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关键词： 细胞生物学实验   随堂考核   个性化考核   考试改革  

摘要： 实验考试是实践教学质量的验收和评价环节,是检验大学生综合素质的有效评定手段,科学、公平、准确地评定每个学生的实验成绩是实验教学中的重要内容。从《细胞生物学实验》考试方法和内容改革入手,探索实验考试的有效方式和合理途径。研究发现,实验随堂考核和个性化考核可以促进学生学习的积极性,提高学生的综合科研素质。

关键词： C086   HSP90抑制剂   胃肠间质瘤   GIST-882   伊马替尼耐药细胞株  

摘要： 目的:观察HSP90抑制剂C086对胃肠间质瘤GIST-882细胞系的增殖抑制作用;观察C086可能的逆转胃肠间质瘤耐药性的作用;探讨C086的体外作用机制。方法:1、收集2010.1-12就诊我院的32例初次手术、术前未经靶向治疗或放化疗的GSIT患者的手术标本制作石蜡切片,通过免疫组化检测其肿瘤组织和正常组织中HSP90的表达,比较GIST患者肿瘤组织与正常组织中HSP90的表达量的差异;2、通过细胞计数、CCK-8法检测HSP90抑制剂C086、IM对GIST-882伊马替尼耐药和敏感细胞系细胞增殖的影响,计算C086、IM对GIST-882作用的抑制率,进而绘制生长曲线,并计算IC50,观察C086、IM单药及联合用药对GIST882伊马替尼耐药和敏感细胞系增殖的不同影响;3、通过流式细胞仪检测细胞周期,观察C086、IM单药和联合用药对GIST882伊马替尼耐药和敏感细胞系细胞周期及凋亡的影响;4、通过Western blot对比不同浓度C086处理下GIST882伊马替尼耐药株IM-1细胞中信号通路分子的变化。结果:1、32例GIST患者标本中正常组织HSP90的表达量明显低于其肿瘤组织（P<0.05）;2、C086对GIST882细胞系的增殖有明显的抑制,并且抑制作用随C086的浓度增加而递增,在GIST-882伊马替尼耐药和敏感细胞系中C086与Imatinib联合用药抑制作用强于C086及Imatinib单药用药（P<0.05）;3、划痕实验统计结果显示:C086对GIST882耐药和敏感细胞系的横向迁移能力没有明显影响;4、流式细胞术实验结果显示:与对照组相比C086、Imatinib处理组G0/G1细胞比率无统计学差异（P>0.05）,GIST-882 IM-1细胞S期、G2期处理组细胞明显低于对照组（P<0.05）;5、C086处理组HSP90、Akt、P-Akt、P-Erk的表达水平有显著降低（p<0.05）,并且随C086浓度的增加有下降的趋势;C086处理组KIT、P-KIT的表达水平有明显降低（p<0.05）,但变化的程度不随C086浓度的增加而变化,而Erk的表达水平除在C086 100umol/l处理下有明显降低（p<0.05）,其余浓度条件下其表达水平均无明显变化（p>0.05）结论:***中高危患者肿瘤组织中HSP90表达显著高于正常组织（P<0.05）;2.C086处理GIST伊马替尼耐药和敏感细胞系,均可使细胞增殖能力下降,同时在耐药株中,C086与Imatinib联合作用对细胞增殖的抑制作用优于C086、Imatinib单药作用的情况;3、HSP90可能主要通过Akt介导的PI3K/Akt和RAF/Erk两条通路对细胞增殖起促进作用。

