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关键词： 3D   微球   肿瘤模型   骨肉瘤  

摘要： 目的:用微流控装置制备甲基丙烯酰化明胶(Gelatin methacryloyl,GelMA)微球,探究3D微球环境对骨肉瘤MG63细胞生物学行为的影响。方法:(1)用微流控装置制备GelMA微球,扫描电子显微镜观察微球及负载MG63细胞的形态,DAPI和F-actin染色观察细胞形态,活/死染色法测定微球的生物相容性(2)PCR检测生长在微球上的MG63细胞7d时肿瘤细胞干性、迁移、上皮间充质转化、凋亡及促破骨相关基因的表达;通过CCK-8法检测生长在微球上的MG63细胞增殖性;通过PI染色法检测3D微球环境下MG63细胞的周期;通过流式细胞术检测药物干预下生长在微球上的MG63细胞的凋亡;通过Transwell及划痕实验检测在3D微球环境下生长MG63细胞的迁移性。通过TRAP染色观察3D微球环境下MG63上清培养液诱导的小鼠骨髓单核-巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMM)破骨分化情况及PCR检测破骨基因表达。结果:(1)制备的GelMA微球高度单分散,生物相容性好,微球上的MG63细胞形态良好。(2)PCR结果显示3D微球环境下的MG63干性、迁移、上皮间充质转化、抗凋亡及促破骨相关基因的表达均升高,CCK8结果表明相对于细胞培养板,微球的3D环境促进了骨肉瘤MG63细胞的增殖。PI染色法表明3D微球环境促进了DNA合成并促进细胞周期从G1期向S期分化。流式细胞术说明3D微球环境增强了骨肉瘤MG63细胞的抗凋亡特性,与抗凋亡基因上调表达有关。TRAP染色表明3D微球环境增强了骨肉瘤MG63细胞的促进破骨分化的能力,PCR结果显示促进了破骨相关基因的表达。结论:用微流控制备的GelMA微球生物相容性好,是适用于骨肉瘤MG63细胞的体外培养模型;基于3D微球环境增强了骨肉瘤MG63细胞的恶性相关生物学行为,为进一步研究骨肉瘤的生物学行为和药物筛选提供新的研究手段。

关键词： 血小板活化因子   顶体反应   酪氨酸磷酸化   人精子ERK信号通路   人类精子受精能力  

摘要： 目的血小板活化因子(Platelet-activating factor,PAF)促进精子受精潜能,从而提高受精率和临床妊娠率。方法通过FITC-PSA染色确定顶体状态、酪氨酸磷酸化检测、细胞外信号调节激酶活性(ERK)的检测来分别分析PAF对精子顶体反应、精子蛋白酪氨酸磷酸化及人精子ERK信号通路的作用。结果 PAF处理显著(P<0.05)提高了精子顶体反应的百分率;不同浓度PAF孵育对人精子的运动无影响,所有浓度的PAF处理均能诱导精子蛋白磷酸化酪氨酸的表达;在浓度为10nM的PAF处理下,人精子中ERK1和ERK2蛋白水平显著升高;使用浓度>0.1μM的U0126预处理可显著并且剂量依赖性地抑制了PAF诱导的人精子顶体反应(P<0.05),U0124对PAF诱导的人精子顶体反应无影响。结论 PAF诱导精子顶体反应和酪氨酸磷酸化。PAF通过促进ERK1和ERK2的酶活性激活人精子中的ERK信号通路介导对精子顶体反应的提高。我们的研究结果进一步验证了PAF对人类精子受精能力的潜在作用。

