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关键词： 纳米粒子   可控合成   晶态   形成机理   细胞活性  

摘要： 近几十年来,随着纳米科学技术的发展,纳米材料已经成为化学、材料、医学等多学科领域的研究前沿。例如,在医学领域,纳米材料已被用于药物输送、生物成像和光热治疗等领域。纳米金属硫化物或氧化合物作为纳米材料中的重要组成部分,因其具有优良的物理、化学性质,受到了研究者的关注。研究显示,由于纳米金属硫化物或氧化合物的结构多样,性能良好,且应用广泛等特征引起人们的极大研究兴趣。然而如何简单、可控的合成具有特殊形貌的纳米金属硫化物或氧化合物,研究其形成过程,以及研究其形貌与性质之间的关系,已成为当今化学研究的前沿。本论文中,我们采用气体扩散法和尿素均相沉淀法,通过简单调控反应物浓度、反应时间、搅拌速度或反应温度,可控合成了两种不同晶态的硫化银纳米粒子,以及三种不同形貌的氧化镧纳米分级结构;并对其形成过程和细胞生物学效应进行了探究;同时,对其细胞生物学效应的机理进行了初步研究。本论文主要内容如下:（1）简单阐述了纳米金属氧族化合物的相关知识,纳米金属硫（氧）化物研究成果以及最新进展,概述了当前纳米金属硫（氧）化物研究中的主要问题,解决途径以及本论文的选题背景、研究内容及创新之处。（2）采用气体扩散法,可控的合成了晶型Ag2S纳米粒子,并探究了其对癌细胞的光动力活性（PDT）,以及光动力抑制机理。采用XRD、EDS、HRTEM、Zeta potential、TG-DSC、FT-IR、UV-Vis和PL等测试对试验所得产物进行了表征,结果表明,成功合成了晶型Ag2S纳米粒子,平均粒径为8.97nm,分散于二次水测试得表面电势为-34.3mV,表明样品在二次水中的稳定性较好,并且具有良好的光学性能。进一步测试表明,晶型Ag2S纳米粒子具有良好的细胞相容性,在光照条件下,表现出良好的PDT活性。采用流式细胞术（FCM）和激光共聚焦（CLSM）对样品的PDT活性机理进行了探究,研究表明,晶型Ag2S纳米粒子对人淋巴瘤（Raji）细胞表现出的良好的PDT活性,不会造成癌细胞的坏死和凋亡,但会抑制癌细胞的生长繁殖,从而达到抑制癌细胞的作用;通过活性氧（ROS）、线粒体膜电位（JC-1）和能量代谢（OCR）等测试对其机理进行了进一步的研究,测试结果表明,Ag2S纳米粒子的PDT活性是由于使细胞产生了大量的活性氧（ROS）,从而导致了细胞的氧化损伤和线粒体功能障碍,影响了癌细胞的能量代谢（OCR）。（3）基于气体扩散合成方法,通过简单调控反应物浓度、反应时间、搅拌速度或反应温度,可控的合成了两种不同晶态的硫化银纳米粒子,即非晶态硫化银纳米粒子（A-Ag2SNPs）和晶态硫化银纳米粒子（C-Ag2SNPs）,并对其理化性质和细胞生物学效应进行了探究。XRD、EDS、HRTEM、Zeta potential、TG-DSC、FT-IR、UV-Vis和PL等测试结果表明,成功合成了非晶态Ag2S和晶态Ag2S纳米粒子,平均粒径分别为5.69nm和8.97nm;分散于二次水测试得表面电势分别为-28.7mV和-34.3mV,表明样品在二次水中的稳定性较好。通过细胞毒性（MTT）测试表明,硫化银纳米粒子表现出对癌细胞晶型依赖性的抗增殖作用,非晶态硫化银纳米粒子可以特异性地抑制癌细胞的增殖,而晶态硫化银纳米粒子不具备这种性质。通过流式细胞术（FCM）、激光共聚焦（CLSM）和电感耦合等离子体（ICP-MS）等测试,对其作用机理进行了探究,结果表明,与晶态Ag2S纳米粒子相比,非晶态Ag2S纳米粒子会引起细胞的坏死和晚期凋亡,对癌细胞有显著的细胞毒性,可以显著的抑制癌细胞的增殖,并且两种不同晶态Ag2S纳米粒子对细胞抑制作用的差异,与细胞对样品的内化效率无关,而是与样品本身性质有关;采用活性氧（ROS）和线粒体膜电位（JC-1）等测试,对其机理进行了进一步的研究,测试结果表明,硫化银纳米粒子以晶型依赖性方式表现出对癌细胞的抗增殖作用,是由于非晶态Ag2S纳米粒子诱导癌细胞内源性活性氧（ROS）明显升高,直接影响细胞线粒体,导致了细胞氧化损伤和线粒体功能障碍,从而导致细胞的凋亡和坏死。（4）采用简单的尿素均相沉淀法合成一系列不同形貌的氧化镧纳米分级结构,并对其形成过程和细胞生物学性能进行了探究。XRD、XPS、HRTEM、FESEM UV-Vis和PL等测试结果表明,成功合成了三种不同形貌La2O3纳米分级结构。在合成样品过程中,通过HRTEM和FESEM对不同时间样品的进行表征,对其形成过程进行了跟踪研究;最后通过细胞毒性（MTT）实验对三种不同形貌La2O3纳米分级结构的细胞生物学性能进行了表征。（5）对研究成果进行了分析、归纳和总结,采用气体扩散法和尿素均相沉淀法,通过简单调控反应条件,可控合成了两种不同晶型的硫化银纳米粒子,以及三种不同形貌La2O3纳米分级结构;并对其形