关键词： 胆管肿瘤   微管相关蛋白质类   肿瘤侵润   预后   胆管癌   TPX2   周期   凋亡   EMT  

摘要： 一TPX2在胆管癌组织中的表达、与临床病理参数和预后关系目的:探讨在胆管癌组织中靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)的表达及其临床意义。方法:收集70例胆管癌患者的癌组织及癌旁组织标本,用免疫组化方法检测TPX2蛋白的阳性表达率,随机抽取4对标本用Western blot方法检测TPX2蛋白的表达量;分析癌组织中TPX2蛋白的表达与患者临床病理资料及生存时间的关系。结果:胆管癌癌组织中TPX2蛋白的阳性表达率(44.3%(31/70)vs.5.7%(3/70),P<0.05)及表达量Western blot均高于癌旁组织。TPX2蛋白的表达与患者TNM分期、淋巴结转移以及生存有关(均P<0.05);TPX2蛋白阳性患者的术后生存率明显低于其阴性患者(2年生存率:28.1%vs.80.3%;3年生存率:14.2%vs.60.7%,均P<0.05)。结论:TPX2蛋白在胆管癌中显著高表达,其表达强度可能是胆管癌患者术后发生转移、复发的危险因素;从癌前病变发展成胆管癌的过程中,TPX2蛋白可能发挥了重要作用,其表达强度可能是评价胆管癌早期诊断和预后一个潜在生物学指标和治疗的潜在靶点.二TPX2基因对人胆管癌细胞株生物学特性的影响目的:观察TPX2-si RNA敲低胆管癌细胞中TPX2蛋白表达对其生长的影响,以探讨TPX2基因与胆管癌之间的相关性,为探索TPX2作为胆管癌基因治疗靶点提供思路。方法:通过CCK-8,流式细胞术分析和transwell测定分别研究TPX2表达对胆管癌细胞的增殖、细胞周期、细胞侵袭、迁移和凋亡的影响。通过免疫印迹检测细胞增殖、细胞周期,细胞凋亡和EMT相关靶蛋白的表达。结果:敲低TPX2表达抑制胆管癌细胞的增殖、诱导G2-M阻滞、促进凋亡并抑制侵袭和转移。用TPX2 si RNA处理胆管癌细胞导致cyclin A1,cyclin B1,E-cadherin,p53和Bax的上调,并下调Ki67,cyclin D1,Bcl-2,N-cadherin,β-cadherin CDK2,MMP-9和MMP-2。结论:敲低TPX2表达能诱导人胆管癌细胞G2-M阻滞,促进胆管癌细胞的凋亡,抑制胆管癌细胞增殖、侵袭和转移,其有望成为胆管癌靶向药物治疗的潜在靶点。