关键词： 骨肉瘤   Ski   siRNA   增殖   迁移  

摘要： 背景 骨肉瘤起源于间叶组织,是骨关节系统最常见的恶性肿瘤,其治愈率较低,对青少年健康的危害较高,在早期易发生肺部转移,死亡率较高。近年来,随着外科手术的发展和新辅助联合化疗的广泛应用,患者5年生存率得到显著提高,但发生转移的患者5年生存率仍较低。因此,深入探讨骨肉瘤发生转移机制,寻找新的治疗靶点进而延长已发生转移者的生存期是目前亟需解决的问题。Ski基因在不同物种中广泛参与并调节多种细胞的增殖及分化等过程,在生物进化过程中高度保守,参与多种信号通路,且与肿瘤的发生发展、增殖、分化等密切相关。已有研究表明,Ski基因在多种肿瘤组织中呈高表达状态,Ski基因的激活或异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。而有关Ski对骨肉瘤细胞增殖和迁移影响的研究在国内外尚无相关报道。目的 探讨沉默Ski基因骨肉瘤U-2OS细胞是否会出现生物学活性的改变。继而研究骨肉瘤病致病机制并对其早期预防、诊断、治疗提供理论依据。方法 实验分为3组:空白对照组(未转染的骨肉瘤细胞)、阴性对照组(转染阴性对照序列)和沉默组(转染Ski-siRNA)。采用脂质体法将特异性针对Ski基因的siRNA和阴性对照siRNA转入骨肉瘤U-2OS细胞,构建Ski基因沉默表达的骨肉瘤U-2OS细胞系,随后采用蛋白质印迹法验证Ski-siRNA干扰后能否有效降低细胞中Ski蛋白的表达水平;CCK-8法检测沉默Ski表达后骨肉瘤细胞的增殖活力;采用流式细胞术分析细胞周期;采用细胞划痕实验检测Ski-siRNA转染后骨肉瘤U-2OS细胞迁移能力的变化。采用蛋白质免疫印迹法检测沉默Ski基因后对PCNA、CyclinD1和基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9表达水平的影响。结果 成功构建Ski基因沉默表达的骨肉瘤U-2OS细胞系。Western blot结果显示,Ski-siRNA转染后骨肉瘤U-2OS细胞Ski蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。CCK-8结果表明,Ski-siRNA基因组在12h,24h,48h细胞增殖活力明显降低(P<0.05)。与对照组相比,Ski-siRNA组细胞周期G1期细胞比例明显增高,而S期和G2期细胞比例均显著降低(p<0.05)。细胞划痕实验显示,Ski-siRNA处理组细胞在12、24、48小时的划痕愈合率均低于siRNA对照组,均具有统计学意义(P<0.05),此外,Ski-siRNA处理组中PCNA、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论 沉默Ski基因能显著抑制骨肉瘤U-2OS细胞的增殖、迁移能力,提示Ski有望成为骨肉瘤治疗的新靶点。

关键词： GRK5   非小细胞肺癌   小干扰RNA(siRNA)  