关键词： AIF-1   肝细胞癌   BCLC分期   门静脉癌栓   IL-1   IL-6   TNF-α  

摘要： HCC是原发性肝癌里最常见的类型,尽管HCC的治疗手段在不断完善,但目前这些治疗手段仍然存在缺陷,HCC的治疗效果仍不能让人满意,HCC的病死率仍然非常高。因此,继续寻找新的、可能有效的诊断和监测的标志物,继续探寻HCC发展的分子机制,从而为HCC病人找的新的治疗靶点显得十分重要。近年来,不断有学者发现炎症与癌症之间存在密切的分子联系,目前已经被发现的与肝脏恶性肿瘤的发展与发生的炎症细胞因子包括IL-1、IL-6、TNF-α 等。AIF-1是一个主要由外周血单核细胞和组织内的巨噬细胞产生,具有调节炎症反应的作用的炎症因子。有研究指明,AIF-1参与了类风湿性关节炎、炎症性皮肤紊乱、系统性硬化病的炎症反应调节。最近有学者发现,AIF-1体外实验中能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移,说明AIF-1可能参与到乳腺癌的发展中去。AIF-1还在肝血窦边界的活化Kupffer细胞中被检测出来,提示AIF-1在肝脏的淋巴细胞系统中也有表达。因而我们推测AIF-1也可能参与了肝癌发展中去。但目前AIF-1的表达与HCC的发生和进展之间的联系还不明确,AIF-1的表达对HCC病人是否存在检测和诊断意义还不清楚。本研究的主要目的是通过使用免疫组织化学技术、蛋白免疫印迹技术来评估配对的104例HCC标本与周围的正常肝组织标本中AIF-1的表达差异,并且研究AIF-1的表达是否与HCC病人的临床病理指标相关。我们进一步进行了体外细胞实验,通过使用细胞增殖试验、损伤修复试验、Transwell迁移试验来评估AIF-1对HCC细胞增殖、迁移能力的影响,以此来探讨AIF-1与HCC进展之间的关系。本研究的主要研究结果如下:***-1在人HCC组织中表达增多我们先后使用免疫组织化学技术、WB及qPCR技术,检测配对HCC组织和周围正常肝组织中检测AIF-1蛋白含量。与周围正常肝组织相比,HCC组织中AIF-1蛋白和mRNA的表达明显升高。这些结果提示AIF-1在HCC组织中的表达明显上调。***-1的表达与HCC病人临床病理学特征之间的联系为了评估AIF-1在HCC组织中表达的意义,我们进一步研究AIF-1的表达与HCC病人临床病理学特征之间的关系。根据数据处理结果,我们发现在肿瘤体积直径大于5cm、或存在多个(多于2个)结节样病灶的、BCLC分期B-C期、合并门静脉癌栓的原发性肝癌病人中,AIF-1的表达显著升高。这一结果提示AIF-1可能与肝细胞癌的进展相关。***-1对在HCC细胞系细胞增殖的影响我们使用si-RNA技术成功构建了 AIF-1表达沉默细胞。然后使用CCK-8试验检测AIF-1沉默细胞的增殖能力。数据分析显示,AIF-1沉默的肝癌细胞相对于对照组的细胞,其增殖能力显著抑制。这些研究结果提示,AIF-1可能在HCC细胞的增殖中起到一定的作用。***-1对在HCC细胞系细胞迁移的影响在体外细胞划痕实验试验中,我们发现被siRNA转染后AIF-1表达沉默的两种肝癌细胞相比于对照组的细胞,其细胞迁移能力显著降低。我们进一步做了transwell试验,在transwell试验中,AIF-1表达沉默的两种肝癌细胞相比于对照组的细胞,其细胞迁移进下层transwell室的能力明显减弱。结合上述的实验,我们有理由相信,AIF-1的高表达可能与人类HCC细胞的转移能力相关。