关键词： 套细胞淋巴瘤   细胞株   异种移植物   恶性克隆  

摘要： 目前的细胞株生物学特性与临床标本不符,临床标本细胞成分复杂、正常与异常细胞共存,以上已成为制约套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)发病机制研究的瓶颈。既往研究认为MCL来源于CD19阳性(CD19+)的成熟B细胞,而近期少许研究提示CD19阴性(CD19-)细胞可能是MCL的起源细胞,均预示MCL发病机制的复杂性。MCL恶性克隆发病机制研究严重不足,成为基础与临床研究急需解决的重要问题,导致这一问题的关键因素是优良细胞模型的匮乏。因此建立生物学特性与临床高度吻合的细胞株,将为打破发病机制研究实验瓶颈,为进一步研究其发病机制提供可能。目的1建立包含CD19+并极大富集CD19-早期阶段细胞,且生物学特性与临床高度吻合的MCL恶性克隆细胞株。2利用新建立的细胞模型进行MCL恶性克隆发病机制的研究,重点关注:MCL是单克隆还是多克隆肿瘤;恶性克隆生物学特性:聚焦异常发育阶段,免疫表型,基因表达、体内外肿瘤生物学特性。方法1 Je Ko-1-spheres细胞株的建立(1)球形生长方式的鉴定:流式检测比较Je Ko-1-parental细胞株球形生长及单个悬浮两种不同生长方式CD19的表达及边群细胞(side-population,SP)的比例。(2)采用原有培养体系连续培养自然纯化的方法建立Je Ko-1-spheres细胞株。2 Je Ko-1-spheres细胞株生物学特性的鉴定(1)流式细胞术多色分析CD19阴性细胞中CD34、CD38、TDT、CD22、CD5、CD10、Ig M表达并与正常对照比对鉴定Jeko-1-spheres免疫表型,并确定涉及的具体异常分化发育阶段。(2)qrt-PCR方法检测Je Ko-1-spheres及Je Ko-1-parental细胞株bcl-9、bcl-2、bcl-11b、c-myc、cyclin d1、bmi 1、sox2、CD133、nanog、bcl-11a及oct 2的基因表达差异。(3)Jeko-1-parental及Jeko-1-spheres行甲基纤维素克隆成球实验。(4)NOD/SCID小鼠行体内成瘤实验:选取胸腺、大脑、胸骨、肝脏、心肺、脾脏、肾、胃、肾上腺、肠道及胰腺进行H&E染色,脾脏行免疫组化,重点关注各器官成瘤、感染、出血及髓外造血的发生情况。3恶性克隆发病机制研究(1)流式分选Jeko-1-spheres、临床标本及正常标本中CD19-/Ig M-,CD19-/Ig M+、CD19+/Ig M+及CD19+/Ig M-(此组仅限正常标本)细胞行甲基纤维素克隆成球实验,14天后统计结果。(2)流式无菌分选临床来源样本及Jeko-1-spheres细胞中的三个目标亚克隆,分别行NOD/SCID小鼠体内致瘤实验。结果1建立Je Ko-1-spheres细胞株,具有与原代细胞一致的多细胞球体独特生长方式,并富集SP细胞及CD19-早期阶段细胞。2 MCL发病异常阶段可能涉及前B细胞、不成熟B细胞和成熟B细胞三个分化阶段,与其异常发育阶段相对应的恶性克隆免疫表型为:CD19-/Ig M-,CD19-/Ig M+,CD19+/Ig M+。3 Je Ko-1-spheres细胞株致癌潜力在癌基因及干性基因表达、克隆成球能力及体内致瘤能力上较Je Ko-1-parental细胞株均存在明显优势。4三个亚克隆体外克隆成球能力由强到弱一次为:CD19-/Ig M+>CD19+/Ig M+>CD19-/Ig M-;MCL较正常对照缺乏CD19+/Ig M-细胞亚群;三个亚克隆单独在体内均可成瘤但均未发生远处播散,其中以CD19-/Ig M+克隆体内感染出血发生率最高。结论1多细胞球体生长方式是套细胞淋巴瘤CD19-早期阶段恶性克隆的独特生长方式。2 Jeko-1-spheres细胞具有更强的致瘤能力,与临床标本高度一致的生物学特性,可以做为恶性克隆发病机理研究的细胞实验模型。3 MCL可能是发病机制涉及以下异常分化发育阶段即:前B、不成熟B、成熟B细胞三个连续发育阶段,与这些异常发育阶段相对应的恶性克隆免疫表型依次为:CD19-/Ig M-,CD19-/Ig M+,CD19+/Ig M+,该免疫表型与正常对照比对缺乏CD19+/Ig M-细胞亚群,存在明显分化发育差异,因此MCL可能是以CD19-/Ig M+为优势克隆的多克隆肿瘤。

关键词： LIMK2   高级别浆液性卵巢癌   免疫组织化学   RT-PCT   Western Blot   siRNA  

摘要： 目的:本研究在组织水平上分别检测在高级别浆液性卵巢癌及正常卵巢组织中LIM激酶2(LIMK2)的表达,在CAOV3及OVCAR-3卵巢癌细胞系中,应用siRNA下调LIMK2基因表达后,观察细胞生物学行为的变化,进而探讨LIMK2在高级别浆液性卵巢癌发生、发展过程中的作用。方法:利用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测在41例高级别浆液性卵巢癌及30例正常卵巢组织中LIMK2的蛋白表达,实时荧光定量PCR(RT-PCT)方法检测LIMK2 mRNA的表达,并分析其表达与临床病理参数的关系。在细胞水平分别构建观察组LIMK2-siRNA,阴性对照组N-siRNA及空白对照组。应用RT-PCR、Western Blot方法检测转染效率,细胞划痕实验检测细胞转染前后细胞迁移能力的变化,MTT方法检测细胞增殖能力改变,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力改变,流式细胞学检测细胞凋亡。结果:(1)LIMK2在高级别浆液性卵巢癌表达较正常卵巢组织表达明显增高。(2)LIMK2表达与FIGO分期、血清CA125水平相关(P<0.05),与年龄、淋巴结转移、肿瘤大小及腹水量无明显差异(P>0.05)。(3)在细胞水平研究发现,与阴性对照组N-siRNA及空白对照组相比,观察组LIMK2-siRNA组细胞迁移、侵袭能力明显降低(P<0.05),细胞增殖及凋亡能力与对照组及空白对照组无明显差异(P>0.05)。结论:LIMK2可以促进卵巢癌细胞的迁移及侵袭能力,可能成为卵巢癌治疗的新靶点。