摘要： [背景及目的]肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,非小细胞肺癌(non-small-cell Lung cancer,NSCLC)约占所有病例的80%,是肺癌的主要亚型。由于肺癌易复发和转移,目前放化疗和分子靶向治疗是临床上针对晚期非小细胞肺癌主要治疗方案。其中分子靶向治疗具有毒副反应小、疗效好等优点,在临床治疗中显著提高了患者的生活质量。尽管靶向药物对治疗肿瘤有着突出的优点,但分子靶向治疗只适用于特定基因突变患者,而且容易产生耐药,而对于未发现基因突变的人群,治疗上仍然是个空白区。因此探索新的药物靶点已成为目前肺癌治疗的研究热点。我们课题前期通过对非小细胞肺癌组织样本进行免疫组织化学分析发现,相比癌旁组织,G蛋白偶联受体激酶5(GRK5)在肺癌组织中高表达;与免疫组化结果一致的是,利用qRT-PCR 比较肺癌及癌旁组织GRK5的转录表达水平,以及比较正常肺上皮细胞系BEAS-2B等发现,GRK5在肺癌组织及细胞系中确实高表达;由此推测,GRK5在非小细胞肺癌中起着重要的作用。GRK5已被证明在包括癌症在内的多种病理条件的发展和进展中发挥关键作用。本研究通过检测GRK5在非小细胞肺癌细胞中的表达情况,探讨其生物学意义及相关性;同时,我们将非小细胞肺癌细胞株H1299及SPC-A1作为实验对象,通过在这两株细胞中抑制表达GRK5,观察GRK5对非小细胞肺癌H1299及SPC-A1细胞增殖、迁移、侵袭等生物学影响;探讨其分子表达的机制,以期未来将GRK5作为NSCLC诊断、治疗及预后的新靶点。[方法]1、构建抑制GRK5表达的siRNA(小干扰RNA),并用脂质体法转染H1299及SPC-A1细胞,同时设NC作为阴性对照组。2、通过荧光及qRT-PCR筛选稳定细胞转染株;用Western Blot检测抑制GRK5表达后对H1299、SPC-A1细胞中GRK5蛋白表达的影响。3、用CCK8法检测抑制GRK5表达对H1299、SPC-A1细胞增殖能力的影响。4、用Transwell小室检测抑制GRK5表达对H1299、SPC-A1细胞迁移及侵袭能力的影响。5、用细胞划痕的方法检测抑制GRK5表达对非小细胞肺癌细胞H1299、SPC-A1迁移能力的影响。[结果]1、qRT-PCR检测表明GRK5 siRNA能明显抑制H1299、SPC-A1肺癌细胞株中GRK5表达水平(p<0.05)。2、Western Blot结果表明经GRK5 siRNA转染后,GRK5蛋白表达均降低(p<0.05)。3、CCK8检测表明GRK5 siRNA转染H1299、SPC-A1肺癌细胞后细胞增殖受到显著抑制(p<0.05)。4、细胞划痕实验表明经GRK5 siRNA转染H1299、SPC-A1肺癌细胞后迁移速度明显减慢(p<0.05)。5、细胞迁移、侵袭实验表明经GRK5 siRNA转染H1299、SPC-A1肺癌细胞后迁移速度明显减慢(p<0.05)。[结论]1、GRK5在非小细胞肺癌细胞中高表达。2、抑制GRK5表达可明显抑制肺癌细胞株H1299、SPC-A1的增殖,减低其迁移速度,减弱侵袭能力,进而促进肺癌细胞H1299、SPC-A1的凋亡。3、本实验中探讨了 GRK5与非小细胞肺癌细胞生物学功能的相关性,为非小细胞肺癌治疗的新靶点提供思路。