关键词： 环状RNA   hsa＿circ＿0008202   口腔鳞状细胞癌   增殖   凋亡   迁移   侵袭  

摘要： 【目的】明确环状RNA hsa＿circ＿0008202在口腔鳞状细胞癌及口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达水平,探究环状RNA hsa＿circ＿0008202对OSCC细胞系增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。【方法】采用RT-PCR验证环状RNA hsa＿circ＿0008202在口腔鳞状细胞癌及4株口腔鳞状细胞癌细胞系中的表达水平,以hsa＿circ＿0008202基础表达量较低的OSCC细胞作为后续研究对象;设计高表达质粒上调口腔鳞状细胞癌细胞中hsa＿circ＿0008202的基因水平,并用RT-PCR验证高表达效果;通过CCK-8和EDU增殖实验检测两组细胞的增殖能力;采用Hochest染色检测两组细胞的凋亡水平;用划痕实验和Transwell实验检测两组细胞的迁移和侵袭能力;通过Western实验检测与细胞增殖、凋亡、迁移侵袭相关蛋白的表达情况。【结果】RT-PCR验证结果显示环状RNA hsa＿circ＿0008202在口腔鳞状细胞癌中的表达水平明显低于正常组织;而在四株口腔癌细胞系中hsa＿circ＿0008202的基因表达水平也是明显低于正常口腔角质细胞（*P<0.05）。通过设计高表达质粒转染SCC15和CAL27细胞,结果提示与空白质粒组相比,pc DNA-8202组hsa＿circ＿0008202表达水平明显升高（*P<0.05）。CCK-8增殖实验和EDU增殖实验均显示高表达hsa＿circ＿0008202后,细胞的增殖能力和细胞活性降低,Western实验检测细胞周期蛋白Cyclin D1相对于对照组表达减少。Hochest染色实验结果显示:与对照组相比,高表达组的Hochest染色阳性率较高,即hsa＿circ＿0008202基因上调促进了OSCC细胞的凋亡,Western实验检测细胞凋亡相关蛋白在,高表达组中Bax表达升高而Bcl-2表达降低。划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验结果显示相比于对照组,高表达组的迁移和侵袭能力均减弱,Western实验检测基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达水平显著降低。【结论】体外实验成功上调hsa＿circ＿0008202后,口腔鳞状细胞癌细胞的增殖能力减弱,凋亡水平升高,迁移和侵袭能力均降低。hsa＿circ＿0008202可能通过某种途径调控Cyclin D1的表达水平来抑制其增殖能力,通过调控Bcl-2和Bax之间的比例来促进口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡水平,并通过调节MMP-9的表达来抑制其迁移侵袭能力。环状RNA hsa＿circ＿0008202可能在抑制口腔鳞状细胞癌的发展方面发挥一定作用。