关键词： SVA   分离鉴定   TCID50   间接免疫荧光   荧光定量PCR  

摘要： 为了解湖北地区的A型塞尼卡病毒（Senecavirus A,SVA）,该毒株的生物学特性,本试验从疑似发病猪的鼻吻、蹄冠部位的水疱样病变处采集水疱皮和水疱液病料,用猪肾细胞（Porcine Kidney epithelial cells,IBRS-2）进行病毒分离。根据SVA SVV-001株序列设计引物,进行PCR扩增。将SVA毒株分别感染猪肾细胞系（IBRS-2）、猪睾丸细胞（Swine testis cells,ST）和猪肾细胞系（Porcine kidney-15 cells,PK-15）,通过TCID50、蚀斑实验、实时荧光定量、间接免疫荧光法对毒株进行生物学特性研究。病毒分离鉴定结果表明:病毒分离液在IBRS-2细胞上产生CPE,随着传代次数的增加,细胞病变程度随之加剧。全基因组序列比对结果表明:该毒株与中国2017年已公布毒株（CH-HN-2017、CH-HNSL-2017和CH-FJ-2017）相比核苷酸同源性为98.5%-98.6%;与2015年已公布的毒株（CH-01-2015、CH-03-2015、CH-04-2015）相比核苷酸同源性为96.4%-97.6%;与2016年的中国毒株CH-GX109-2016、CH-DL-01-2016相比核苷酸同源性为96.2%-96.4%;与美国毒株（USA-IA44952-2015、USA-IA44662-2015、USA-SD41901-2015）核苷酸同源性为98.5%,与巴西毒株（BRA-G03-2015、BRA-MG2-2015、BRA-MG1-2015）核苷酸同源性97.4%,与加拿大毒株（Canada-MB-NCFAD-11-7-20、Canada-ON-FMA-2015）核苷酸同源性为96.4%-96.6%。由此确定所分离的毒株属于Senecavirus病毒属。细胞生物学特性结果显示:该毒株可在IBRS-2、ST和PK-15中复制增殖,感染后均能产生CPE,但是对IBRS-2细胞最易感。在IBRS-2细胞中,8h左右出现明显的病变,TCID50结果为10-7.4/100μL。相比而言,ST和PK-15细胞产生的病毒滴度较低。从RNA水平来看,SVA在IBRS-2细胞中基因复制水平最高。间接免疫荧光法检测IBRS-2、ST和PK-15细胞均出现特异性荧光。本试验成功分离到一株SVA流行毒株,分析了该毒株的生物学特性,为该病毒的深入研究奠定了基础。