关键词： IL-15Rα   IL-15/IL-15Rα通路   胃癌   甲基化   增殖   迁移   侵袭  

摘要： 背景与目的白细胞介素15受体阿尔法(Interleukin 15 Receptor alpha,IL-15Rα)是白细胞介素15(Interleukin 15,IL-15)的特异性受体,IL-15与细胞表面的IL-15Rα结合形成IL-15/IL-15Rα复合物后与白细胞介素2受体贝塔(Interleukin 2 Receptor bita,IL-2Rβ)以及白细胞介素2受体伽马(Interleukin 2 Receptor gama,IL-2Rγ)形成异三聚体,主要调节细胞毒性T细胞和NK细胞的增殖和分化。IL-15在受体结合、信号传递和生物学效应等方面与IL-2有共同特征,IL-2已用于临床治疗肾细胞癌和黑色素瘤,故IL-15在肿瘤免疫治疗中也备受关注。IL-15Rα除在单核细胞和树突状细胞表面表达外,在肝脏、心脏、脾脏、肺、骨骼肌和内皮细胞等许多非淋巴组织中也能检测到。胃癌(Gastric carcinoma,GC)作为高发病率和高致死率的肿瘤,其癌细胞也具有表达IL-15Rα的功能。癌症基因组图谱(The cancer genome atlas,TCGA)数据库分析结果显示IL-15Rα在胃癌组织的表达显著高于癌旁组织。EB病毒相关性胃癌(Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma,EBVaGC)是一种胃癌细胞内感染EBV的胃癌亚型,EBV的感染会导致宿主细胞的基因组发生表观遗传学改变,另有研究报道IL-15Rα在感染EBV的胃癌细胞AGS(AGS-EBV)中表达受抑制,提示IL-15Rα在胃癌中可能发挥重要的作用。本实验主要研究IL-15Rα通过IL15/IL-15Rα信号通路对胃癌细胞的作用,以期初步理解胃癌细胞所表达IL-15Rα对胃癌发生发展的影响及对胃癌免疫治疗潜在靶向位点进行探索。方法***数据库分析胃癌样本和癌旁样本IL-15RαmRNA水平,RT-PCR和Western Blotting分析胃癌细胞IL-15Rα的表达水平。***细胞增殖实验、克隆形成实验、划痕实验与transwell小室实验检测IL-15Rα表达水平对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响。***-PCR和Western Blotting检测甲基化酶抑制剂5-氮杂-2′脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理胃癌细胞后IL-15RαmRNA和蛋白的变化。MTT细胞增殖实验、划痕实验检测5-Aza-CdR药物处理胃癌细胞后胃癌细胞增殖与迁移能力的变化。***细胞增殖实验和克隆形成实验检测外源性IL-15对胃癌细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测外源性IL-15对胃癌细胞凋亡的影响及对与胃癌细胞共培养外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)p-STAT5水平的影响。结果***数据库分析胃癌样本与癌旁样本IL-15RαmRNA水平,胃癌样本IL-15RαmRNA水平比癌旁样本高(P<0.05)。2.胃癌细胞AGS中IL-15Rα的表达水平显著高于AGS-EBV细胞(P<0.05),且高表达IL-15Rα的AGS细胞比低表达IL-15Rα的AGS-EBV细胞在增殖、迁移与侵袭方面能力强(P<0.05)。3.甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR对胃癌细胞中IL-15Rα基因的表达具有抑制作用(P<0.05),且导致细胞增殖和迁移能力降低(P<0.05)。4.外源性IL-15(100ng/mL)可促进胃癌细胞增殖,抑制其凋亡(P<0.05)。5.外源性IL-15(100ng/mL)可促进表达IL-15Rα的胃癌细胞对共培养PBMC活化的诱导作用(P<0.05)。结论***数据库分析结果显示IL-15Rα在胃癌组织中高表达,提示IL-15Rα可能参与胃癌的发生发展。2.结合高表达IL-15Rα的AGS细胞比低表达IL-15Rα的AGS-EBV细胞在增殖、迁移与侵袭方面能力强,甲基化转移酶抑制剂5-Aza-CdR抑制胃癌细胞IL-15Rα表达且导致细胞增殖和迁移能力降低的生物学行为特征,提示临床病理中EBVaGC的预后较好可能与IL-15Rα低表达相关。3.表达IL-15Rα的胃癌组织免疫细胞浸润缺乏时,外源性IL15促进肿瘤细胞增殖,使用IL15治疗可能具有促进肿瘤进展的危险;而伴有免疫细胞浸润时,外源性IL15依赖胃癌细胞内源性IL-15Rα对PBMC的活化则可能有利于IL-15介导的免疫抑制治疗。

关键词： 微课   在线教育   混合式教学   雨课堂  

摘要： 本文基于贵州医科大学医学细胞生物学实验课程开展的混合式教学实践,对基于微课视频和雨课堂的混合式教学进行了初步探析。从混合式教学设计、在线学习监督分析、现场教学环节设计、教学效果分析等几个方面进行总结、研究。文章的研究可为高校教师开展混合式教学、翻转课堂教学等提供参考。

