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关键词： 非编码   陈玲玲   生物化学   细胞生物学   DDX21   pre-rRNA   聚合酶  

摘要： 文章简介人体细胞中含有约400个拷贝的核糖体DNA(r DNA)序列,分布于五条染色体上,这些含有r DNA序列的区域被称为核仁组织区(nucleolar organizing regions,NORs)。核仁围绕NOR形成,是RNA聚合酶I转录核糖体RNA(r RNA)以及r RNA加工的重要场所。

关键词： 非小细胞肺癌   miR-515-5p   CXCL6   顺铂耐药  

摘要： 目的在本研究中,我们对miR-515-5p和CXCL6在NSCLC中的表达情况进行检测,分析两者与NSCLC临床病理参数的关系,同时通过体外细胞实验研究miR-515-5p和CXCL6在NSCLC中的潜在作用以及靶向关系。旨在明确miR-515-5p和CXCL6介导NSCLC细胞增殖、凋亡以及化疗耐药性等作用机制,为寻找NSCLC新型诊疗分子靶点奠定理论和实验基础。方法(1)采集50例于2015年9月～2016年9月期间就诊于苏州大学附属第一医院胸外科且行手术切除的NSCLC患者的癌组织和癌旁相应正常组织。采用荧光定量PCR法分别检测各组织中miR-515-5p和CXCL6 mRNA的表达情况,western blot法检测各组织中CXCL6蛋白的表达情况,免疫组化法检测CXCL6在各组织样本中的分布情况。分析miR-515-5p和CXCL6与NSCLC患者临床病理参数的关系,以及miR-515-5p和CXCL6之间的相关性。(2)将10 ng/mL CXCL6作用于A549细胞,采用微阵列芯片分析CXCL6对肺癌A549细胞miRNA表达谱的影响。将10 ng/mL CXCL6作用于肺癌细胞系H524、HCC827、H1650、95C、95D、A549、H1299、H460 和 BEAS2B,作用24 h后收集细胞,提取细胞总RNA,采用荧光定量PCR法检测各组细胞中miR-515-5p的表达。采用生物学软件预测miR-515-5p的靶基因并通过荧光素酶报告系统进行验证。分别将miR-515-5p mimic或miR-515-5p inhibitor转染A549和H1299细胞,收集培养细胞上清液,用ELISA法检测CXCL6蛋白的含量,检测各组细胞中CXCL6 mRNA的表达。分别将control质粒、miR-515-5p mimic、miR-515-5p mimic+CXCL6 转染 A549 和 H1299 细胞,采用 CCK-8 法检测各组细胞的增殖活性,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力。采用荧光定量PCR分别检测转移性NSCLC和非转移性NSCLC组织中miR-515-5p的表达。分别将 control 质粒、miR-515-5p mimic、miR-515-5pmimic+CXCL6 转染 A549 和 H1299 细胞,随后各组细胞均用 10 mg/L 顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)处理,48 h后检测细胞的凋亡率。分别用miRNA control、miR-515-5p mimic、miR-515-5p mimic+CXCL6、10 mg/LDDP、miR-515-5p mimic+10 mg/L DDP、miR-515-5p mimic+CXCL6+10 mg/L DDP 处理A549和H1299细胞细胞,48 h后检测各组细胞的增殖活性。结果(1)与癌旁正常组织相比,NSCLC组织中miR-515-5p的表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01),CXCL6mRNA和蛋白的表达水平增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。CXCL6蛋白主要在细胞膜或者细胞质中阳性表达,阳性判定标准为细胞浆染色呈黄色或棕褐色颗粒状。与转移性NSCLC组织相比,非转移性NSCLC组织中miR-515-5p的表达水平增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与癌旁正常组织相比,NSCLC组织中CXCL6蛋白免疫组化染色的平均灰度值增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-515-5p和CXCL6的表达与NSCLC患者的年龄、性别、病理类型、是否吸烟无关,而与患者的临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移有关,即随着NSCLC患者的临床分期越高、肿瘤体积越大、发生淋巴结转移,则miR-515-5p的表达水平越低,CXCL6的表达水平越高。miR-515-5p与CXCL6的表达之间存在负相关(r=-0.833,P=0.001)。(2)CXCL6处理的A549细胞中miR-141、miR-200a、miR-1268、miR-99a、miR-93、miR-101、miR-786、miR-510、miR-196c、miR-515-5p的表达水平发生下调,而miR-17、miR-155、miR-337-5p、miR-215、miR-19b、miR-181b的表达水平则发生上调,结果与miRNA阵列结果相一致。对8个NSCLC细胞中miR-515-5p的表达水平进行检测,结果显示A549细胞、H1299细胞和H460细胞中miR-515-5p的表达水平最低。CXCL6被预测为miR-515-5p的一个靶基因,miR-515-5p在CXCL6上所绑定的位置位于其3’UTR区域。在A549细胞和H1299细