关键词： 肝细胞癌   乙型肝炎病毒   整合   C端截短HBX  

摘要： 目的构建表达C端截短HBX基因和蛋白的人肝癌HepG2细胞模型,并探讨其对HepG2细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。方法1.以肝癌组织中HBX常见的整合片段HBXΔ32(C端缺失32个氨基酸的HBX,全长369bp)、HBXΔ4(C端缺失4个氨基酸的HBX,全长453bp)和野生型HBX(全长465bp)为目的片段,分别构建腺病毒载体并转染HepG2细胞。以转染后的LV5-HBXΔ32、LV5-HBXΔ4、LV5-HBX细胞为实验组,LV5-NC(空病毒)和HepG2细胞为对照组探讨C端截短HBX对HepG2细胞生物学活性的影响。2.采用qPCR和WB的方法分别检测转染后的各组细胞HBX基因和蛋白的表达情况,判断转染是否成功。3.在培养基中加入CCK8,分别于1小时、2小时、3小时、4小时后检测并比较各组细胞OD值,探讨C端截短HBX对HepG2细胞增殖的影响。4.采用transwell实验检测转染后各组细胞的侵袭和迁移能力,探讨C端截短HBX对HepG2细胞侵袭和迁移的影响。5.采用流式细胞学技术检测转染后各组细胞凋亡的情况,探讨C端截短HBX对HepG2细胞凋亡的影响。结果1.本研究成功构建了表达C端截短HBX基因和蛋白的HepG2细胞,镜下可观察到GFP绿色荧光信号,经qPCR和WB验证有HBX mRNA和蛋白的表达。***Δ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组细胞之间的增殖能力有差异,每个检测时间点其OD值差别有统计学意义(P值均<0.05)。经两两比较发现,每个检测时间点HBXΔ32和HBXΔ4组细胞OD值均高于其他各组,且差异有统计学意义(P值均<0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4组之间细胞的OD值差异无统计学意义(P>0.05)。***Δ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组发生侵袭的细胞数分别为277.89±20.64、266.78±22.09、163.44±21.02、157.78±22.02和160.56±21.51,各组间差异有统计学意义(P=0.000)。经两两比较发现,HBXΔ32和HBXΔ4组侵袭细胞数均高于其他各组,且差异有统计学意义(P值均<0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4组之间侵袭细胞数差异无统计学意义(P=0.856)。***Δ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组发生迁移的细胞数分别为95.22±16.84、94.44±12.99、66.56±9.50、71.00±8.79和69.78±9.71,各组之间迁移细胞数差异有统计学意义(P=0.000)。经两两比较发现,HBXΔ32和HBXΔ4组迁移细胞数均高于其他各组,且差异有统计学意义(P值均<0.05),而HBXΔ32和HBXΔ4组之间迁移细胞数差异无统计学意义(P=0.588)。***Δ32、HBXΔ4、HBX、NC、HepG2各组之间细胞凋亡率分别为1.43±0.522%、1.14±0.236%、1.06±0.033%、1.26±0.466%、1.24±0.653%,差异无统计学意义(P=0.505)。结论C端截短的HBXΔ32、HBXΔ4对人肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭、迁移能力有一定的促进作用,并未发现其对HepG2细胞的凋亡有影响。HBX C端的后4-32个氨基酸可能不是影响肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的主要功能域。本研究初步解释了C端截短的HBX基因的整合在广西肝癌高发区肝癌发病中所起的作用,为HBV相关性HCC的病因学探讨和综合防治提供了一定的实验依据和理论参考。