关键词： 胶质瘤   慢病毒载体   E2F-1基因   U251细胞  

摘要： 目的:探究转录因子E2F-1对胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响。脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,占颅内原发肿瘤的50%以上,发病人群跨越不同年龄段。手术切除为主,辅助放化疗为其主要治疗方案。胶质瘤呈高浸润性生长,术后容易复发,严重威胁着患者的生存期。准确发现胶质瘤的微卫星灶,利用载体携带治疗药物或基因靶向作用于胶质瘤部位,成为近年来探索胶质瘤治疗的新方向,有望能为胶质瘤的治疗探索出更有效和精确的方法。E2F-1是转录因子E2F家族成员之一,它和异源性蛋DP1/2结合后,成为细胞周期素依赖的蛋白激酶(CDKs),是下游调控细胞周期和凋亡的重要因子。E2F-1在多种恶性肿瘤中表达异常,为肿瘤发生发展中的一个重要致病因素,但对E2F-1与脑胶质瘤的研究相对较少。本实验利用RNAi技术,敲低胶质瘤U251细胞中E2F-1基因的表达,通过MTT、Transwell实验观察U251细胞增殖能力及侵袭能力的改变。从而为E2F-1对U251细胞生物学特征的影响作用机制,以及为探索脑胶质瘤治疗新途径奠定基础。材料和方法:本研究通过对人胶质瘤U251细胞进行培养,以人胶质瘤U251细胞为研究对象,以制备完成的慢病毒介导沉默E2F-1基因使细胞低表达E2F-1蛋白,从而构建低表达E2F-1基因的胶质瘤U251细胞模型E2F-1-shRNA组、对照慢病毒参与构建阴性对照NC-shRNA组及正常培养的U251细胞作为空白对照组。通过嘌呤霉素筛选,荧光显微镜下观察转染后细胞生长状态、荧光细胞数比例,进而获得稳定转染的细胞系。通过Real-time PCR法、Western blot方法检测稳定转染表达绿色荧光的U251细胞中E2F-1 mRNA及蛋白表达量,鉴定慢病毒对E2F-1基因的敲低效果。通过MTT、Transwell实验观察低表达E2F-1基因的胶质瘤U251细胞较阴性对照组及空白对照组细胞增殖、侵袭能力的改变。本研究采用SPSS 18.0和GraphPad Prism7软件对数据进行统计分析,P<0.05表示实验所得数据具有统计学意义。结果:慢病毒转染U251细胞经嘌呤霉素筛选,在荧光显微镜下观察可发现,绿色荧光细胞可占白光视野下细胞90%以上,表明慢病毒稳定转染的细胞系构建成功。Real-time PCR、Western blot方法检测结果表明E2F-1-shRNA组的E2F-1的mRNA及蛋白表达量较NC-shRNA组和空白组明显降低(P<0.05),NC-shRNA组和空白组的mRNA及蛋白表达量无明显差异(P>0.05),表明通过RNAi技术成功构建了低表达E2F-1基因的胶质瘤U251细胞模型。MTT实验检测并绘制各组U251细胞生长曲线,发现E2F-1-shRNA组U251细胞较NC-shRNA组和空白组增殖能力显著降低(P<0.05),NC-shRNA组和空白组间无明显差异(P>0.05);Transwell实验表明E2F-1-shRNA组较NC-shRNA组和空白组细胞穿过纤维素膜孔的肿瘤细胞个数显著减少(P<0.05),NC-shRNA组和空白组细胞穿过纤维素膜孔的细胞个数无明显差异(P>0.05)。结论:靶向沉默E2F-1基因能够显著抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、侵袭能力。为探究转录因子E2F-1在脑胶质瘤中的作用机制以及寻找胶质瘤治疗新途径奠定基础。

