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摘要： 细胞生物学是现代生命科学的前沿学科之一，是基础医学的一门重要课程，其实验教学对于学生掌握细胞结构和功能、培养科学素养和创新能力具有重要意义。然而，传统的实验教学存在诸多不足，如实验资源有限、实验操作风险高、教学效果差等问题。虚拟仿真实验实训平台的应用为解决上述问题提供了新的途径。细胞生物学是现代生命科学的前沿学科之一，是基础医学的一门重要课程，也是我校生物技术和装备专业的必修课程。细胞生物学的实验教学是专业课程教学中的重要组成部分。细胞生物学是医学专业的一门重要基础理论课程，其实验教学对于学生掌握细胞结构和功能、培养科学素养和创新能力具有重要意义。

关键词： 急性髓系白血病   MALAT1   遗传学特征   细胞生物学功能  

摘要： 目的: 急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种以髓系干祖细胞异常增殖和分化阻滞为特征的恶性血液系统肿瘤,伴随细胞遗传学畸变,复杂性体细胞突变和基因表达改变。肺腺癌相关转录本1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是一种长链非编码RNA,在AML及其他血液系统恶性肿瘤中异常表达,但其与AML的临床特征之间的关系尚不明确。本研究分别检测了AML患者和健康对照组骨髓单个核细胞中MALAT1的表达情况。通过构建稳定敲低MALAT1的AML细胞模型,比较敲低MALAT1前后AML细胞的肿瘤源性变化及对化疗药物敏感性的影响。 方法: 1.采用实时荧光定量PCR方法,首先检测10例健康对照及40例AML患者骨髓单个核细胞中MALAT1表达情况。收集患者的临床资料,如性别、年龄、采样时的骨髓原始细胞比例及伴随的基因突变特征等,探索MALAT1表达水平与临床特征之间的联系。此后,我们在上述研究基础上再次纳入20例AML患者,分别检测治疗前、后MALAT1的相对表达水平,对比治疗后不同缓解状态下的MALAT1的相对表达水平。 2.构建稳定敲低MALAT1的AML细胞模型,应用CCK-8实验、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术及阿糖胞苷化疗抵抗实验评估MALAT1对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及阿糖胞苷敏感性的影响。 结果: 1.与健康对照组相比,AML患者MALAT1表达水平明显增高(P<0.0001)。 2.在AML的不同危险度分层中,低中危及高危AML患者MALAT1表达均高于健康对照组(P=0.0008,P=0.0002),但低中危与高危AML患者间差异无统计学差异(P=0.0548)。性别(P=0.945),年龄是否≥60岁(P=0.900),采样时骨髓原始细胞是否≥30%(P=0.536)及流式中原始细胞比例是否≥1%(P=0.323)的各分组间MALAT1表达差异无统计学差异。初治及复治AML患者的MALAT1表达均高于健康对照(P=0.0037,P<0.0001),但初治与复治患者间差异无统计学意义(P=0.986)。 3.在20例分别检测治疗前及治疗后MALAT1表达水平的患者中,治疗后MALAT1的表达明显低于治疗前(P<0.0001)。而在治疗后缓解的13例患者与未缓解的7例患者MALAT1的表达均较治疗前下降(P<0.0001,P=0.0062)。 4.伴有≥3个基因突变患者的MALAT1表达水平明显高于3个以下的患者(P=0.031),CEBPA突变患者MALAT1的表达明显低于野生型(P=0.013),而DNMT3A突变(P=0.016)患者的MALAT1表达高于野生型。 5.与未敲低MALAT1的AML细胞相比,MALAT1敲低的AML细胞的增殖能力明显下降。 6.敲低MALAT1会导致细胞周期在G0/G1期阻滞,但未对AML细胞的凋亡造成明显影响。 7.敲低MALAT1的细胞,对化疗药物阿糖胞苷的敏感性增强。 结论: ***1在AML患者中的表达明显高于健康人群,治疗后该基因表达较治疗前下降。伴有≥3个基因突变的AML患者的MALAT1表达水平明显高于3个以下的患者;CEBPA突变患者的MALAT1表达水平低于野生型,而DNMT3A及NPM1突变患者的MALAT1表达水平较野生型增高。 2.敲低MALAT1可抑制AML细胞的增殖,使细胞周期阻滞,但未影响细胞凋亡。敲低MALAT1增强了AML细胞对阿糖胞苷的敏感性。

