养,易实现大规模生产和质量控制且具有较高安全性,适合用于疫苗生产。但流感病毒流行株在Vero细胞上产量不稳定,阻碍Vero细胞流感疫苗的研发[9,10]。因此,我们开展研究,通过解决流感病毒在Vero细胞上产量不稳定问题研发出具有自主知识产权的Vero细胞H7N9大流行流感疫苗。首先,我们以 A/Kunming/1/2005Va（H3N2）（以下简称 H3N2Va）[11,12]作为供体株提供控制Vero细胞高产特性的PB2、PB1、PA、NP、M、NS六个内部基因,与A/Shanghai/2/2013（H7N9）（以下简称H7N9）流感病毒的HA、NA表面抗原基因进行6+2组合共同转染293T细胞,拯救出病毒A/Shanghai/2/2013（H7N9）Va（以下简称H7N9Va）。我们证明了重配病毒具有Vero细胞高产特性,在Vero细胞上连续传代15代,血凝效价稳定在1:128,感染性滴度稳定在7.0 LgTCID50/mL。此外,我们也证明了重配病毒具有较高生物安全性:（1）连续传代过程中病毒表面抗原基因未突变,氨基酸序列未发生替换。（2）较高感染性滴度的活病毒接种SPF鸡胚100%存活。（3）5.5 LgTCID50/mL病毒感染小鼠100%存活,感染3天后检测肺脏中病毒载量为5.5 LgTCID50/g组织,与WHO疫苗推荐毒株对照组的组织病毒载量间差异无统计学意义（P＞0.05）。小鼠肺脏中促炎症因子含量较低,肺部炎症反应轻微。我们还证明了灭活病毒在小鼠模型上具有较好免疫原性。其次,我们优化了 Vero细胞培养H7N9重配病毒的条件为:病毒接种量0.01MOI,TPCK-胰蛋白酶含量为1 μg/mL。H7N9Va病毒收获液血凝效价为1:160-1:256,感染性滴度维持在7.0 LgTCID50/mL以上。同时,我们结合使用过滤澄清、超滤浓缩、凝胶层析和离子交换层析纯化病毒收获液。结果显示,病毒浓缩液经Sepharose 4FF纯化后再经Capto Q层析纯化的病毒回收率较高可达70%,Vero细胞宿主残余DNA低于100 pg/剂。纯化病毒液各指标均达到《中国药典》三部的要求。纯化病毒制备成全病毒灭活苗后免疫小鼠,小鼠获得了良好免疫保护效果,保护效果呈剂量依赖型。最后,我们通过加入佐剂AS03和BW006降低H7N9全病毒灭活疫苗的有效剂量。采用AS03佐剂可使疫苗有效剂量降低到3.75 μ g HA,仅为不加佐剂剂量的1/8。总之,我们反向重配出具有Vero细胞高产特性并同时具有较高生物安全性的疫苗备选株H7N9Va。我们通过优化H7N9Va毒株的培养条件,探索其后处理纯化方案,并使用佐剂将H7N9Va全病毒灭活疫苗的有效剂量降低到原剂量的1/8。在流感大流行时,可以确保在短期内生产更多满足应急需要的疫苗,对流感大流行具有极其重要意义。
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