关键词： 肝癌细胞   内含子miRNA   Pde4d   miR-1904  

摘要： Pde4d基因位于小鼠13号染色体上,其编码产物PDE4D(磷酸二酯酶4d)可以特异性降解c AMP,因而细胞的生命活动中发挥重要作用。miR-1904定位于小鼠Pde4d第8内含子内,是一种内含子micro RNA。鉴于目前对miR-1904靶基因及功能研究较少,本论文以miR-1904为研究对象,分析了其在小鼠肝癌细胞中的表达及与宿主基因Pde4d的靶向关系,并进一步研究了miR-1904对Hepa1-6细胞生物学行为的影响。首先本文鉴定了miR-1904与宿主基因Pde4d之间的靶向关系。首先在Hepa1-6细胞转染miR-1904 mimics,外源性上调miR-1904,定量PCR和western blot检测显示Pde4d的m RNA和蛋白质水平都出现了显著性下调;而转染miR-1904 inhibitor后Pde4d表达出现显著性上调。随后双荧光素酶报告实验和挽救实验进一步证明Pde4d是miR-1904的靶基因。其次本文研究了miR-1904对小鼠肝癌细胞生物学表型的影响。在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中上调和抑制miR-1904的表达,检测到miR-1904抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。细胞周期和细胞凋亡实验结果进一步证实了miR-1904是通过促进细胞凋亡而并非改变细胞周期来影响细胞增殖的。体内成瘤实验表明过表达miR-1904的肿瘤无论是生长速率还是肿瘤质量都出现显著性下降,说明miR-1904具有肿瘤抑制子的功能。综上所述,本研究验证了Pde4d是miR-1904的靶基因之一,miR-1904表达上调对小鼠肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成和体内成瘤能力具有抑制作用,并促进细胞凋亡。说明miR-1904可能作为抑癌miRNA在肿瘤发生和发展中起到作用,为进一步阐明miR-1904的生物学功能奠定了基础。