关键词： 富血小板血浆   去白细胞富血小板血浆   分解代谢   髓核间充质干细胞  

摘要： 目的:比较去白细胞富血小板血浆(P-PRP)与含白细胞富血小板血浆(L-PRP)对兔椎间盘髓核来源间充质干细胞(NPMSCs)增殖、分化、细胞外基质和NF-κB信号通路激活的影响。方法:实验选取24只雌性,6-8个月龄,体重3-4kg新西兰大白兔。每只大白兔分别抽取30ml动脉血,随机分为对照组、P-PRP组和L-PRP组。随后提取兔椎间盘髓核来源间充质干细胞并鉴定。选取P2 NPMSCs在transwell细胞小室中与对应的不同浓度(0%、5%、10%和20%Vol/Vol)的PRPs(P-PRP或L-PRP)共培养三天后,CCK-8检查各组细胞增殖率。再选取各组P2细胞,分别加入各组对应的培养基(普通培养基、10%P-PRP、10%L-PRP)共培养。14天后,使用实时定量荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)测定各组细胞MSCs干性基因(Oct4,Nanog)、髓核细胞相关基因(Collagen II,Aggrecan)、炎症因子(TNF-α,IL-1β)以及基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-13)的表达;酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定TNF-α、IL-1β、MMP-1和MMP-13浓度;Western Blot检测NF-κB/p65、Collagen II以及Aggrecan蛋白表达;免疫荧光实验检测各组细胞Collagen II以及Aggrecan蛋白表达。结果:NPMSCs与PRPs共培养后,其增殖率表现出对PRPs剂量依赖性,其中在PRPs浓度10%时细胞增殖率最大(P<0.05)。共培养两周后,实验组(P-PRP组或L-PRP组)细胞形态由纺锤形样细胞逐渐转变成瘦长梭形髓核样细胞,同时,实验组干细胞标志基因(Oct-4,Nanog)的表达是对照组的30%,而髓核细胞胞相关基因(CollagenII,Aggrecan)的表达,是对照组3至4倍(P<0.05)。L-PRP中白细胞和炎症因子浓度(TNF-α,IL-1β)明显高于P-PRP组(P<0.05)。与P-PRP组相比,L-PRP组细胞中炎症因子(TNF-α,IL-1β)、基质金属蛋白酶(MMP-1,MMP-13)以及NF-κB p65表达明显增多(P<0.05)。P-PRP组细胞外基质相关蛋白(Collagen II,Aggrecan)表达明显高于L-PRP组(P<0.05)。结论:P-PRP和L-PRP均可以促进NPMSCs增殖并诱导其成髓核样细胞分化,剔除PRP中白细胞可以减少炎症反应,避免细胞NF-κB信号通路的激活以及抑制细胞分解代谢反应。