关键词： 猪流感病毒   微小RNA   血凝素   核蛋白   干扰素-β  

摘要： 目的:利用H3N2亚型猪流感病毒SW2783（重组有pdm/09 H1N1内部基因）和SW650（未重组有pdm/09 H1N1内部基因）分别感染人肺腺癌细胞A549（简称人A549细胞）和猪肺泡巨噬细胞PAM（简称猪PAM细胞）,研究病毒感染人和猪细胞后病毒的生物学特性变化,以及SW2783感染人细胞相关miRNA93和miRNA192表达,为猪流感病毒跨种属感染人分子机制的研究提供线索。方法:1.用本实验室分离鉴定的H3N2亚型SIV SW2783和SW650分别感染人A549细胞和猪PAM细胞,观察病毒感染人A549细胞和猪PAM细胞后的细胞病变（CPE）、血凝实验（HA）和半数组织培养感染量(TCID50),比较SW2783和SW650分别感染人和猪细胞后病毒复制的差异和毒力的改变。2.荧光定量PCR检测SW2783和SW650分别感染人A549细胞后miRNA93和miRNA192的表达。*** blot检测SW2783和SW650分别感染人A549细胞后病毒蛋白NP、HA的表达。***检测病毒感染人A549细胞后IFN-β的分泌。结果:***2783和SW650分别在人A549细胞和猪PAM细胞上进行适应性感染实验,TCID50和HA显示SW2783在人A549细胞和猪PAM细胞上的感染呈现逐步适应的过程,提示SW2783可能具有跨种属感染人的潜在能力,而SW650在以上两种细胞的适应性过程中显示出感染能力下降的趋势,甚至丧失感染能力,提示SW650感染人A549细胞和猪PAM细胞的能力有限;CPE实验也呈现相似趋势,24h时开始出现CPE,但在48h时CPE最为明显,72h时细胞大量死亡,提示在这两株病毒的适应性感染过程中,可能存在某些特殊miRNA,进而对病毒的复制能力和感染能力有所影响。2.荧光定量PCR显示,SW2783感染人A549细胞后,感染组与阴性对照组相比,miRNA192和miRNA93的表达在感染后48h时最高,差异有统计学意义（p=0.0020;p=0.0050）;SW650感染人A549细胞后,与阴性对照组相比,miRNA93的表达在72h时最高,差异有统计学意义（p=0.0007）,而对于miRNA192,在48h时表达最高,差异也有统计学意义（p=0.0020）;之后将SW2783和SW650感染人A549细胞,在加入miRNA93及mi RNA192抑制剂之后,抑制剂组与感染组miRNA93和miRNA192的表达量相比,均显著下降。*** blot显示,SW2783感染人A549细胞后,病毒NP和HA蛋白的表达在24h时最高,感染组与阴性对照组相比,差异有统计学意义（p=0.0000;p=0.0000）;SW650感染人A549细胞后,病毒NP和HA蛋白的表达在48h时最高,与阴性对照组对比,差异有统计学意义（p=0.0000;p=0.0000）;加入miRNA93抑制剂,SW2783感染人A549细胞后48h,对于病毒NP和HA蛋白的表达,抑制剂感染组较抑制剂对照组均有所上调,差异有统计学意义（p=0.0006;p=0.0000）;加入miRNA192抑制剂,SW2783感染人A549细胞后48h,抑制剂感染组与抑制剂对照组的病毒NP的表达相比,差异无统计学意义,但与HA蛋白表达对比,前者显著下调,差异有统计学意义（p=0.0002）;SW650感染人A549细胞48h,加入miRNA93抑制剂后,抑制剂感染组的NP表达较抑制剂对照组有所上调,差异有统计学意义（p=0.0400）,而对于HA蛋白的表达,抑制剂对照组与抑制剂感染组相比较,差异无统计学意义;加入miRNA192抑制剂后,抑制剂感染组与抑制剂对照组相比,HA蛋白的表达有所提高,NP反而下调,差异有统计学意义（p=0.0000）。4.炎症因子的实验结果显示:SW2783、SW650分别感染人A549细胞后在8h、48h和72h三个时间点,抑制剂对照组与未感染组相比,IFN-β表达水平都呈上调趋势;加mi RNA93抑制剂后,SW650感染人A549细胞过程中的抑制剂组与抑制剂对照组相比,IFN-β表达水平显著升高,48h的IFN-β表达水平最高,差异有统计学意义（p=0.0020）;SW2783感染人A549细胞过程中的抑制剂组与抑制剂对照组相比,IFN-β表达水平显著升高,抑制剂组在48h IFN-β表达水平最高,且差异有统计学意义（p=0.0004）。结论:***2783是一株在人A549细胞和猪PAM细胞上能够进行复制增殖的H3N2亚型猪流感病毒,说明该病毒具有感染人和猪呼吸道细胞的亲嗜性,且具有潜在感染人的能力;而SW650作为一株未重组有pdm/09 H1N1内部基因的H3N2