关键词： 结直肠癌   异常隐窝灶   肠道菌群   肠道菌群代谢产物  

摘要： 目的:作为全球第三大常见的癌症,结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)的发病率依然呈逐年增高的趋势,其发病的具体机制尚未探明,相关研究认为CRC的发生由多种因素造成,是基因与环境因素共同作用的结果,其中肠道菌群与CRC的发生密切相关。异常隐窝灶(Aberrant Crypt Foci,ACF)已被确定为CRC的一种癌前病变,先于腺瘤的发生,并且目前认为遵循ACF→腺瘤→结直肠癌途径。前期实验已经证实ACF时期肠道菌群及菌群代谢能力发生了改变。因此本实验利用ACF时期中收集的粪便样本,扩增厌氧菌(厌氧菌约占肠道菌群的99%以上),给予一定的底物并提取菌群的发酵液,通过观察肠道菌群发酵液对结直肠肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响以及发酵液对结直肠肿瘤细胞白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、诱导信号传导子及转录激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcrip-tion3,STAT3)及磷脂酰肌醇-3-激酶α亚单位(Phosphatidyl Inositol 3-kinase Catalytic Subunit Alpha Isoform,PI3KCA)基因mRNA的表达的影响,探讨菌群的代谢产物对于结直肠肿瘤细胞的影响及其可能的作用机制。方法:样本收集:前期实验造模随机分为两组(实验组SD大鼠30只连续2W每W颈背部注射一次致癌剂1,2-二甲基肼(DMH),对照组SD大鼠12只注射相应体积的空白缓冲液),于造模后开始每隔1W收集一次所有大鼠的粪便样本(3-4粒,约1g),同时随机处死实验组3只,对照组1只大鼠,取全段结肠,行ACF计数。根据前期实验所观察到造模后不同时间点两组大鼠全段结肠肠管的ACF数目及ACF计数方差分析所得的同类子集表结果,选取第2次(第3W)、第4次(第7W)、第8次(第15W)三个时间点收集的两组的粪便进行后续研究。扩增细菌,给予细胞培养基DMEM/F12作为底物进行厌氧发酵,提取菌群的发酵液,根据发酵液的粪便样本来源和收集粪便样本的时间点,分组如下:第2次收集的实验组和对照组的粪便分为S2和D2组,第4次收集的两组粪便分为S4和D4组,第8次收集的两组粪便分为S8和D8组。用各组菌群发酵液干预结直肠肿瘤Lo Vo细胞株后(设置一个NC组,其他组用一定的浓度梯度发酵液干预时,NC组用DMEM/F12完全培养基作为空白对照组),采用Counting Kit-8(简称CCK-8)法检测各组细胞的增殖抑制状态,采用流式细胞术(Flow Cytometry)、划痕实验(Scratch Test)和Transwell侵袭迁移实验,检测各组细胞凋亡率、迁移和侵袭能力,运用Real-time PCR技术检测各组细胞中IL-6、STAT3及PI3KCA基因mRNA的表达情况。结果:1、同种浓度梯度(20%/10%/5%)干预相同时间(24h/48h/72h)。当发酵液浓度为20%,干预细胞24h后,各组的增殖抑制率对比结果如下:S2 V.S.D2,S4 V.S.D4,S8 V.S.D8,S2 V.S.S4,S2 V.S.S8差异均有统计学意义(P<0.01),实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组,而S4 V.S.S8和D2 V.S.D4 V.S.D8差异无统计学意义(P>0.05);当各组发酵液浓度均为10%或5%,干预细胞24h后:统计结果同上。当发酵液浓度为20%,干预细胞48h后,各组的增殖抑制率对比结果如下:S2 V.S.D2,S4 V.S.D4,S8 V.S.D8,S2 V.S.S4,S2 V.S.S8,S4 V.S.S8差异均有统计学意义(P<0.05),实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组,且三个实验组S2、S4、S8的抑制率逐渐增高,而D2 V.S.D4 V.S.D8差异无统计学意义(P>0.05);当各组发酵液浓度均为10%或5%,干预细胞48h后:统计结果与浓度为20%,干预48h时相同。当发酵液浓度为20%,干预细胞72h后,各组的增殖抑制率对比结果如下:S2 V.S.D2,S4V.S.D4,S8 V.S.D8,S2 V.S.S4,S2 V.S.S8,S4 V.S.S8差异均有统计学意义(P<0.01),实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组,且三个实验组S2、S4、S8的抑制率逐渐增高,而D2 V.S.D4 V.S.D8差异无统计学意义(P>0.05);当发酵液浓度为10%,干预细胞72h后,各组的增殖抑制率对比结果如下:S2 V.S.D2,S4 V.S.D4,S8 V.S.D8,S2 V.S.S4,S2 V.S.S8差异均有统计学意义(P<0.01),实验组的增殖抑制率均高于相对应的对照组,而S4 V.S.S

关键词： 三阴性乳腺癌   肿瘤相关巨噬细胞   MicroRNA-382   生物学特性  

摘要： 目的:探讨MicroRNA-382(miR-382)在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中的表达对三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞(4T1)生物学特性的影响。方法:慢病毒介导巨噬细胞(PMs)中miR-382的过表达,采用细胞免疫荧光和Real-time PCR(q RT-PCR)检测慢病毒转染率;三阴性乳腺癌条件培养基(triple negative breast cancer conditioned medium,TCM)刺激各组PMs后,Western blotting检测TAMs的极化指标(IL-10,TNF-α)、PGC-1α和NF-κB的蛋白表达变化;qRT-PCR检测miR-382和TAMs的极化指标(IL-10,TNF-α)与PGC-1α的核酸表达变化;流式细胞术检测TAMs的极化变化(CD86,CD206)和4T1细胞的凋亡率与细胞周期;Transwell侵袭实验检测4T1细胞的侵袭能力;激光共聚焦显微镜成像检测PGC-1α和NF-κB的表达变化;结果:TCM刺激PMs后,TAMs呈M2型极化,TAMs中miR-382表达水平降低,PGC-1α表达水平增高以及NF-κB转录活性降低,4T1细胞侵袭能力增强、凋亡率下降;运用慢病毒使PMs过表达miR-382,在TCM的刺激下,TAMs呈M1型极化,TAMs中miR-382表达水平增高,PGC-1α表达水平降低以及NF-κB转录活性增强,4T1细胞的侵袭能力下降、凋亡率增高。结论TAMs可以通过调节miR-382的表达可抑制三阴性乳腺癌的侵袭和增殖,其机制可能与TAMs中miR-382抑制PGC-1α的表达、增强NF-κB的转录活性,进而抑制了TAMs的M2分化有关。结论:TAMs可以通过调节miR-382的表达可抑制三阴性乳腺癌的侵袭和增殖,其机制可能与TAMs中miR-382抑制PGC-1α的表达、增强NF-κB的转录活性,进而抑制了TAMs的M2分化有关。

