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关键词： 细胞生物学   教学研究   高等学校  

ISBN: (纸本)9787564360320

摘要： 细胞生物学是生命科学中很重要的基础学科之一，是生命科学的生长点和各大分支学科的交汇点，其反映了生命科学发展的近期新成就。应用型高等学校细胞生物学的课程教学改革势在必行。本书系统介绍了应用型高等学校课程教学的现状及理论基础，阐述了细胞生物学的教学内容以及现状，探讨了应用型高等学校细胞生物学课程教学改革的方向。对细胞生物学理论教学和实验教学改革提出了建议，并提出了双语教学在应用型高等学校细胞生物学课程教学中的重要性。很后对细胞生物学与专业内其他学科的衔接教学和细胞生物学的发展前景进行了介绍。

关键词： MiR-195   细胞周期   CHEK1   非小细胞肺癌  

摘要： 目的 研究MiR-195对肺癌A549细胞分裂增殖、侵袭力的影响以及调控的机制.方法 选择人非小细胞肺癌A549细胞株为实验研究对象,分别转染MiR-195拟似物及RNA阴性对照序列.使用实时荧光定量PCR法来检测细胞中miR-195表达水平;通过CCK8检测转染MiR-195对肿瘤细胞分裂增殖能力的干预情况;借助Tran-swel侵袭实验分析和评价对细胞侵袭力的作用;通过采取流式细胞仪检测的方法,评价转染MiR-195对肿瘤细胞分裂周期的影响.结果 转染miR-195导致人非小细胞肺癌侵袭能力明显降低.上调miR-195表达可以使肺癌A549细胞阻滞于G0/G1期.下调CHEK1蛋白表达可能是MiR-195调控肺癌A549细胞生物学行为的途径之一.结论 MiR-195在肺癌A549细胞生物学行为的调控中发挥重要作用,MiR-195可能是潜在的治疗非小细胞肺癌的靶基因.

关键词： 医学细胞生物学   实验教学   数字化   显微网络互动系统   应用  

摘要： 数字化显微网络互动系统的应用,就是将相关的信息技术结合起来用于教学课堂中,实现资源共享。本论文针对医学细胞生物学实验教学中数字化显微网络互动系统的应用进行探究。

关键词： IRGC   脂滴   精子发生  

摘要： IRGs 蛋白(Immunity-related GTPases)是 IFN-γ诱导的免疫相关 GTPase 蛋白,在胞内病原体抵抗上发挥着重要作用。小鼠中有23种IRG基因,进化到人类就只有IRGC和IRGM,而IRGC是人类IRG基因中唯一一个编码全长序列的IRG蛋白。目前,关于IRGC的性质和功能还没有详细的报道和研究,因此从细胞分子层面上研究IRGC可以更好地探索IRG基因在人类中发挥的作用。本研究发现在过表达的情况下IRGC定位在脂滴上,且有聚集脂滴的作用。通过构建定点突变体,发现影响IRGC定位的关键位点在S454,且IRGC定位不依赖于其GTPase活性。过表达情况下IRGC与同样定位于脂滴的Rab40c相互作用,显示IRGC可能通过与Rab40c相互作用定位在脂滴。通过内源检测,发现IRGC特异性表达在睾丸组织中,进一步研究发现IRGC主要表达在精子中,包括附睾中成熟的精子。免疫荧光显微实验显示IRGC定位在精子中段线粒体鞘的位置,结果暗示IRGC可能和精子活力有关。我们进一步通过免疫印迹和免疫荧光技术对临床精液样本进行检测,发现IRGC在弱精症患者中低表达,说明IRGC可能与弱精症的发病机制相关。我们还发现IRGC在特定条件下可介导脂滴与线粒体互作,这可能是IRGC参与调控精子形成与精子活力的机制。我们的工作为更深入研究IRGC的生物学功能和分子机制奠定了基础,为弱精症的发生机制提供了新的理论依据,也为IRG家族中的其它蛋白的研究打开新的视角。