关键词： 结直肠癌   阿司匹林   braf突变细胞   生物学行为  

摘要： 目的探索不同浓度阿司匹林对结直肠癌braf突变细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响及可能的作用机制.筛选出阿司匹林最佳治疗剂量,为阿司匹林的抗癌作用提供理论基础.　　方法利用MTT实验检查不同浓度阿司匹林(0mmol/L,2.5mmol/L,5mmol/L和10mmol/L)对结直肠癌RKO及RKO-braf突变细胞24h,48h,72h,96h和120h增殖的影响;利用平板克隆实验检测不同浓度阿司匹林对结直肠癌RKO和RKO-braf细胞克隆形成能力的影响;利用划痕实验检测不同浓度阿司匹林对结直肠癌RKO和RKO-braf细胞24小时、48小时划痕愈合能力的影响;Transwell实验检测不同浓度阿司匹林对RKO和RKO-braf细胞迁移和侵袭能力的影响;Westernblot检测不同阿司匹林浓度作用于RKO细胞和RKO-braf突变细胞48h后迁移相关蛋白的变化.　　结果MTT实验结果显示不同浓度阿司匹林浓度(2.5mmol/L,5mmol/L和10mmol/L)对RKO细胞和RKO-braf突变细胞活力均有抑制作用,随着时间和药物浓度的增加,而且有显著性差异(P<0.05).平板克隆实验显示不同浓度阿司匹林浓度对RKO细胞和RKO-braf突变细胞细胞克隆形成均有抑制作用,不同浓度阿司匹林(0mmol/L,2.5mmol/L,5mmol/L和10mmol/L)作用下,RKO细胞克隆形成率分别为:96.67±1.76%,70.90±1.01%,3.17±1.76%,3.00±1.00%;RKO-braf突变细胞克隆形成率分别为:97.17±1.26%,71.33±2.01%,4.17±0.77%和3.33±0.58%,不同阿司匹林浓度之间有显著性差异(P<0.05).划痕实验显示:阿司匹林浓度(2.5mmol/L,5mmol/L,10mmol/L)对RKO细胞和RKO-braf突变细胞划痕愈合能力均有抑制作用,而且有显著性差异(P<0.05).随着时间的推移抑制率明显增加.Transwell实验显示不同阿司匹林浓度作用下,RKO细胞24小时后迁移细胞数目分别为:294.33±5.51,291.00±5.29,46.67±4.04,32.67±4.51;RKO-braf突变细胞各浓度对应迁移细胞数目分别为:285.00±7.00,270.00±5.57,50.33±5.03和44.00±5.57.不同浓度的药物对结直肠癌细胞迁移能力有抑制作用,而且有显著性差异(P<0.05).Westernblot实验结果显示阿司匹林浓度(5mmol/L和10mmol/L)能显著下调cox-2和VEGF水平,这提示阿司匹林可以通过下调COX-PGE2-PI3K通路及VEGF表达水平来抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭.各实验组中,阿司匹林浓度5和10mmol/L之间没有显著性差异.　　结论不同浓度阿司匹林对结直肠癌RKO和RKO-braf突变细胞增值、迁移和侵袭均有抑制作用,作用强度和阿司匹林浓度相关,5mmol/L的阿司匹林效价比最高,我们推荐体内实验及临床应用要参照浓度为5mmol/L阿司匹林.其作用机理可能通过抑制COX-PGE2-PI3K信号通路有关.