关键词： 人畸胎瘤细胞株PA-1   胚胎干细胞生物学特性   体内/外分化  

摘要： 目的鉴定人畸胎瘤细胞株PA-1的胚胎干细胞生物学特性。方法用碱性磷酸酶染色法鉴定体外培养PA-1细胞的分化水平,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测PA-1细胞多能性基因Nanog、Oct4和Sox2的表达情况。通过悬滴培养法使PA-1细胞形成拟胚体,用RT-PCR法检测拟胚体分化的三胚层特异性基因的表达。通过SCID小鼠体内成瘤实验,用HE染色和免疫组化鉴定PA-1细胞体内接种后三胚层组织的分化。结果体外贴壁培养PA-1细胞碱性磷酸酶染色呈深紫色,PA-1细胞能表达多能性基因Nanog,Oct4和Sox2。悬滴培养PA-1细胞可形成拟胚体(EB),且能够表达三胚层特异性基因(内胚层:Sox17,AFP;中胚层:C-actin,Brachyury;外胚层:Sox1,Pax6)。PA-1细胞接种至SCID小鼠皮下可以形成畸胎瘤,HE染色可见神经外胚层组织,免疫组化可见三胚层细胞表面标志抗原:GFAP(外胚层)、Vimentin(中胚层)及Desmin(内胚层)均呈阳性表达。结论 PA-1细胞在贴壁培养过程中能够保持未分化/低分化状态,并表达多能性基因; PA-1细胞在体内及体外分化实验中均能分化出三胚层的细胞或组织;证明PA-1细胞具有一定的胚胎干细胞生物学特性。