关键词： 伯基特淋巴瘤   组蛋白去乙酰化酶抑制剂   曲古抑菌素   表皮生长因子受体通路底物8   Phospho-Erk1/2通路  

摘要： 伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma,BL)是一种高度侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤,目前治疗方法主要是化疗、放疗、单克隆抗体等,但复发和耐药未有效改善,对具预后不良特征或复发的患者仍需生物学靶向治疗。表皮生长因子受体通路底物8(EPS8),是多种酪氨酸激酶的磷酸化底物[1],参与多种信号转导,促进肿瘤发生、发展和转移[2-4],被认为是预后不良的标志物[5-7],但EPS8在淋巴瘤中的研究尚无报道。组蛋白乙酰化和去乙酰化保持平衡,以维持细胞正常功能[8],乙酰化功能失调可致调节细胞周期、分化、凋亡相关基因转录失调。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)可影响基因转录、增加肿瘤抑制基因表达,导致细胞周期停滞、分化和凋亡[9-11]。曲古抑菌素A(TSA)是最有效的HDACi之一,但在淋巴瘤中研究尚少,且与EPS8在伯基特淋巴瘤的作用之间是否存在关联,均无文献报道。本研究拟从体内和体外实验探索TSA对伯基特淋巴瘤细胞生物学活性的作用,EPS8对TSA发挥抗肿瘤作用的影响及TSA联合化疗药物的效果,并探索TSA的作用机制,为伯基特淋巴瘤的治疗提供新方向。目的:1.探讨TSA对细胞生物学功能的影响及作用机制。2.构建稳定过表达和低表达EPS8的Ramos和Namalwa细胞株。3.探讨TSA与表阿霉素联合作用对细胞的影响。4.探讨TSA和EPS8对裸鼠伯基特淋巴瘤移植瘤的作用。方法:***检测细胞对TSA的敏感性,流式细胞术检测TSA对细胞周期和凋亡的影响,Western blot检测目的蛋白的表达。2.构建稳定过表达和沉默EPS8及对照细胞系,台盼蓝拒染法检测细胞增殖水平,MTT检测EPS8的表达对细胞药物敏感性的影响,Western Blot检测EPS8及下游蛋白表达。***检测TSA和表阿霉素单独及联合后细胞活性,Western blot检测EPS8及下游通路活性。4.采用Namalwa-scramble和Namalwa-shRNA-EPS8细胞建立伯基特淋巴瘤动物模型。结果:***对细胞的作用呈时间浓度依赖性。与对照组比,不同浓度TSA对细胞G0/G1、S及G2/M期的影响有显著性差异。随TSA浓度增加,两种细胞的凋亡率增高。*** Blot 示 TSA 作用后,EPS8、Phospho-Erk1/2 通路相关蛋白、Bc12 和cyclinD1表达下降。3.沉默EPS8抑制细胞增殖,降低Phospho-Erk1/2通路活性,过表达EPS8则相反。沉默EPS8与TSA具协同效应,过表达EPS8则减弱TSA的作用。***与表阿霉素联合对细胞活性、EPS8及Phospho-Erk1/2通路的抑制更明显。5.在体内实验,Namalwa-shRNA-EPS8+TSA组的瘤体最小,各组小鼠体重无统计学差异。结论:***抑制细胞增殖,促进周期停滞及凋亡,可通过EPS8及下游Phospho-Erk1/2通路发挥作用。2.沉默EPS8抑制细胞增殖,降低Phospho-Erk1/2通路活性,与TSA具有协同效应。过表达EPS8则相反,且可减弱TSA的抑制作用。***可增强伯基特淋巴瘤对化疗药物的敏感性。4.在动物水平,沉默EPS8联合TSA可明显抑制瘤体生长。