关键词： 儿童急性淋巴细胞白血病   miR-195   Bcl-2   细胞增殖  

摘要： 背景在世界范围内,白血病的发病率位居前十,约占恶性肿瘤总发病率的5%。白血病是造血系统的恶性增殖性疾病,其主要特征是白血病细胞在骨髓或者其他造血系统组织中发生进行性、失控性异常增殖,从而浸润机体各组织器官,导致机体出现相应的临床病理变化,除此之外外周血细胞的质和量亦发生改变。白血病在35岁以下人群中发病率和致死率均居前列,且发病率呈逐年上升趋势。值得关注的是在儿童以及青少年中,其发病率居于第一位,成为威胁儿童和青少年健康的主要恶性肿瘤之一。目前,单纯化疗已经能够大幅度的提高ALL儿童的长期无病生存率,但依然有部分患儿由于对化疗不敏感,或缓解后再次复发,预后仍不理想。因此,寻找可以预测白血病患儿预后的分子标志和寻找新的治疗靶点成为亟待解决的问题。近年来,microRNAs(miRNA)作为具有多种生物学功能的小分子RNA,在多种肿瘤的进展过程中都发挥了极其重要的作用,成为肿瘤领域的研究热点。现有的研究表明,miRNA由于其种类繁多使得其功能强大,成为各种调控机制中的重要信号分子。其作用一方面是作为一种促癌因子,促进肿瘤细胞在组织中的进展,加快了疾病的进程;而另一方面作为一种抑癌分子,抑制肿瘤细胞的转移,其机制主要是通过靶向并抑制癌基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移等一系列生物学行为。目前有研究表明,miRNA-195在多种肿瘤组织表达与正常组织相比有所降低,提示其可能在恶性肿瘤的发生和进展中发挥着重要作用。目的本文通过研究miR-195及其靶基因Bcl-2在儿童ALL患者机体内骨髓组织中的表达,并分析他们与患者临床病理特征之间的关系,进而探讨miR-195表达异常对肿瘤细胞的增殖,凋亡及细胞周期,侵袭转移等生物学行为的影响及机制。希望能够为ALL的预后提供新的分子标记,为靶向治疗提供新的治疗靶点。方法(1)通过生物信息学软件预测miR-195调控细胞增殖及细胞周期相关的靶基因,并进行筛选。(2)选择2010年7月至2014年12月在郑州大学第一附属医院儿童血液肿瘤科就诊的ALL患儿为研究对象,共64例。所有受试对象分别抽取骨髓样品2-5mL。采用RT-PCR分析miR-195的含量,RT-PCR和Wetern-blot检测Bcl-2的表达。根据上述所得到的结果再进一步分析miR-195和Bcl-2与ALL患儿临床病理资料的相关性。(3)人外周血白血病Jurkat细胞被转染上miR-195 mimic,细胞中miR-195的表达得到提高;该Jurkat细胞中miR-195 mRNA表达含量运用荧光定量PCR来检测;分别应用MTT法;Annexin V-FITC/PI双染法;流式细胞术;Transwell小室法;细胞划痕实验来检测miR-195对细胞增殖、凋亡、周期的影响;及对细胞的侵袭能力和对细胞迁移能力的影响。(4)将转染miR-195 mimic的Jurkat细胞随机分为2大组:即第一组(1)转染miR-mimics-mock组;(2)转染miR-195 mimic组。第二组(1)不加入miR-195抑制剂;(2)加入miR-195抑制剂组:按40 nmol/L浓度加入miR-195抑制剂。荧光定量PCR检测各处理组中miR-195的表达情况;运用BrdU细胞增殖实验检测各实验组细胞的增殖情况;western blot法检测各实验组中Bcl-2蛋白的表达情况。结果(1)我们通过生物信息学软件进行靶基因预测和筛选,结果表明,miR-195能与CCND1、Bcl-2、Bcl-6、CCNE1、CDK6、CDC25A mRNA3’UTR区互补配对。在细胞系中转染miR-195mimic后,利用RT-PCR检测六种候选基因的变化情况,结果发现BCL-2变化最为显著。因此,本研究选择miR-195及其靶基因BCL-2作为研究对象。(2)miR-195在ALL对照组和缓解组中的表达显著高于初诊及复发患儿,在初诊和复发患儿中呈低表达现象,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-195在标危、中危及高危患儿中的表达亦存在明显区别,同时随着ALL危险程度的提高,miR-195的表达呈逐渐下降趋势。Bcl-2mRNA及蛋白的含量在ALL初诊及复发患儿中的表达显著高于对照组和缓解组,差异有统计学意义(P<0.05);缓解病例中的Bcl-2mRNA及蛋白表达量明显降低,而在复发组中Bcl-2的表达再次发生异常增高。Bcl-2mRNA及蛋白在标危、中危及高危患儿中的表达亦存在明显区别,同时随着ALL危险程度的提高,Bcl-2表达呈逐渐增高趋势。(3)用miR-195 mimic转染Jurkat细胞,MTT法分别检测转染24、48、72、96h时Jurkat细胞增殖抑制率,结果显示转染组各时间点增殖抑制率均高于与阴性对照组,差异均有统计学