关键词： 骨肉瘤   PSMD14蛋白   信号通路   细胞生物学  

摘要： 背景与目的：　　骨肉瘤恶性程度高，且易出现肺部器官的转移，严重影响青少年健康。PSMD14在肿瘤的恶性进展中发挥着至关重要的作用，且与肿瘤的分子生物学行为密切相关，据研究报道PSMD14主要发挥去泛素化酶的作用进而稳定底物蛋白的表达，并在多种恶性肿瘤中发挥致癌作用。本研究目的在于检测并分析骨肉瘤组织样本中PSMD14的表达情况，并探讨其对骨肉瘤细胞生物学行为的影响及其作用机制。　　方法:　　采用qRT-PCR检测骨肉瘤中mRNA的表达，免疫印迹法及免疫组化分析骨肉瘤组织蛋白的表达水平。接下来通过PSMD14-siRNA转染至于骨肉瘤细胞中，检测其转染成功后，分析PSMD14对骨肉瘤细胞增殖及迁移的影响能力。进一步构建荷瘤鼠及尾静脉注射转移瘤模型，分析PSMD14的表达对其荷瘤鼠的大小、体重及肺转移发生的影响，最后探讨PSMD14影响骨肉瘤生长及迁移作用机制。　　结果:　　我们的研究结果发现与对应的癌旁组织相比，骨肉瘤组织中PSMD14的表达水平显著提升，降低PSMD14的表达后显著抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移，机制上PSMD14通过激活Wnt/β-catenin信号通路进而影响骨肉瘤的增殖及迁移。　　结论:　　本研究阐述了PSMD14通过激活Wnt/β-catenin信号通路进而影响骨肉瘤的增殖及迁移，鉴于当前骨肉瘤的靶向治疗仍然缺乏特异性靶点，该研究有望为骨肉瘤特异性靶向治疗提供一定的依据。