关键词： ZFX基因   肝内胆管细胞癌   细胞生物学  

摘要： 目的构建ZFX基因的siRNA片段,并转染肝内胆管细胞癌细胞系HCCC-9810,观察转染后肝内胆管细胞癌细胞的ZFX的表达水平的变化。通过下调HCCC-9810细胞的ZFX的表达水平,观察对肝内胆管细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆等相关能力的影响,初步阐明ZFX基因在肝内胆管细胞癌的发生、发展中的作用。方法根据文献报道的ZFX基因siRNA序列进行合成,通过脂质体lipofectamine2000介导转染肝内胆管癌细胞株HCCC-9810,根据转染siRNA的片段不同将实验分为空白对照(Cell)、转染含无义序列的siRNA片段(NC-siRNA)、转染含ZFX目的基因的siRNA片段(ZFX-siRNA)三组,RT-PCR检测ZFX基因的m RNA表达水平的变化,Western blot检测ZFX基因蛋白水平的变化。最后分别用软脂琼克隆形成实验、CCK-8增殖实验、Transwell实验检测转染后HCCC-9810各组细胞的克隆形成能力、细胞增殖能力,细胞的迁移、转移能力的变化。结果将siRNA转染HCCC-98110细胞株72h后,RT-PCR、Western blot检测结果表明与Cell、NC-siRNA组相比,ZFX-siRNA有效降低了HCCC-9810细胞系的ZFX的m RNA水平及蛋白水平的表达(P<0.05),而Cell、siRNA-NC两组间差异无明显统计学意义(P>0.05),证明了ZFX-siRNA对HCCC-9810细胞的ZFX基因有明显沉默效率(65.9%)。克隆形成实验显示:ZFX沉默后,该细胞系克隆形成能力明显减弱(P=0.019)。CCK-8增殖实验证明第二天开始实验组细胞增殖能力明显降低(t=5.366 P=0.0058)。Transwell实验显示,Cell、siRNA-NC组细胞迁移、转移能力均明显高于siRNA-ZFX组细胞(P=0.001,P=0.002)。各组实验中Cell、siRNA-NC组之间均未见明显差异(P=0.1569,P=0.0649)。结论本实验ZFX-siRNA成功降低肝内胆管癌细胞系HCCC-9810中ZFX基因的表达,证明ZFX基因的表达降低后可抑制肝内胆管细胞癌细胞的增殖、克隆、迁移及转移能力,初步阐明ZFX在肝内胆管细胞癌HCCC-9810的发生发展中起到重要的作用。