关键词： 肺腺癌   瞬时受体电位亚家族M8   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：　　探索瞬时受体电位亚家族M8（TRPM8）对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响及可能机制，分析其能否作为肺腺癌分子治疗靶点。　　方法：　　采用RT-PCR、Western blot检测肺腺癌A549细胞及空载体稳定株A549-plvo、过表达稳定株A549-TRPM8中TRPM8表达。以CCK-8法、平板细胞克隆形成试验检测TRPM8过表达对细胞增殖活性的影响。以划痕试验、Transwell检测TRPM8过表达对细胞迁移及侵袭能力的影响;以流式细胞仪检测TRPM8过表达对细胞周期和凋亡的影响。　　结果：　　RT-PCR结果显示，A549-TRPM8细胞的TRPM8mRNA表达阳性，而A549及A549-plvo均为阴性，A549-TRPM8显著上调了TRPM8mRNA的表达。Western blot结果显示，与对照组A549-plvo相比，A549-TRPM8的TRPM8蛋白表达水平升高(P＜0.05)。CCK-8结果显示，A549-TRPM8在120h、144h增殖速度明显减慢（P＜0.05），细胞增殖能力下降;平板细胞克隆形成试验结果显示，实验组在相同时间内克隆形成的细胞团较对照组数量减少（P＜0.05）、体积减小。划痕试验结果表明，创伤后16h、24h的A549-TRPM8细胞迁移率较对照组低(P＜0.05);Transwell侵袭实验结果显示，实验组在相同时间内发生侵袭的细胞数明显减少（P＜0.05）。流式细胞仪结果表明，A549-TRPM8较A549-plvo的S期细胞数明显增加（P＜0.05），但A549细胞凋亡率无显著性差异（P＞0.05）。　　结论：　　TRPM8过表达抑制肺腺癌A549细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭能力，其抑制增殖能力通过诱导细胞阻滞在S期发挥作用，但对A549细胞凋亡无明显影响。TRPM8有可能作为肺腺癌的治疗靶点。