关键词： 肺腺癌   蛋白酶体激活子亚基3   细胞生物学   信号通路  

摘要： 肺癌是全球范围内死亡率最高的癌症之一，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是最常见的病理类型，约占肺癌的40％。早期肺腺癌的症状较为隐蔽，一般于胸部CT筛查时被发现。与其他类型的肺癌相比，肺腺癌的生长速度较为缓慢，不过有时早期即可出现血行转移。近些年来，虽然靶向治疗和免疫治疗不断运用于肺腺癌的临床治疗并取得较为满意的效果，但是肺腺癌患者的5年生存率仍不理想。因此，寻找新的治疗靶点，对于提高肺腺癌患者的预后至关重要。　　蛋白酶体（Proteasomes）是一种多亚基复合物，主要由核心颗粒和调节颗粒两个部分组成。除了溶酶体之外，蛋白酶体作为一种具有ATP依赖性的蛋白降解途径，在蛋白质的降解过程中发挥着重要的作用，特别是对于错误折叠蛋白质的降解。目前蛋白酶体抑制剂已经广泛用于临床上抗病毒治疗以及抗肿瘤治疗。蛋白酶体激活子亚基3（Proteasome Activator Subunit3,PSME3）是一种蛋白质编码基因，能够与蛋白酶体的核心颗粒结合从而发挥作用。有报道指出，PSME3参与细胞周期的调控和抑制DNA损伤后的细胞凋亡，还在多种癌症的进展中发挥作用，然而PSME3在LUAD中的作用尚不清楚。所以，寻找PSME3在LUAD中呈现出的功能以及背后的机制，可以给临床的治疗提供新的选择。　　研究目的:　　1.探索PSME3在肺腺癌中表达情况以及和患者预后之间的关系。　　2利用动物实验和体外实验阐明PSME3对肺腺癌细胞恶性生物学行为的影响。　　3.初步探索PSME3促进肺腺癌进展的分子作用机制。　　研究方法:　　通过生物信息学分析、免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）、蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）以及实时荧光定量PCR（quantitative Real Time PCR,qRT-PCR）等方法评估PSME3在LUAD中表达的高低，并且探索与患者总生存期之间的关系;接着分别在A549细胞中下调和在PC9细胞中上调PSME3的表达，通过细胞计数试剂盒8（Cell counting kit8,CCK-8）实验、5-乙炔基-2’脱氧尿苷（5-Ethynyl-2''-deoxyuridine,EdU）实验、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验、细胞划痕实验、细胞凋亡实验和细胞周期实验等细胞生物学实验评估在体外条件下PSME3对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期以及凋亡的影响;通过给老鼠腋下种植LUAD细胞，检测PSME3是否在体内对LUAD增殖产生影响。利用转录组测序和通路相关富集分析筛选出PSME3调控肺腺癌进展的信号通路并通过Western Blot实验进行验证。　　研究结果:　　本研究证实，PSME3在LUAD患者中表达很高，而且影响了患者的总生存期。然后，经过动物实验和表型实验发现，PSME3不仅在体外情况下促进LUAD的增殖，在体内同样可以。此外，上调PSME3不仅可以明显提高LUAD的侵袭能力，还能够降低LUAD细胞的凋亡率，除此之外，还可以使细胞周期加快。下调PSME3后结果与之相反。最后，通过转录组测序分析，我们发现，敲低PSME3后细胞内TGF-β/SMAD信号通路的激活受到抑制。进一步，我们利用Western Blot实验验证通路中的关键分子，结果证明了PSME3能够调控TGF-β/SMAD信号通路，从而促进肺腺癌的进展。　　研究结论:　　***3在LUAD中的表达水平上升，而且和患者的总生存期有关。　　***3在体外和动物体内都表现出促进LUAD细胞的诸多恶性行为。　　***3通过调控TGF-β/SMAD信号通路促进肺腺癌的进展。

