关键词:
肝细胞癌
RNF145
细胞增殖
迁移
侵袭
WNT信号通路
摘要:
目的 基于生物信息数据库分析肝细胞癌(HCC)组织RNF145表达与HCC患者预后、基因突变、临床特征、免疫细胞和免疫检查点间的关系,采用细胞实验验证RNF145对SK-HEP-1细胞增殖、迁移和侵袭的影响,探讨其作用机制。方法 (1)采用TIMER数据库分析33种恶性肿瘤组织中RNF145的表达情况。比较TCGA数据库357例HCC患者癌组织及50份正常组织RNF145 mRNA相对表达量;比较357例HCC患者不同T分期、病理分级、临床分期者癌组织RNF145 mRNA相对表达量。以癌组织RNF145 mRNA相对表达量均数(3.86)为界,将357例HCC患者分为高表达组178例(RNF145 mRNA相对表达量≥3.86)和低表达组179例(RNF145 mRNA相对表达量<3.86),绘制Kaplan-Meier生存曲线,比较RNF145高表达组与低表达组总生存率、无疾病生存率和无进展生存率;采用单因素和多因素Cox回归分析357例HCC患者死亡的影响因素。根据TCGA数据库357例HCC患者癌组织DNA甲基化情况,分析癌组织RNF145表达与DNA甲基化的相关性,鉴定潜在的CpG位点,分析甲基化位点与RNF145表达的相关性。以与RNF145表达具有相关性的特异性甲基化位点(cg02298193、cg06030535、cg11495854、cg01657408)表达的中位数(0.077、0.590、0.075、0.050)为界,以大于等于中位数为高表达、小于中位数为低表达,通过Kaplan-Meier生存曲线比较特异性甲基化位点高、低表者总生存率。应用cBioPortal数据库分析HCC组织RNF145突变频率。应用COSMIC数据库分析RNF145在HCC中常见的突变类型及碱基改变。应用TCGA数据库分析357例HCC患者RNF145高、低表达组癌组织的基因突变情况。应用TCGA数据库分析HCC组织中与RNF145表达呈正、负相关的前5个基因,对其进行KEGG通路富集分析,采用TCGA、ICGC数据库验证与RNF145表达相关的信号通路。应用TIMER数据库分析RNF145表达与免疫细胞和免疫检查点的关系。(2)取2017年3月—2019年1月河南省人民医院3例HCC患者手术切除的癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学法检测RNF145表达。(3)取对数生长期SK-HEP-1细胞,分为敲低组(转染RNF145 siRNA)、空载组(转染RNF145 siRNA-NC)、甲基化组(采用S-腺苷基甲硫氨酸诱导甲基化)和对照组(正常培养不做处理),采用实时荧光定量PCR法检测4组RNF145 mRNA相对表达量。检测敲低组和空载组细胞划痕愈合率、侵袭细胞数和细胞增殖率。结果 (1)TIMER数据库分析结果显示,RNF145在胆管癌、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、HCC、胃癌、子宫内膜癌组织中表达均升高。TCGA数据库分析结果显示,HCC患者癌组织RNF145 mRNA相对表达量(2.34±0.70)高于正常组织(1.91±0.50)(t=4.125,P<0.001)。T1~T2期、病理分级G1~G2级、临床分期Ⅰ~Ⅱ期的HCC患者癌组织RNF145 mRNA相对表达量分别低于T3~T4期、G3~G4级、Ⅲ~Ⅴ期者(t=3.879~4.174,P均<0.001)。RNF145高表达组总生存率(42.9%)、无疾病生存率(37.5%)、无进展生存率(48.2%)均低于RNF145低表达组(61.4%、54.4%、65.8%)(χ^(2)=5.914~13.390,P均<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,RNF145表达(HR=1.040,95%CI:1.006~1.074,P=0.020)、T分期(HR=1.675,95%CI:1.288~2.177,P<0.001)是HCC患者死亡的影响因素。HCC患者癌组织RNF145表达与RNF145甲基化程度呈负相关(r=-0.260,P<0.001)。RNF145的启动子区域鉴定出10个潜在的CpG位点,特异性CpG位点cg06030535(r=-0.170,P=0.0014)、cg02298193(r=-0.110,P=0.032)、cg11495854(r=-0.210,P<0.001)、cg01657408(r=-0.270,P<0.001)的甲基化程度与RNF145表达均呈负相关。甲基化位点cg06030535、cg02298193、cg11495854低表达者总生存率(50.88%、55.56%、55.00%)分别高于高表达者(48.49%、38.10%、46.67%)(χ^(2)=5.907~15.870,P均<0.05)。cBioPort