关键词： 脂肪间充质干细胞   细胞间黏附分子-1   肿瘤坏死因子-α   免疫抑制   低温保存  

摘要： 研究背景间充质干细胞(MSCs)具有独特的低免疫原性和免疫调节作用。脂肪来源间充质干细胞(ASCs)具有取材方便、来源充足等优势,已成为MSCs领域的研究热点。研究表明,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在炎症微环境中高表达细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞间黏附分子1(VCAM-1),当封闭这些黏附分子或者促使这些黏附分子无法表达后,BMSCs的免疫抑制能力会显著降低。ASCs中仅高表达ICAM-1,ICAM-1是否对人ASCs的生物学特性以及免疫抑制功能发挥重要的调节作用还未见文献报道。此外,干扰素-γ(IFN-y)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1 β(IL-1 β)等细胞因子是BMSCs发挥免疫抑制活性不可缺少的“授权”因子,它们都可以增强BMSCs的免疫抑制能力,而这些细胞因子是否通过ICAM-1影响ASCs的免疫抑制功能尚待探讨。明确ICAM-1对ASCs的生物学特性及免疫抑制功能的影响,将为深入了解ASCs的免疫调节特性及临床应用提供新的理论依据。研究目的1.探讨ICAM-1对ASCs增殖、凋亡、周期、迁移以及成脂、成骨、成软骨分化等生物学特性的影响。2.探讨ICAM-1对ASCs免疫调节功能的影响。3.探讨TNF-α对ASCs中ICAM-I表达的影响及机制。4.探讨适合ASCs的最佳冻存液以及低温保存对ASCs免疫调节功能的影响。研究方法***-1对ASCs生物学特性的影响采用胶原酶消化法从脂肪组织中获得ASCs,倒置显微镜下观察,成脂、成骨、成软骨分化诱导,流式细胞仪进行表面标志物检测。构建ICAM-1的敲减和过表达质粒,利用慢病毒感染的方法在ASCs中敲减和过表达ICAM-1,CCK-8法检测ASCs增殖,Muse细胞状态分析仪检测细胞凋亡和周期的变化,划线法和Transwell法检测细胞迁移能力的改变,分别使用油红O、茜素红和阿利新蓝对成脂、成骨、成软骨诱导后的ASCs进行染色以检测ASCs的分化能力。***-1对ASCs免疫调节功能的影响提取外周血单个核细胞(PBMC),CFSE染色后,分别按照1:10、1:20、1:40、1:80、1:160的比例接种ASCs和PBMC,显微镜下观察ASCs对PBMC增殖的影响,流式检测ASCs对PBMC增殖的影响。