关键词： 结直肠癌   YTHDC1蛋白   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：　　结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率及死亡率逐年上升，而且逐渐年轻化。由于结肠镜、大便隐血试验及肿瘤标志物筛查等广泛开展，CRC的早期诊断率已经取得一定的改善，但 CRC临床症状出现晚，有些 CRC确诊时已处于中晚期，导致 CRC疗效不佳，因此探索 CRC诊断及治疗的靶点，改善患者预后仍是当前研究热点。研究发现 N6-甲基腺苷（m6A）甲基化修饰是常见的 RNA 修饰方式之一，参与多种肿瘤的发生发展。YTHDC1（YTH domain-containing protein 1）是一种m6A结合蛋白，通过与m6A修饰的RNA结合从而调控基因表达，在 CRC 中的表达及作用尚未完全明确。本课题旨在研究 YTHDC1在 CRC 中的表达，及其对 CRC 细胞生物学行为的影响及作用机制，为探索新的CRC的诊疗靶点提供一定的实验依据。　　方法：　　1.用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）法检测 YTHDC1在 30例CRC 组织及 13 例正常大肠黏膜组织（Normal）中的表达情况，收集 CRC 患者的临床、病理资料，分析 YTHDC1 的表达与各项临床、病理指标之间的相关性。　　2.构建 YTHDC1 敲低慢病毒（sh-YTHDC1），将 sh-YTHDC1及空载体慢病毒（sh-NC，阴性对照组）分别感染 HCT-116 细胞，用嘌呤霉素多次筛选得到成功感染的细胞， qRT-PCR 法检测YTHDC1的敲低效果。　　3.分别用 CCK-8 法、克隆形成实验检测 HCT-116 细胞的增殖情况，流式细胞术检测HCT-116细胞凋亡，划痕实验检测HCT-116细胞迁移情况。　　4.用Western blot 检测 MAPK通路中磷酸化（p）-p38 MAPK、 p38 MAPK蛋白表达情况。　　结果：　　***1 在 CRC 组织中的表达及与 CRC 患者各项临床、病理指标的相关性　　qRT-PCR结果显示，在 CRC组中 YTHDC1 mRNA的表达明显低于Normal组，差异具有统计学意义（P＜0.05）;YTHDC1的低表达与患者年龄、性别、病理分期、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、是否有远处转移等均无明显相关性（P＞0.05）。　　***1对CRC细胞增殖、凋亡、迁移的影响　　与 sh-NC 组相比，sh-YTHDC1 组 HCT-116 细胞的 YTHDC1 mRNA 表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）;细胞增殖和迁移能力增强，凋亡率下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。　　3. YTHDC1对 p38 MAPK信号通路的影响　　与 sh-NC 组相比，sh-YTHDC1 组 HCT-116 细胞 p-p38 MAPK蛋白表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。　　结论：　　***1 在 CRC 组织中表达下调， YTHDC1 的低表达与CRC患者临床病理指标无明显相关性。　　2.敲低 YTHDC1 可促进 CRC 细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡。　　3.敲低YTHDC1可抑制p38 MAPK信号通路。