关键词： 牛肌腱纤维束   脱细胞   材料   韧带替代物  

摘要： 一、研究目的韧带等致密结缔组织的严重损伤和缺损不能自愈,需要替代物予以修复重建。现有的替代物来源包括自体肌腱、同种异体肌腱和合成材料,但各种替代物均因各自固有的缺陷。理想的韧带替代材料必须具备良好组织相容性,良好的力学特性,并且在重建的过程中能满足重建器官运动功能的力学要求,最终被宿主重建成自身所需的组织。同时替代材料须具备材料的可塑性,以便满足各种程度缺损的重建要求。牛肌腱纤维束具备上述特点,其主要成分是Ⅰ型胶原蛋白,与韧带细胞外基质成分类似,免疫源性低,具有良好的组织相容性和良好的生物力学性能,并且具有纤维材料的特性,能编织成多种形态和强度的替代物,以满足修复重建的需求。但是制备肌腱胶原纤维束存在诸多难点,主要表现在:1、牛肌腱纤维束分离困难:把新鲜的牛肌腱分离成纤维束非常困难,目前没有相关文献和技术报道;2、脱细胞困难:肌腱的抗原性主要来自胶原纤维束间的肌腱细胞,由于腱内膜和腱膜的层层包绕,现有的脱细胞同时对胶原蛋白造成不同程度的破坏。针对上述难点,该论文的研究目的包括:1、分离牛肌腱纤维束,保留胶原纤维原有的生物学性能;2、脱除肌腱细胞成分,减少对胶原蛋白和胶原纤维结构的影响;3、脱细胞牛肌腱纤维束材料的体外和体内生物相容性的检测;4、脱细胞纤维材料修复重建韧带缺损动物模型以及评价。二、研究方法(一)牛肌腱纤维分离选用成年黄牛四肢的趾伸和趾屈肌腱的中间段作为研究对象。将新鲜牛肌腱冻干(真空,-56℃)后,在常温下用机械方法将牛肌腱分离成牛肌腱纤维束。为了检测冻干和机械分离过程对胶原纤维的影响,设立新鲜牛肌腱组作为对照组,分别通过比较:1.组织学HE染色:胶原纤维的排列序列和紧密度,2.电镜扫描:胶原原纤维的形态,3.胶原蛋白定量,4.生物力学测定最大拉力载荷和弹性模量等方法进行评价,统计方法应用配对t检验,使用SPSS21.0软件计算。(二)牛肌腱纤维束脱细胞方法肌腱细胞的长度20-70μm、宽度8-20μm,脱细胞牛肌腱纤维束的直径50-200μm,附着于胶原纤维束间的肌腱细胞无腱外膜包绕,包绕胶原纤维束的腱内膜结构疏松且完整性在机械分离过程中破坏,无需化学去污剂破坏腱外膜和腱内膜的完整性。冻干牛肌腱纤维束用γ射线(15K Gray)消毒后,按如下步骤脱细胞:10m M tris-0.05%PMSF,24h,25℃+0.05%胰酶5h,25℃+90 U/m L脱氧核糖核酸酶(type II牛),5 h,37℃,+PBS 48h,-4℃。所有步骤均在无菌、摇床(室温,150RPM)进行,均加5ml/L青霉素/链霉素溶液(10000U/ml 10000mg/ml)溶液预防细菌污染,完成每一步骤均使用灭菌PBS冲洗3遍。脱细胞后与正常肌腱比较,Hoechst荧光染色在脱细胞过程中实时监测DNA成分脱除的效果,HE染色观察细胞核成分脱除和胶原纤维束的排列形态,电镜扫描观察脱细胞胶原原纤维和胶原纤维形态结构;细胞成分残留通过DNA定量检测,胶原蛋白定量检测评价脱细胞对肌腱胶原蛋白的影响。组间生物学特性和生物力学差异使用配对样本t-检验检测,应用SPSS21.0软件计算。(三)脱细胞牛肌腱纤维束异种体外细胞和体内组织相容性体外脱细胞牛肌腱纤维束的异种细胞相容性,选用实验细胞培养用的Ⅰ胶原蛋白(C7661大鼠来源)为对照组,选用SD大鼠鼠尾肌腱细胞分别与脱细胞胶原纤维和Ⅰ胶原蛋白复合培养,电镜观察细胞在脱细胞纤维束上生长的形态,MTT等检测比较细胞生长状态,差异通过重复方差检验分析比较,应用SPSS21.0软件计算。异种体内脱细胞牛肌腱纤维束的组织相容性评价,选用8周的SD大鼠,将脱细胞牛肌腱纤维束和SD大鼠自体肌腱埋入棘突旁肌肉组织内。分别在植入前、术后1、3和6周,通过HE染色观察脱细胞牛肌腱纤维束内部宿主细胞迁移、炎症细胞浸润,以及胶原纤维的排列结构,Masson染色观察内部胶原纤维的情况。(四)脱细胞纤维束修复重建韧带缺损动物模型选取3月的新西兰大白兔作为研究对象,切除一侧兔膝关节前交叉韧带,将脱细胞牛肌腱纤维束捻合成直径2mm的前交叉韧带替代物,进行兔膝关节前交叉韧带重建。术后6周观察关节内的炎症反应,行膝关节股骨远端、胫骨近端CT检查,观察替代物穿行的骨隧道变化;关节硬组织切片观察骨通道-韧带替代物界面愈合的情况三、结果(一)冻干牛肌腱纤维束新鲜肌腱冻干前后,重量前后比例5:2。机械分离获得的冻干肌腱纤维化束,扫描电镜检测,纤维束的直径为50-200μm,长度20-80mm。两组HE染色检测见胶原纤维形态无差别,但胶原纤维束间隙冻干牛肌腱纤维束组要大于新鲜肌腱组;扫描电镜下观察冻干胶原原纤维结构无破坏,同新鲜肌腱组。相同干重的冻干牛肌腱纤维束和新鲜肌腱的胶原蛋白定量、生物力学测定的最大拉力载荷和弹性模量均无统计学差异。