关键词： 姜黄素   HepG2细胞   细胞凋亡   肝癌  

摘要： 【目的】　　本实验采用姜黄素药液作用于人肝癌HepG2细胞，探讨姜黄素抑制人肝癌HepG2细胞增殖的作用机制，从而为姜黄素在临床治疗肝癌方面提供理论依据。　　【方法】　　采用不同浓度的姜黄素药液作用于人肝癌HepG2细胞，并设纯DMEM培养HepG2细胞作为空白对照组。　　（1）应用MTT法检测细胞抑制率，并且绘制曲线图，筛选姜黄素最佳的作用浓度及时间;（2）用流式细胞仪检测姜黄素各浓度组对HepG2细胞凋亡的影响;（3）采用流式细胞仪检测姜黄素各浓度组对HepG2细胞周期的影响;（4）通过细胞划痕实验检测姜黄素对HepG2细胞迁移能力的影响;（5）采用免疫细胞化学SABC法检测相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3的表达，相关周期蛋白Cyclin-A1、Cyclin-B1的表达，以及VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白表达。　　【结果】　　（1）MTT结果表明，姜黄素可以有效地抑制人肝癌HepG2细胞增殖，并呈药物浓度依赖性，空白对照组，20，40，60μmol/L的姜黄素药液组48h的抑制率分别是：0、42.90%、55.68%、66.76%，姜黄素药液组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05）。　　（2）细胞凋亡结果表明：姜黄素对人肝癌HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用，空白对照组，20，40，60μmol/L的姜黄素药液组48h的凋亡率分别是：0.3%、18.0%、24.7%、86.9%，姜黄素药液组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05）。免疫细胞化学结果显示：空白对照组Bcl-2呈强阳性表达，而Bax、Caspase-3低表达，随着姜黄素药液浓度的增加，HepG2细胞内Bcl-2蛋白表达减少，Bax、Caspase-3蛋白的表达增多，提示姜黄素可能通过下调Bcl-2，上调Bax、Caspase-3的表达进而诱导HepG2细胞凋亡;（3）细胞周期结果表明：姜黄素药液处理的HepG2细胞在S期阻滞，空白对照组，20μmol/L的姜黄素药液组，其S期的百分比分别为24.11%、32.68%，姜黄素组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05）。免疫细胞化学结果显示：20μmol/L的姜黄素组HepG2细胞内Cyclin-A1蛋白的表达与空白对照组相比明显减少，而Cyclin-B1的表达在姜黄素药液作用前后无明显变化，提示姜黄素可能通过下调Cyclin-A1的表达阻滞HepG2细胞在S期，进而抑制HepG2细胞增殖;（4）细胞划痕实验结果表明：姜黄素药液可以有效的抑制人肝癌HepG2细胞迁移，随着药液浓度的增高，划痕愈合率逐渐降低，而空白对照组愈合的最为明显，姜黄素组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05），说明姜黄素药液可以抑制HepG2细胞的迁移;（5）免疫细胞化学SABC法检测蛋白VEGF、HIF-1α及STAT3的表达表明：随着姜黄素药液浓度的增加，HepG2细胞内VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白的表达与空白对照组相比均显著减少，说明姜黄素可能通过下调VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白的表达抑制HepG2细胞的增殖。　　【结论】　　（1）姜黄素对人肝癌HepG2细胞具有明显的抑制增殖作用;（2）姜黄素通过下调Bcl-2，上调Bax、Caspase-3蛋白的表达诱导HepG2细胞凋亡;（3）姜黄素通过下调CyclinA1蛋白的表达使HepG2细胞周期阻滞于S期;（4）姜黄素可以抑制HepG2细胞的迁移;（5）姜黄素通过下调VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白的表达，发挥抑制HepG2细胞增殖作用。