关键词： 脂肪组织工程   间充质干细胞   慢病毒感染   生物学特性   脂肪移植保留率   WNT信号通路  

摘要： 研究背景: 损伤和恶性肿瘤引发的软组织缺失是整形外科面临的临床难题,给病患外观及功能带来较大影响。传统治疗措施包括组织瓣移植、填充人工材料或者脂肪移植等,但这些方式都有其一定局限性。组织工程和再生医学作为新兴领域,利用种子细胞提供了修复受损组织的新思路,其中,间充质干细胞（MSC）以其自我更新和多向分化潜力引发关注。人体多种组织中都能够获得MSC,通过诱导MSC分化可生成骨、软骨和脂肪等,展示出MSC在组织工程中的广阔应用前景。脂肪来源的干细胞（Adipose Derived Stem Cell,ADSCs）即是脂肪组织内的间充质基质/干细胞（MSC）的一种独特亚型,具有再生和免疫机能,对调控脂肪细胞活动和皮肤再生中扮演着关键角色。胎盘间充质干细胞（placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs）因其增长迁移克隆形成和免疫调节功能,成为组织工程学研究中备受瞩目对象。相较于从骨髓中提取MSC需侵入性采摘且易产生痛楚,胎盘间充质干细胞的组织来源广泛,含有丰富的组织细胞,获取流程简单且无伦理争议,此外,胎盘组织富含干细胞且具有高效繁衍特性,因此被视为间充质干细胞的优质来源。人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）是从脐带内表皮层和华通氏胶（Wharton’s jelly）中分离出来的具备间充质干细胞全部特性,同时也是是最容易获取的组织之一,只需要健康的母亲提供分娩后的脐带进行培养和扩大繁殖即可得到。hUC-MSCs也可以向受损的组织归巢,并能促进各种组织损伤的修复。 HOXC10基因是同源框基因家族中的一员,在细胞分裂周期和繁殖过程中起重要作用,它并不只是在分化阶段表达,还会对繁殖刺激做出反应[7]。大量证据表明,HOXC10与哺乳动物的脂肪代谢密切相关[8-10]。推断该基因可能在肥胖症、脂肪位置不当以及由此引发的全身性代谢紊乱和脂肪功能改变中扮演关键角色[11]。HOXC10基因在干细胞分化过程中也起关键作用:它通过调控一系列关键转录因子的表达,进而控制细胞的分化方向。HOXC10基因的表达水平直接影响细胞的多能性和分化潜能[12],在分化过程中,HOXC10基因能够调节细胞的细胞周期、增殖和分化等关键生物学过程,从而决定细胞的命运。HOXC10基因的敲除或突变会导致细胞分化的异常,进而影响整个生命体的发育和功能。因此,对HOXC10基因的研究不仅能够揭示干细胞分化的机制,还能为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。 研究目的: 成功分离人脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）、脐带来源间充质干细胞（UC-MSCs）以及胎盘来源间充质干细胞（P-MSCs）;通过慢病毒感染获得过表达HOXC10基因以及敲低HOXC10基因的细胞,研究HOXC10基因对不同来源间充质干细胞细胞增殖、迁移以及成脂分化能力的影响。本研究希望能通过对不同来源间充质干细胞中HOXC10基因对其生物学特性的影响的观察,为不同来源间充质干细胞在脂肪组织工程中的应用提供新思路;通过观察过表达HOXC10基因脂肪间充质干细胞与颗粒脂肪联合移植后的移植物保留率,进一步确定HOXC10基因对脂肪组织移植后体积留存的影响,并了解其可能的机制,以优化和改善颗粒脂肪移植的术后效果。 研究方法: 1.取来自健康成年女性腹部脂肪以及来自适龄期足月产健康产妇分娩的脐带、胎盘,使用酶消化法分离人ADSCs、P-MSCs,组织块贴壁法分离人UC-MSCs;流式细胞术鉴定所分离干细胞表面标记物;成脂诱导及成骨诱导所分离干细胞; 2.将空载病毒感染至ADSCs与正常ADSCs比较,通过WB技术验证病毒本身是否会影响HOXC10基因表达,分别将sh-HOXC10、3xflag-HOXC10感染至ADSCs、UC-MSCs、P-MSCs,分别记作敲低组（SH组）、过表达组（OE组）,同时将各组干细胞进行成脂诱导。RT-qPCR检测各组细胞HOXC10 mRNA及蛋白表达量;采用Western blotting检测各组细胞中HOXC10、过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPARγ）、重组人CCAAT增强子结合蛋白-α（C/EBP-α）蛋白水平。Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞增殖;Transwell小室实验检测细胞迁移能力。 3.将感染HOXC10基因的ADSCs与人颗粒脂肪混合并进行分组,G1组:颗粒脂肪0.2ml+PBS0.1ml;G2组:颗粒脂肪0.2ml+脂肪间充质干细胞（ADSCs）0.1ml（5×10～6/ml）,G3组:颗粒脂肪0.2ml+空载慢病毒的ADSCs0.1ml（5×10～6/ml）;G4组:颗粒脂肪0.2ml+过表达HOXC10 ADSCs0.1ml（5×10～6/ml）。将四组脂肪移植于裸