关键词： 急性T淋巴细胞性白血病   细胞分化抗原59   T-ALL细胞   异常表达   生物学行为  

摘要： 急性T淋巴细胞性白血病(T-ALL)是未成熟T细胞前体细胞的恶性转化造成的恶性血液肿瘤，常发生于骨髓、胸腺、外周血及淋巴结等部位。根据白血病细胞停滞分化在不同的阶段及其所表达的免疫表型，可将患者分为4类，分别为早期前体型T-ALL，前体型T-ALL，皮质型T-ALL和髓质型T-ALL。与其他类型的白血病相比，T-ALL患者的预后较差。随着细胞遗传学和生物技术的发展，T-ALL又有不同等级危险分层的划分，以便调整治疗方案来提高患者的生存率和缓解率。T—ALL的病理发展过程中涉及了不同基因水平的改变，遗传的多变性引起特定生物学行为的改变，如T细胞的异常增殖、T细胞分化及自我更新等。　　细胞分化抗原59(CD59)是一种细胞膜表面补体调节蛋白( Membranecomplement regulatory protein，mCRP)，以糖基磷脂酰肌醇( Glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚固与细胞膜的表面，无跨膜区和胞内区。CD59可以调控机体的补体系统，防止机体对同种或是自体细胞进行攻击。CD59也作为配体与CD2结合参与T细胞的黏附及活化，同时CD59与细胞凋亡也密切相关。CD59的低表达或缺失，使靶细胞易受补体的攻击而发生疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH);CD59的高表达往往出现在肿瘤细胞上，它能帮助肿瘤细胞逃避补体的攻击和促进肿瘤细胞的增殖。本课题旨在研究CD59与急性T系白血病之间的关系，探讨CD59在Jurkat细胞增殖、凋亡、抗补体中的作用，揭示CD59在T-ALL中的发病机制，为临床诊断和治疗提供新的方向，具有重要的理论意义和临床价值。　　目的：　　构建CD59基因过表达和CD59基因敲除的慢病毒载体，研究病毒转染技术和CRISPR/Cas9技术对悬浮细胞的作用，分析CD59差异表达在Jurkat细胞增殖、凋亡的作用，探讨动物模型中上下调CD59对Jurkat细胞异体移植的影响，进一步分析CD59在急性T系淋巴细胞白血病发生发展和发病机制中的作用价值。　　方法：　　1、选取慢病毒载体作为工具载体，扩增人CD59基因，构建3组sgRNA序列，包装形成CD59过表达慢病毒颗粒和CD59敲除慢病毒颗粒，以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为示踪蛋白。通过比对和测序检测构建质粒是否合格，转染293T细胞收集病毒颗粒，检测合成病毒的质量，并通过荧光滴度法检测病毒的滴度。　　2、利用病毒转染技术和CRISPR/Cas9技术转染Jurkat细胞，建立目的基因稳定表达的细胞株，设定Jurkat细胞株为空白对照组、转染空载体病毒颗粒的细胞株为negative control组、转染CD59基因慢病毒颗粒的细胞株为CD59组、转染CD59敲除慢病毒颗粒的细胞株为Cas9-CD59-1/2/3组。各组细胞绿色荧光的表达检测采用荧光显微镜和流式细胞仪;用激光共聚焦显微镜、Western blot和实时定量PCR检测CD59分子的表达水平及定位;用凋亡试剂盒及CCK8试剂盒检测各组细胞增殖凋亡的情况;Western blot和实时定量PCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3的表达水平;ELISA试剂盒检测细胞培养上清中细胞因子IL-2、IL-3的表达。　　3、30只非肥胖型糖尿病/SCID小鼠(non-obese diabetic/SCID，NOD/SCID)裸鼠随机分成5组，即PBS组、Jurkat组、negative control组、CD59组、Cas9-CD59组。尾静脉注射筛选的各种Jurkat构建裸鼠白血病血液模型。检测小鼠一般情况变化（如生长状态、精神情况、体质量）;检测小鼠外周血白细胞变化;用人CD3+单克隆抗体检测Jurkat细胞在小鼠体内增殖情况;用流式细胞仪检测小鼠外周血及骨髓的细胞凋亡;用HE染色和免疫组化检测肝脏和脾脏的病理变化。　　4、选取青岛大学附属医院血液科急性T系淋巴细胞白血病( T-ALL)初治患者20例，健康查体者30例。所有白血病患者通过骨髓涂片和细胞免疫分型确诊，部分骨髓标本进行染色体核型检测;检测外周血白细胞CD59的表达;检测外周血白细胞的凋亡情况;ELISA检测血清IL-2、IL-3、IL-7的表达。　　结果：　　1、成功构建CD59过表达载体和CD59敲除载体，通过基因测序检测构建质粒成功，利用病毒包装细胞293T细胞包装和扩增CD59过表达慢病毒颗粒和CD59敲除慢病毒颗粒，纯化后检测其物理性质及滴度均符合要求。　　2、荧光显微镜观察到绿色荧光的表达，流式细胞仪检测各组细胞转染效率在90%，说明慢病毒的转染效率达到实验的要求;激光共聚焦显微镜观察罗丹明标记的CD59，发现定位于细胞膜上，敲除CD59基因后细胞膜上几乎看不