关键词： EZH2   MCP-1   肿瘤干细胞   上皮间质转化   Wnt/β-catenin  

摘要： 研究背景:乳腺叶状肿瘤（Breast phyllodes tumors）为罕见的具有上皮及间质双相恶变的乳腺纤维上皮性肿瘤[1],是研究上皮间质相互作用和上皮间质转化的理想载体。乳腺叶状肿瘤具有局部复发和远处转移的特性,严重影响患者的预后和健康。EZH2参与肿瘤的发生发展、侵袭迁移的过程[2,3],Wnt/β-catenin信号通路影响细胞极性、细胞粘附、细胞凋亡和肿瘤发生过程[4,5],二者在肿瘤干细胞的自我更新、上皮间质转化中均发挥重要作用。研究者通过免疫组化研究发现,乳腺叶状肿瘤组织中上皮Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促使乳腺叶状肿瘤的间质过度生长[6,7]。同时发现恶性乳腺叶状肿瘤组织中EZH2过度表达,并且与基质上皮下ALDH1高表达共同支持乳腺叶状肿瘤可能来自肿瘤干细胞的假说[8]。研究证实EZH2参与Wnt/β-catenin通路的调控[9]和促进上皮间质转化过程,通过激活β-catenin的信号传导,EZH2能够增强乳腺癌干细胞的自我更新和增殖能力。但目前仍缺乏实验证实EZH2能否通过Wnt/β-catenin信号通路影响乳腺叶状肿瘤细胞,进而影响乳腺叶状肿瘤的生物学行为。乳腺叶状肿瘤缺乏有效治疗方法,尚需实验证实有效靶点以解决复发和放化疗抵抗问题。EZH2可能是乳腺叶状肿瘤治疗的潜在重要靶点,可能通过促进乳腺叶状肿瘤细胞的干细胞作用,从而促进乳腺叶状肿瘤的发生、发展、复发及放化疗抵抗,有待进一步的实验证实。研究目的:本实验以人恶性乳腺叶状肿瘤细胞系（MCP-1）为研究对象,探讨EZH2对人乳腺叶状肿瘤细胞增殖、迁移侵袭、凋亡、干性、EMT方面的影响;探讨EZH2在人乳腺叶状肿瘤细胞中对Wnt/β-catenin信号通路的影响及相关机制,为乳腺叶状肿瘤新的治疗方案提供理论基础。材料和方法:实验将MCP-1细胞分为无关序列转染组（NC组）、EZH2-shRNA转染组（EZH2-shRNA组）两组。（1）采用细胞活力实验（CCK-8法）、克隆形成实验检测下调EZH2对MCP-1细胞增殖能力的影响,Western Blot检测增殖相关蛋白PCNA蛋白表达水平变化。（2）划痕实验、Transwell迁移和Transwel matrigel侵袭实验检测下调EZH2对MCP-1细胞迁移侵袭能力的影响,Western Blot检测侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9蛋白表达水平变化。（3）Tunel实验、Hoechst 33258实验检测下调EZH2对MCP-1细胞凋亡能力的影响,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、cleaved PARP、cleaved Caspase3蛋白表达水平变化。（4）细胞免疫荧光实验检测下调EZH2对MCP-1细胞EMT过程的影响,Western Blot检测EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、Snail1蛋白表达水平变化。（5）细胞成球实验检测下调EZH2对MCP-1细胞干性增殖能力的影响,Western Blot检测肿瘤干细胞标志物ALDH1、SOX2、OCT4蛋白表达水平变化。（6）RT-PCR检测下调EZH2的MCP-1细胞中Wnt/β-catenin通路中的β-catenin、GSK-3β的RNA表达变化、Western Blot检测Wnt/β-catenin通路中β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达变化。结果:（1）下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1增殖能力的影响与NC组比较,细胞活力实验（CCK-8法）实验结果显示EZH2-shRNA组吸光度值明显降低,克隆形成实验结果显示EZH2-shRNA组克隆细胞集落形状明显变小及克隆细胞数均明显减少,Western Blot实验结果显示EZH2-shRNA组PCNA的蛋白表达明显降低,说明下调EZH2显著降低MCP-1细胞增殖能力。（2）下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1迁移、侵袭能力的影响与NC组比较,划痕实验结果显示EZH2-shRNA组迁移率明显降低,transwell迁移实结果显示EZH2-shRNA组穿膜的细胞数量明显减少,transwell matrigel侵袭实验结果显示EZH2-shRNA组穿透matrigel胶的细胞数量明显减少,Western Blot实验结果显示EZH2-shRNA组MMP-2、MMP-9的蛋白表达明显降低,说明下调EZH2显著降低MCP-1细胞迁移侵袭能力。（3）下调EZH2对乳腺叶状肿瘤细胞MCP-1凋亡能力的影响与NC组比较,Tunel凋亡实验结果显示EZH2-shRNA组细胞Tunel标记的阳性荧光细胞比例明显增加,Hoechst 33258凋亡实验结果显示EZH2-shRNA