关键词： 妊娠早期   缝隙连接蛋白43   生理性低氧   滋养细胞   生物学功能   乳酸代谢   糖酵解  

摘要： 目的:　　母胎界面是子宫和胎盘结构协同作用促进胎儿发育的动态部位，滋养细胞是其微环境中的主要细胞类型，滋养细胞功能的任何失调都可能导致妊娠丢失和/或不良妊娠结局。在整个妊娠期间胎盘微环境中的氧水平是动态变化的，而在妊娠早期存在生理性低氧，胎盘组织氧分压不超过20 mmHg（相当于氧浓度2％-3％）。在宫内生理性低氧期间，滋养细胞通过缺氧诱导的一系列适应性反应，维持及调控其生物学行为，包括细胞的自我更新、增殖和分化，以及细胞能量代谢特征的改变，因此需要相邻滋养细胞间建立准确且高效的、能够允许生物信息交换的通讯连接，以保证细胞整体代谢功能和增殖分化协调进行。细胞缝隙连接通讯（Gap junctional intercellular communication,GJIC）是细胞间最重要的通讯方式之一，而缝隙连接蛋白43（Connexin 43,Cx43）是缝隙连接蛋白家族中最普遍、分布最广泛的成员，许多文献表明Cx43参与各种缺血/缺氧疾病的病理生理过程，但关于妊娠早期滋养细胞中Cx43研究并不多。那么Cx43是否参与了妊娠早期生理性低氧（2％O2）环境中滋养细胞的适应性反应？低氧（2％O2）条件下Cx43对滋养细胞的功能有何影响呢？为解决以上科学问题，本研究重点探讨了在生理性低氧条件下Cx43对滋养细胞生物学功能的影响及其可能的机制，为妊娠并发症的防治提供新的靶点和思路。　　方法:　　1.利用三气细胞培养箱模拟妊娠早期生理性低氧（2％O2）微环境，通过CCK-8实验和平板克隆形成实验，检测低氧条件下滋养细胞增殖能力的变化，通过Transwell实验检测低氧条件下滋养细胞迁移、侵袭能力，通过CalceinAM/DiI双染实验检测低氧条件下滋养细胞缝隙连接通讯功能，通过溴化乙锭摄取实验检测低氧条件下滋养细胞半通道开放情况。　　2.收集正常早期妊娠者绒毛和蜕膜组织，通过实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR）和免疫印迹实验（Western Blotting）检测母胎界面 Cx43的表达情况。同时对滋养细胞系进行RT-qPCR和Western Blotting实验检测Cx43的表达水平。　　3.收集低氧条件下滋养细胞mRNA及蛋白，通过RT-qPCR和Western Blotting实验检测滋养细胞中Cx43的水平变化，并通过免疫荧光技术检测滋养细胞内Cx43定位情况。　　4.通过瞬时转染小干扰RNA（short interfering RNA,siRNA）方式构建Cx43敲减细胞模型。　　5.通过CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验评估低氧条件下Cx43对滋养细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术检测低氧条件下Cx43对滋养细胞周期进程及细胞凋亡的影响;通过Calcein AM/DiI双染实验检测低氧条件下Cx43敲减组滋养细胞缝隙连接通讯功能的变化。　　6.收集低氧条件下滋养细胞对照组及Cx43敲减组细胞和培养上清，检测细胞内外乳酸水平。同时收集低氧条件下滋养细胞对照组及Cx43敲减组细胞蛋白，通过Western Blotting实验检测糖酵解通路关键分子表达情况。　　7.低氧条件下乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase A,LDHA）抑制剂草氨酸钠处理滋养细胞，减少细胞乳酸生成，收集滋养细胞mRNA及蛋白，通过RT-qPCR和Western Blotting实验检测滋养细胞中Cx43的水平变化，验证Cx43与乳酸之间存在反馈调节。　　8.通过Western Blotting实验检测低氧条件下Cx43调节滋养细胞功能可能的信号通路。　　结果:　　1.生理性低氧（2％O2）条件下，滋养细胞增殖能力上调，迁移、侵袭能力提高，细胞间缝隙连接通讯增强，半通道无异常开放。　　2.正常妊娠早期者绒毛和蜕膜组织中Cx43均有表达。三种滋养细胞系HTR-8/SVneo、JAR、JEG-3 均可表达 Cx43。　　3.低氧促进滋养细胞Cx43表达上调，Cx43细胞内定位呈现更强细胞极性排列,在细胞边缘相互连接处更密集。　　4.低氧条件下，CCK-8、克隆形成、EdU实验结果显示，Cx43减少抑制滋养细胞增殖;流式结果表明，Cx43减少使细胞周期进程受阻，抑制滋养细胞由G0/G1期进入S期，并促进滋养细胞凋亡，同时Western Blotting实验表明Cx43减少使促细胞周期进程分子CDK2和抗凋亡分子BCL2下调，而抑制细胞周期进程分子P27和促凋亡分子BAX上调;Calcein AM/DiI双染实验表明，Cx43减少会减弱滋养细胞间耦联。　　5.低氧条件下，乳酸水平检测表明，Cx43减少抑制滋养细胞乳酸生成与分泌。同时，Western Blotting实验表明Cx43减少可以抑