关键词： 食管癌   SRPX2   CRISPR/Cas9   耐药   免疫组织化学  

摘要： 背景:食管癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高、侵袭能力强、预后差的特征。食管癌主要分为腺癌(adenocarcinoma,AC)和鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)两种亚型,虽然在发达地区食管腺癌的发病率逐渐上升,但食管鳞状细胞癌仍是全球较常见的食管癌组织学亚型。在我国,食管癌发病率在所有恶性肿瘤中排名第六,死亡率排名第四,且有逐年上升的趋势。早期食管癌一般不会引起明显症状,容易导致患者延误诊断,最终使患者失去手术治疗的机会,且半数以上的患者会出现远处转移。虽然现在食管癌的早期筛查、早期诊断以及综合治疗等方面都有了很大进展,但晚期食管癌患者的预后仍然很差。另外,化疗是食管癌一种重要的治疗方式,但目前治疗过程中出现的多药耐药情况严重影响患者的治疗效果。因此,寻找更有效的食管癌生物标志物和治疗靶点对于食管癌的早期诊断和更有效的治疗势在必行。SRPX2(sushi repeat-containing protein,X-linked 2)是一种新型的硫酸软骨素蛋白聚糖,它最早是在白血病细胞中发现的,包含三个sushi重复结构域(CCP结构域)和一个HYR结构域。目前许多研究已经发现SRPX2在多种不同的恶性肿瘤组织中高表达,且与患者不良预后密切相关。SRPX2参与肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭等生物学过程,并对血管生成具有积极的促进作用,这些都表明SRPX2在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。但是SRPX2在食管癌中的表达及其在食管癌细胞中的作用仍然缺少文献支持。此外,虽然有文献报道SRPX2可能与肿瘤细胞的化疗耐药性有关,但是这方面的研究仍然非常有限,SRPX2在肿瘤耐药方面的作用有待于更进一步的探索。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术沉默食管癌KYSE450细胞系的SRPX2基因,构建稳定的SRPX2基因敲除的食管癌细胞系,探究SRPX2对于食管癌KYSE450细胞生物学特性和生物学功能的影响。应用免疫组织化学染色技术验证SRPX2在食管癌中的表达情况,并分析其表达水平与食管癌临床病理特征和食管癌患者的临床预后之间的关系。目的:探索SRPX2基因敲除对食管癌KYSE450细胞生物学特性和功能的影响,研究SRPX2蛋白在食管癌中的表达情况及其与患者临床预后之间的关系。材料和方法:1通过Western blot技术检验SRPX2在四种不同食管鳞癌细胞系中的表达情况,运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建SRPX2基因敲除食管癌细胞系,并通过DNA测序、RT-PCR和Western blot方法进行敲除结果验证。2对构建成功的SRPX2基因敲除的食管癌细胞,利用流式仪分析细胞的周期和凋亡变化,海马XFe96细胞能量代谢分析仪检测细胞的线粒体功能,并进行细胞增殖实验、Transwell细胞迁移实验、细胞划痕实验以及细胞成球实验等细胞功能实验。3通过IncuCyte ZOOM仪器和平板克隆形成实验分析细胞对化疗药物顺铂、紫杉醇和多西他赛的敏感性,利用辐照仪照射细胞后观察细胞对放疗的敏感性。4通过高通量测序技术检测并分析SRPX2基因敲除后食管癌细胞内的差异基因、差异蛋白以及相关信号通路等的变化。5对来自安阳肿瘤医院的138例食管癌石蜡样本通过免疫组织化学染色技术检测SRPX2蛋白在食管癌组织中的表达情况,并分析SRPX2的表达与食管癌患者的临床病理特点和预后之间的关系。结果:1 SRPX2基因敲除后,食管癌KYSE450细胞周期发生S期阻滞,细胞凋亡比例增加,细胞体外增殖能力受到抑制,并出现最大呼吸功能和储备呼吸功能降低等线粒体功能损伤现象。2 SRPX2基因敲除导致KYSE450细胞的成球能力和体外迁移能力均明显降低,而化疗敏感性和放疗敏感性增加,经过化疗药物和放射处理的细胞其增殖速率和克隆形成率均受到明显抑制。3转录组测序结果显示SRPX2基因敲除后,KYSE450细胞共有2562个基因上调和2640个基因下调,这些差异表达基因涉及细胞的多种生物学过程和信号通路。4免疫组化结果表明SRPX2蛋白在食管癌组织中高表达,SRPX2表达与食管癌患者的肿瘤组织分化程度、临床分期、淋巴结转移以及远处转移密切相关。与SRPX2表达弱阳性和阴性的患者相比,SRPX2强阳性患者的总生存期较短,且SRPX2高表达是食管癌患者生存预后的独立危险因素。结论:1 SRPX2基因参与KYSE450细胞的周期、凋亡、增殖和迁移等生物学过程,且在肿瘤细胞的化疗耐药性和放疗抗性过程中发挥重要作用。2 SRPX2在食管癌组织中高表达,SRPX2强阳性提示食管癌患者预后较差,SRPX2在食管癌中可作为患者的独立预后指标。