按照1:10的比例分别以接触共培养和Transwell隔离共培养的方式接种ASCs和PBMC,显微镜下观察ASCs对PBMC增殖的影响,流式检测ASCs对PBMC增殖的影响。流式检测ICAM-1敲减组(shICAM-1组)、ICAM-1敲减对照组(shScramble组)、ICAM-1过表达组(ICAM-1-OV组)和ICAM-1过表达对照组(PCDH组)ASCs对PBMC增殖的影响。***-α对ASCs中ICAM-1表达的影响以及机制体外分别添加TNF-α和IFN--γ,以及转化生长因子-β1(TGF-β1)、单核细胞超化蛋白-1(MCP-1)、IL-1 β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 等细胞因子,流式检测 BMSCs和ASCs中VCAM-1和ICAM-1的表达。采用干细胞培养基、L-DMEM+FBS、L-DMEM+人血清、L-DMEM+血小板裂解液、F12培养基+FBS五种条件进行培养,流式检测不同培养条件下ASCs中ICAM-1的表达。干细胞培养基条件下对ASCs进行传代培养,流式检测P2到P9不同代数ASCs中ICAM-1的表达。采用P3代ASCs,流式检测0.1～100ng/mL不同浓度TNF-α对ASCs中ICAM-1的表达的影响。Reαl-time PCR和流式分别检测5ng/mL TNF-α在1h、3h、6h、12h、24h、48h时间点对ASCs中ICAM-1基因和蛋白表达量的影响。检测mTOR通路抑制剂PP242和Rapamycin、JNK通路抑制剂SP600125、MEK1/2通路抑制剂U0126和NF-κB通路抑制剂 BAY11-7082对ASCs中ICAM-1表达量的影响以及TNF-α导致ASCs中ICAM-1表达量变化的影响。4.不同配比冻存液对ASCs生物学特性及ICAM-1的表达和免疫调节功能的影响分别采用不同比例的FBS和DMSO组合的冻存液冻存ASCs,然后使用Muse细胞分析仪检测各组细胞的细胞活力;CCK-8法检测冻存组以及新鲜组ASCs增殖能力;流式检测冻存组以及新鲜组ASCs细胞表面标志物及ICAM-1的表达;油红O、茜素红和阿利新蓝染色分别检测冻存组以及新鲜组ASCs成脂、成骨、成软骨分化;流式检测95%FBS和5%DMSO冻存组和新鲜组ASCs对PBMC的体外增殖的影响。研究结果***-1对ASCs生物学特性的影响P3代ASCs呈成纤维样贴壁生长,CD44、