关键词： 膀胱癌   细胞生物学   PIK3CA基因   基因表达  

摘要： 目的：探索PIK3CA分子对膀胱癌的生长、侵袭和转移过程的具体机制　　方法：通过综合分析PIK3CA在基因可视化芯片数据库中的多个大样本芯片数据，观测PIK3CA的表达含量;利用组织芯片检测PIK3CA分子在不同膀胱癌组织标本中的蛋白水平;结合文献发现PIK3CA参与经典的EMT途径，通过实时定量PCR和Western blot等实验手段验证其相关性;最后，分别在体内外检测PIK3CA对膀胱癌细胞的增殖、侵袭和转移的影响，为研究PIK3CA的生物学功能奠定实验基础。　　结果：数据库分析发现较对照组，PIK3CA在膀胱癌中高表达;组织芯片也显示PIK3CA在肿瘤组织中表达水平明显高于对照组;PIK3CA可以通过促进EMT过程，从而发挥其促癌作用;克隆形成、transwell侵袭，划痕实验均显示PIK3CA可以促进膀胱癌细胞的生长、侵袭和迁移;体内裸鼠实验证明敲低PIK3CA后，膀胱肿瘤的生长和转移明显减少。　　结论：PIK3CA可以通过促进EMT过程，进一步促进膀胱癌细胞的生长，侵袭和转移过程。

关键词： 增生性瘢痕   成纤维细胞   缺氧   培养条件  

摘要： 研究背景和目的增生性瘢痕是组织修复过程中,成纤维细胞过度增殖及胶原合成与代谢异常造成的不良结果。常继发于烧伤及外伤后,表现为局限于皮损区域内的皮肤增厚,可导致机体严重的功能障碍及外观改变。增生性瘢痕的病因复杂,虽然已有大量研究报道,但是至今对其发病机理无统一认识,也缺乏令人满意的治疗手段,值得进一步探讨。既往研究显示,增生性瘢痕的发生发展过程与血管生成关系密切。增生性瘢痕早期即可观察到血管生成增加,其血供远比正常瘢痕丰富。新生血管随着增生性瘢痕的发展逐渐增多,这些新生血管增加了增生性瘢痕内的血流量,为增生性瘢痕带来更多的氧气和营养底物。一般认为,氧气和营养底物是促进细胞增殖和活性的积极因素,血流量增加可为增生性瘢痕成纤维细胞的过度增殖提供更多支持。因此我们设想,减少局部组织的供血或许会抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成,从而改善增生性瘢痕的发生发展。本实验采用低氧同时等比例减少营养底物供给的方式,体外模拟缺血造成的低氧及低营养底物状态。观察其对增生性瘢痕成纤维细胞生物学活性的影响。研究方法体外常规培养人HSF。取第4～6代细胞按随机数字表法分为10%氧体积分数+标准培养基(对照组)、7%氧体积分数+70%浓度的标准培养基(实验组1)、4%氧体积分数+40%浓度的标准培养基(实验组2)、1%氧体积分数+10%浓度的标准培养基(实验组3)。先将各组成纤维细胞用10%氧体积分数+标准培养基培养48h后,再采用不同培养条件分别培养。48h后应用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞仪技术和钙依赖磷脂结合蛋白异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染法、羟脯氨酸试剂盒,蛋白质印迹法分别检测各组成纤维细胞的细胞活力、S期比例、活细胞比例、胶原合成和转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量。研究结果(1)与对照组相比较,实验组1中成纤维细胞的细胞活力、S期比例、胶原合成水平和TGF-β1含量均较高(P<0.05)。(2)与对照组相比较,实验组2中成纤维细胞的胶原合成水平与TGF-β1含量较高(P<0.05),细胞活力与S期比例的差异无统计学意义(P>0.05)。与实验组1相比较,实验组2中成纤维细胞的以上四项指标较低(P<0.05)。(3)实验组3中成纤维细胞的以上四项指标均低于对照组及实验组1、2(P<0.05)。(4)与对照组相比较,实验组1、2的活细胞比例无明显差异(P>0.05),实验组3的活细胞比例与其他三组相比差异有统计学意义(P<0.05)研究结论轻度的低氧与低营养底物可增加成纤维细胞的生物学活性,随着氧与营养底物浓度的下降,成纤维细胞的生物学活性逐渐降低。重度的低氧与低营养底物不但能够抑制成纤维细胞的生物学活性,还可促进成纤维细胞凋亡。