关键词： 禽白血病病毒   病毒分离鉴定   基因组特征   髓细胞瘤   转录组分析  

摘要： 禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）是一种重要的致瘤性反转录病毒,可以引起鸡的多种肿瘤,严重威胁养殖业健康发展。鸡源禽白血病病毒包括AE,J和K 7个亚群。不同亚群的禽白血病病毒常常具有不同的致病性和致瘤谱,A、B亚群病毒主要诱发经典的鸡淋巴细胞瘤,J亚群病毒主要诱发鸡髓细胞瘤,尽管有时它们也诱发其他类型的肿瘤。近20年来,我国报道和研究了大量的ALV-J引起的髓细胞瘤和血管瘤型禽白血病。然而,对其他亚群的禽白血病的相关报道则相对较少,目前尚未见关于ALV-K诱发的肿瘤病变报道和ALV-A诱发髓细胞瘤的自然病例报道。本研究对湖北某蛋鸡群和某地方品种鸡群的肿瘤病鸡进行了病理学观察、病原分离鉴定和病毒全基因特征分析。在此基础上,通过反向遗传操作技术,拯救出基因背景清楚的病毒并研究病毒的致病性和致瘤特征,通过转录组测序分析,了解ALV-A诱发鸡髓细胞瘤的机制,结果如下:1.自然病例病理学观察及病原检测对病鸡进行了组织学观察和病原学检测。ELISA结果显示,商品蛋鸡场和地方品种鸡自然病例的泄殖腔拭子均呈ALV P27阳性;病理组织学观察显示,来自商品蛋鸡场和来自地方品种鸡养殖场的病鸡均为髓细胞瘤混发淋巴细胞瘤。用ALV-A/B/J的特异性引物进行Multi-PCR检测,蛋鸡病料中扩增出与ALV-A对应的核酸片段,但地方品种鸡病料未扩增出片段。以ALV-env的通用引物进行PCR,从地方品种鸡病料扩增出了相应的片段,测序显示扩增出的env与ALV-K原型株JS11C1高度同源。2.病毒分离鉴定与分离株培养特性取两个鸡群中病变典型的病鸡肝脏组织,制备组织悬液接种DF-1细胞进行病毒分离培养,分别以抗ALV-A的单抗AF3、抗ALV-J的单抗JE9和抗ALV-K SU的单因子血清为一抗进行间接免疫荧光试验。结果,以AF3为一抗,用蛋鸡肝脏组织悬液处理的DF-1细胞和以抗ALV-K SU单因子血清为一抗,用地方品种鸡肝组织悬液处理的DF-1细胞呈亮绿荧光,表明从蛋鸡中分离的病毒为ALV-A,命名为HB2015012;从地方品种鸡中分离的病毒为ALV-K,命名为HB2015032。体外培养试验表明,HB2015012和HB2015032与ALV-J参考毒株HB2010001和HB2015029复制特性相似,且HB2015032可以感染荆江麻鸭鸭胚原代成纤维细胞（DEF）。3.病毒分离株基因组特征测序结果显示,HB2015012和HB2015032的前病毒基因组全长分别为7735bp和7703bp,二者均具有典型的C型反转录病毒结构。序列分析显示,HB2015012和HB2015032的gag和pol基因核苷酸序列均相对保守,但HB2015032的pol基因区域（前病毒基因组第5345位碱基）发生了一个C-T突变,提前形成了一个TAA终止密码子,使得其pol基因编码的蛋白与J亚群禽白血病病毒一样,相对于其他亚群的毒株短22aa;HB2015012和HB2015032的UTR+LTR区核苷酸序列与ALV-J相应区域高度相似,二者的3’UTR+LTR区均包含有完整的DR1,E原件,U3,R和U5区,且U3区均具有2个CAAT boxes、2个Y boxes、2个CArG boxes和2个PRE boxes及1个NFAP-1和TATA box,几乎含有ALV-J原型株HPRS-103 U3区所有的调控序列,另外HB2015032的E原件中（前病毒基因组7250位与7251位碱基间）相对与HPRS-103基因组的7388位碱基处具有1个碱基缺失,形成了一个仅在蛋鸡血管瘤型ALV-J毒株中存在的与血管内皮细胞分化相关的c-Ets-1位点。这些结果表明,HB2015012是由ALV-A与ALV-J重组产生的具有ALV-J3’UTR+LTR的自然重组病毒;HB2015032是ALV-K与ALV-J重组产生的以ALV-J为骨架的K亚群禽白血病病毒,且其E原件可能源自致血管瘤型ALV-J。4.病毒反向遗传体系的建立及病毒拯救将HB2015012和HB2015032前病毒基因全长DNA插入pTopo-Blunt simple载体,构建感染性克隆,转化DF-1细胞,进行病毒拯救。结果成功拯救出了具有感染性的病毒rHB2015012和rHB2015032。体外培养试验显示rHB2015012和rHB2015032均与母本病毒具有相似的体外复制能力。***2015012和rHB2015032的致病性将rHB2015012和rHB2015032以2×10～3TCID50接种SPF鸡进行病毒致病性试验。rHB2015012接种的试验鸡,肿瘤发生率为65%,其中髓细胞瘤发生率为40%;rHB2015032接种的试验鸡,肿瘤发生率为75%,其中髓细