关键词： 医学细胞生物学   医学专业   教学思考   计算机辅助教学   民考民学生  

摘要： 为了提高新疆医科大学维吾尔医学专业及哈萨克医学专业教学质量,提高少数民族学生的国语水平并在此基础上系统的掌握现代医学知识,使学生能够在将来更好地为全疆各民族患者提供更好的医疗服务,新疆医科大学决定对上述少数民族医学专业实施以国家通用语言文字为主的国语教学。目前在新疆医科大学开设的维吾尔医学专业及哈萨克医学专业就读的学生完全由少数民族组成,大多数来自偏远村镇或农牧区而且以民考民学生(以汉语言文字授课为主,也

关键词： 骨髓间充质干细胞   TET2基因   骨髓增殖性疾病  

摘要： 骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stromal cells,BMSCs）是一类具有自我更新和分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞等多种细胞能力的多能干细胞。BMSCs还能分泌多种细胞因子,发挥维持长期培养启始细胞的增殖、支持造血和促进造血恢复的作用,说明BMSCs可以通过模拟骨髓微环境发挥调控造血的功能。表观遗传学调节基因的异常在血液髓系肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。DNA甲基化是最重要的表观遗传学修饰之一。TET2（Ten-eleven translocation 2）是TET氧化酶蛋白家族成员之一,是DNA去甲基化过程中的重要酶,能将5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5mC）转化成5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine,5hmc）,通过改变启动区甲基化状态来调控基因表达,进而影响血液髓系肿瘤的发生和发展。目前,大量研究都集中在TET2对造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）的生物学影响,且研究发现TET2在HSC中有重要作用,但是TET2在BMSCs中的作用研究尚少,仍不清楚。本研究利用动物实验和体外实验探究TET2异常BMSCs的生物学特性及调控造血的功能。本研究分为以下三个部分:第一部分:应用密度梯度离心获得Tet2敲除小鼠(Tet2-/-)的骨髓单个核细胞,并通过贴壁法获取并传代纯化得到BMSCs。获取的BMSCs在适宜的培养条件下培养至第4代,用流式细胞术检测BMSCs的免疫表型;RT-PCR检测野生型小鼠（WT）BMSCs和Tet2-/-BMSCs干细胞多能性相关基因Sox2和Nanog的表达情况;球体形成实验和克隆形成实验检测Tet2-/-BMSCs的自我更新能力;通过每3-4天计数一次BMSCs细胞数,一直到第18天为止,绘制生长曲线,观察Tet2-/-BMSCs的增殖能力;克隆形成实验和茜素红染色实验检测Tet2-/-BMSCs成骨分化能力。结果显示:BMSCs表达表面抗原CD90、CD105和CD44,不表达CD11a、CD11b、CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD14、Ter119和vWF;Tet2-/-BMSCs的自我更新能力和增殖能力增强;Tet2-/-BMSCs向成骨分化的能力增加。第二部分:应用鹅卵石样区域细胞形成（Cobblestone-area-forming cells,CAFC）实验和造血细胞克隆形成实验检测BMSCs造血支持能力;通过RNA-Seq检测和细胞因子芯片检测BMSCs表达细胞因子情况。结果发现:Tet2-/-BMSCs增加了造血支持能力,促进了造血干祖细胞（Hematopoietic stem/progenitor cells,HSPCs）向髓系血细胞的分化;Tet2-/-BMSCs高表达BMP2,BMP4,IL-6,LP1,SOX12,低表达CXCL12,FOXG1,CXCL14等因子。第三部分:应用DNA测序方法检测骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative neoplasms,MPN）患者BMSCs中TET2基因突变情况,应用免疫荧光组织化学的方法检测MPN患者BMSCs中TET2的表达水平,流式细胞术检测健康志愿者和MPN患者BMSCs中5hmc表达水平。结果发现:MPN患者BMSCs中不存在TET2突变;同健康志愿者BMSCs相比,MPN患者BMSCs中TET2表达水平明显降低（细胞核及部分胞浆的红色荧光）;MPN患者BMSCs中5hmc表达水平较健康志愿者BMSCs明显下降,提示MPN患者BMSCs中存在TET2表达异常。

关键词： mi-RNA-1   肝癌血管内皮细胞  

摘要： 目的:血管内皮细胞给肿瘤细胞生长提供了一个良好的环境,微小RNA的研究也是近年来的重点,所以,我们利用下调微小RNA-1表达对人肝癌血管内皮细胞生物学的影响探讨.方法:为了探究mi-RNA-1在肝癌血管内皮细胞中的作用,我们利用RNA干扰技术在人肝癌内皮细胞(TEC)中干扰mi-RNA-1,然后通过Q-PCR进行验证,在检测细胞增殖的基础上再次检测单个细胞的增殖,最后我们通过划痕实验进行检测细胞运动.结果:经过Q-PCR验证干扰成功,干扰组与空白对照组和mock对照组相比,干扰组表达量下调明显(P<0.001),细胞增殖能力明显下降(P<0.001),细胞运动能力减弱.结论:mi-RNA-1的下调减弱了人肝癌血管内皮细胞的生物活性.