关键词： 神经干细胞   脑老化   D-半乳糖   SOX2   BMI-1  

摘要： 目的建立D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型,人参皂苷干预老化神经干细胞以后,量化神经干细胞内维持生物学特性的两个内源转录因子SOX2和BMI-1的表达变化,探讨人参皂苷维持和增强老化神经干细胞生物学特性的作用。方法1选取孕15-17天大鼠,采用机械分离胚鼠海马NSCs的方法获得原代NSCs,之后传代培养。对NSCs进行特异性标志物Nestin鉴定,使用免疫荧光染色的方法。2CCK-8法筛选D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度和最佳时间。设置6个不同时间点(6h、12h、24h、48h、60h、72h),种6板,在每个板内设Dmem组、对照组以及不同剂量组(5、10、15、20、25、30、35、40mg/ml),之后加CCK-8,1-4h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度,整理数据,绘制标准曲线。3使用课题组前期用MTS法检测NSCs细胞增殖能力筛选出的人参皂苷最佳剂量(lug/ml)及最佳作用时间(24h),采用CCk-8法检测人参皂苷对D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型中老化神经干细胞的影响。4使用Western Blot法检测人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内SOX2和BMI-1蛋白的表达情况,实验分为正常组、老化组和老化加人参皂苷组。首先对三组NSCs细胞提取蛋白,按照蛋白提取试剂盒操作指示进行操作,制备蛋白样品,SDS-PAGE电泳,敷一抗二抗,最后使用凝胶成像仪检测目标蛋白,使用Image Pro Plus7.0软件对条带结果进行分析统计。5免疫荧光及细胞核染色检测正常神经干细胞,老化神经干细胞及人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内特异性标志物Nestin,以及SOX2和BMI-1的表达情况。实验分为正常组、老化组、老化加人参皂苷组,在细胞培养、造模、加人参皂苷并进行前期的免疫荧光常规实验操作以后,加入相应的Nestin、BMI-1、SOX2一抗二抗,加DAPI染色,封片后,在激光共聚焦显微镜下观察荧光标记的细胞并拍照并通过Image Pro Plus7.0图像分析软件分析其阳性细胞数、面密度和光密度。结果1成功分离培养胚鼠海马NSCs,并经免疫荧光证明其表达NSCs特异性标记物Nestin,可进行原代培养和传代培养,纯度为95%以上NSCs。2 D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度剂量是35mg/ml,D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳时间是24h。3采用CCk-8法检测人参皂苷对D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型中老化神经干细胞的影响与正常组相比,老化组吸光值明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。同老化组相比,人参皂苷组吸光值明显上升,差异具有统计学意义(P<0.01)。4Western Blot法检测人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内SOX2和BMI-1蛋白的表达情况神经干细胞正常组、老化组和人参皂苷组内的SOX2和BMI-1蛋白均阳性表达。神经干细胞老化组与正常组相比,SOX2表达明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),神经干细胞人参皂苷组与老化组相比,SOX2表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。神经干细胞老化组与正常组相比,BMI-1表达明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),神经干细胞老化加人参皂苷组与老化组相比,BMI-1表达明显升高,差异具有统计学意义(p<0.01)。5免疫荧光及细胞核染色检测正常神经干细胞,老化神经干细胞及人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内特异性标志物Nestin,以及SOX2基因和BMI-1基因的表达情况NSCs正常组、NSCs老化组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、SOX2、BMI-1阳性表达。与NSCs正常组相比,NSCs老化组的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和阳性细胞数均显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01);与NSCs老化组相比,NSCs人参皂苷组的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和阳性细胞数均增加,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)结论D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度剂量是35mg/ml,最佳时间是24h。人参皂苷可以促进老化NSCs中SOX2和BMI-1表达增加,证明人参皂苷能维持和增强衰老神经干细胞生物学特性,与人参延缓脑老化的临床作用密切相关。