关键词： 脂肪间充质干细胞(ADSCs)   分离培养   肌腱损伤   动物模型   细胞治疗  

摘要： 研究目的:肌腱损伤常见于以突然反复性跑、跳动作为主要项目的运动员,因受损后恢复差且易复发等问题,已成为制约运动员个人发展、训练与比赛的关键因素。目前基于脂肪间充质干细胞的再生治疗被寄予厚望,具有广阔的临床应用前景。本研究通过建立牛脂肪间充质干细胞体外扩增培养体系与胶原酶诱导的小鼠肌腱损伤模型,以探讨脂肪间充质干细胞治疗肌腱损伤的效果及其参与受损肌腱修复的可能机制。研究方法:采用酶消化法获取胎牛心包外脂肪组织中的间充质干细胞,绘制其生长曲线并检测克隆形成能力;通过RT-PCR、细胞免疫荧光、流式细胞术对分离的牛脂肪间充质干细胞进行基因和表面标记物检测;体外诱导牛脂肪间充质干细胞向成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞方向分化;建立胶原酶引发的小鼠阿基里斯跟腱损伤模型,分别观察正常对照组、损伤后对照组、损伤后安慰剂注射组以及损伤后牛脂肪间充质干细胞移植治疗组在24h、3d、5d、7d、14d、21d、28d以及35d的肌腱组织学形态、细胞示踪及在体分化情况。研究结果:1.采用酶消化法成功分离与获取胎牛脂肪间充质干细胞,分离后的牛脂肪间充质干细胞具有良好的自我增殖能力,在体外可继代培养至50代。经冻存后复苏的牛脂肪间充质干细胞仍具有较高活性。2.通过RT-PCR、细胞免疫荧光、流式细胞术对分离的牛脂肪间充质干细胞进行基因和表面标记物检测,结果显示牛脂肪间充质干细胞阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、OCT4、SOX2、NANOG和MHC-I,不表达CD45和MHC-II。3.体外培养的牛脂肪间充质干细胞可向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞方向分化,RT-PCR检测成骨细胞相关基因BGLAP、ALP、Runx2诱导后14天表达,茜素红S染色阳性;脂肪细胞相关基因LPL、PPAR-γ诱导后14天表达,油红O染色阳性;软骨细胞相关基因COL2A1、ACAN诱导后21天表达,阿利新蓝染色阳性。4.H&E染色显示损伤后24h肌腱组织正常结构破坏,损伤后对照组和损伤后安慰剂注射组肌腱组织在35d仍未完全自愈;损伤后牛脂肪间充质干细胞移植治疗组肌腱组织在损伤后24h、3d和5d有大量炎性细胞聚集,35d后基本恢复正常形态结构。细胞免疫荧光显示CM-Dil标记移植的牛脂肪间充质干细胞可在体表达腱细胞相关蛋白TNMD。研究结论:本研究成功建立了胎牛脂肪间充质干细胞体外分离、培养与扩增体系,培养的牛脂肪间充质干细胞自我更新与增殖能力强,在体外可以传至50代,干细胞特性和低免疫原性不会因多次传代而改变。移植的牛脂肪间充质干细胞可迅速迁移至I型胶原酶诱导的小鼠肌腱损伤部位,表达腱细胞相关蛋白,促进肌腱组织再生与修复。