关键词： ROR1   靶向治疗   卵巢癌  

摘要： 受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）是一组属于受体酪氨酸激酶（RTK）家族的跨膜蛋白,其在胚胎时期的肌肉和骨骼发育中起关键作用,但在大多数正常成熟组织中极少表达。研究发现,ROR1在慢性淋巴细胞白血病、神经母细胞瘤、乳腺癌、肾癌及卵巢癌等多种肿瘤细胞中过表达,可促进肿瘤细胞生长,增强肿瘤细胞侵袭和转移能力。卵巢癌的发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中排第三位,仅次于子宫颈癌和子宫体癌,但其死亡率却高居妇科各恶性肿瘤之首。其以发病隐匿、侵袭转移性强、进展迅速、预后差为主要临床特征,临床治疗方案主要以肿瘤细胞减灭术辅以化疗,虽然一定程度上缓解了病情,但毒副作用明显,极易产生耐药且复发率极高。本课题利用基因工程技术,以制备、表达抗ROR1 Fab抗体,并对其生物特性进行探讨,应用体外实验进一步研究该抗体对卵巢癌生物学行为的影响。目的:1.应用基因工程技术制备、表达嵌合性抗ROR1 Fab抗体。2.体外实验探究嵌合性抗ROR1 Fab抗体对卵巢癌生物学行为的影响。方法:1.制备、表达嵌合性抗ROR1 Fab抗体利用单克隆抗体细胞融合技术筛选抗ROR1阳性单克隆细胞,用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,反转录获得单链cDNA。以此为模板,借助PCR技术,扩增抗ROR1 Fab抗体轻重链可变区序列（VL和VH）,后与数据库比对,依据正确的核酸序列重新设计引物,PCR抗体轻重链可变区和恒定区,并将抗体轻链可变区（VL）和轻链恒定区（CL）连接,将重链可变区（VH）和和重链恒定区（CH1）连接,获得轻链（L）和重组重链（Fd）。后利用酶切位点,分别对轻链（L）、重组重链（Fd）及表达载体pETDUET-1进行酶切,收集酶切纯化产物,将轻链（L）、重组重链（Fd）与表达载体pETDUET-1连接,构建重组质粒pETDUET-1-ROR1-cFab。将重组质粒pETDUET-1-ROR1-cFab转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,蛋白纯化系统纯化得到嵌合性抗ROR1 Fab抗体。2.嵌合性抗ROR1 Fab抗体的活性鉴定利用SDS-PAGE和Western blot检测抗ROR1抗体Fab的表达,ELISA和Biacore X100鉴定抗ROR1抗体Fab与ROR1的特异性结合能力及亲和力。3.嵌合性抗ROR1 Fab抗体的体外实验通过Western blot、流式细胞术和免疫荧光检测A2780和Iose386细胞上ROR1蛋白的表达水平。嵌合性抗ROR1Fab抗体作用于A2780和Iose386细胞,利用CCK-8、细胞划痕实验、Transwell迁移、细胞凋亡等实验方法检测、分析嵌合性抗ROR1 Fab抗体对卵巢癌细胞生物学行为的影响。结果:1.成功构建了原核表达质粒pETDUET-1-ROR1-cFab,经测序,未发生基因突变或产生无功能基因。将其转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,蛋白纯化系统纯化得到嵌合性抗ROR1 Fab抗体。***-PAGE和Western blot结果表明抗ROR1抗体Fab分子量约为27KD,主要在细胞上清中表达。ELISA结果显示抗ROR1抗体Fab与ROR1抗原能特异性结合。Biacore X100检测得抗ROR1抗体Fab与ROR1抗原的亲和常数为3.233×10-8。*** blot、流式细胞术和免疫荧光结果显示ROR1在A2780细胞中高表达,Iose386细胞中低表达。CCK-8、细胞划痕实验、Transwell迁移和细胞凋亡结果显示在较高浓度下抗ROR1抗体Fab可抑制A2780细胞的增殖和迁移,并促进其凋亡。结论:本实验成功制备抗ROR1抗体Fab,验证该抗体能特异性结合ROR1,且具有高亲和力。体外实验研究表明抗ROR1抗体Fab作用于高表达ROR1的A2780细胞时,可抑制该细胞的恶性生物学行为。本研究利用单克隆抗体细胞融合技术得到的单克隆抗体可能在卵巢癌的靶向治疗中有潜在价值。