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关键词： 颈椎间盘   髓核细胞   酶消化法   培养   Miyazaki分级   生物学特性  

摘要： 第一部分酶消化法分离培养人退变的颈椎间盘髓核细胞目的:从人的颈椎间盘髓核组织内分离培养髓核细胞并进行鉴定,镜下观察髓核细胞的生物学特性变化,为后续的研究提供重要的实验基础。方法:收集我院脊髓型颈椎病患者术中取出的髓核组织8例,经胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化后获得单细胞悬液并进行细胞培养和鉴定。镜下观察髓核细胞在培养过程中的形态学变化、生长速率并记录细胞贴壁时间和融合时间。结果:刚分离的髓核细胞多呈圆形,5-7天后细胞贴壁,细胞开始增殖,遗留的组织碎块边缘也开始出现细胞增殖,10-14天后细胞增殖加快,细胞呈三角形、短梭形,胞质伸出,细胞聚集成团。培养4周后细胞融合约85%,细胞轮廓欠清晰,外形欠饱满。传1代的细胞,培养2天内细胞增殖不明显,3-7天细胞增殖明显加快,进入对数生长期,10天之后细胞增殖减慢,进入平台期,此时髓核细胞数量达到峰值。随后细胞增殖和凋亡失衡,细胞数量开始呈下降趋势。刚分离的细胞贴壁时间和85%融合时间分别为7.1±2.9天和27.4±3.8天,而细胞传1代后细胞贴壁时间和85%融合时间明显缩短,分别为0.8±0.1天和9.1±2.3天。传至2代时,细胞贴壁时间和融合时间分别为0.7±0.2天和7.4±1.8天,与1代相比明显缩短具有统计学差异(P<0.05)。但细胞传至3代后,细胞贴壁时间为1.7±0.9天,而融合时间13.2±2.5天,两者均开始上升,差异具有有统计学意义(P<0.05)。结论:体外分离培养髓核细胞的过程中其增殖缓慢,培养周期较长,细胞形态也随着传代次数增多发生变化,逐渐呈老化趋势。因此要获取活性较好,纯度较高的髓核细胞比较困难,但对于组织工程椎间盘种子细胞的选择起到关键的作用。第二部分基于Miyazaki分级颈椎间盘内髓核细胞的生物学特性研究目的:探究不同Miyazaki分级的颈椎间盘内髓核细胞的生物学特性差异,进而评估颈椎间盘Miyazaki分级与椎间盘退变程度的一致性。方法:收集2017年12月-2018年7月我院骨科行颈前路椎体次全切除术(Anterior cervical corpectomy and fusion,ACCF)或颈前路椎间盘切除术(Anterior cervical discectomyand fusion,ACDF)的36例患者术中切除的颈椎间盘髓核组织,其中9例为双节段,27例为单节段,并按照Miyazaki分级分为4组,依次为Ⅱ级组(n=6),Ⅲ级组(n=10),Ⅳ级组(n=14),V级组(n=15)。其中男性为17人,女性为19人,平均年龄为43.2±5.1岁。获取椎间盘髓核组织后组织切片甲苯胺蓝染色和免疫组织化学染色观察髓核组织内细胞的密度分布以及Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白聚糖蛋白的表达情况。蛋白免疫印迹实验(Westernblotting,WB)进一步测定不同等级髓核组织内Ⅱ型胶原蛋白(Type Ⅱ collagen,ColⅡ)和聚蛋白聚糖(Aggrecan)的表达量。采用胰酶和Ⅱ型胶原酶共同消化分离髓核组织内的髓核细胞并进行培养和鉴定,台盼蓝染色测定各组髓核细胞的活性比率,光镜下观察髓核细胞的形态,并在培养过程中观察并记录不同代次和不同Miyazaki分级细胞的贴壁时间和融合时间;使用CCK-8法绘制不同Miyazaki分级组2代髓核细胞的生长曲线,比较各组之间的细胞生长速率。结果:随着颈椎间盘Miyazaki退变等级增高,组织内髓核细胞的密度降低,基质着色变浅,细胞周围的软骨陷窝也逐渐消失。髓核组织内细胞外基质中重要的Ⅱ型胶原蛋白和聚蛋白聚糖的表达量也逐渐降低。此外,颈髓核组织分离细胞培养后可见Ⅱ级椎间盘内髓核细胞呈三角形、短梭形,细胞轮廓清晰,折光性较好,Ⅲ级髓核组织内髓核细胞出现突起,伸出伪足,轮廓不清晰,Ⅳ级组髓核细胞突起明显,细胞形态多呈长梭形,而V级组的髓核细胞形态各异,轮廓模糊,细胞扁平,并且折光度也较差。分离髓核细胞后测得Ⅱ级组细胞活性比率为(94.1±4.6)%,Ⅲ级组活性比率为(84.5±6.2)%,Ⅳ级组活性比率为(77.5±5.8)%,而V级组的细胞活性比率为(66.4±4.9)%,组间两两比较均存在统计学差异(P<0.05)。分离获取的Ⅱ级组髓核细胞贴壁时间为108.5±19.2小时,Ⅲ级组为165.6±26.4小时,Ⅳ级组细胞贴壁时间为218.4±31.2小时,V级组贴壁时间为249.6±40.8小时,组间两两比较均具有统计学差异(P<0.05)。各组细胞第一次融合至可传代所需时间Ⅱ级组:21.4±2.4天,Ⅲ级组:26.5±2.5天,Ⅳ级组:30.2±2.9天,V级组所需时间为33.6±3.8天,组间比较具有统计学差异(P<0.05)。在各组细胞培养过程中,细胞传至1-3代时贴壁时间和融合至90%时间均较P0代明显缩短,但P3

关键词： 基因Y   基因U   口腔鳞状细胞癌   剪切体   scc-25  

摘要： 第一部分在口腔鳞癌细胞系中基因Y高表达及敲降稳转细胞系的建立及其对生物学表型的影响目的:通过在口腔鳞癌细胞中实现基因Y的表达改变,研究基因Y对该细胞增殖、迁移等生物学行为的影响,从而探索基因Y在口腔鳞状细胞癌发生发展过程中的作用,为探索其分子机制和寻找肿瘤标志物提供线索和方向。方法:1.高表达和敲降基因Y的慢病毒颗粒转染口腔鳞癌细胞(scc-25细胞),经嘌呤霉素(puro)筛选后建立该细胞的稳转细胞系;采用qPCR实验及Western Blot实验验证该稳转细胞系中基因Y在mRNA及蛋白水平的表达变化情况。2.采用实时无标记细胞功能分析仪进行生长曲线的测定,检测基因Y对细胞增殖能力的影响;采用transwell实验检测基因Y对细胞迁移及侵袭能力的影响;采用克隆形成实验检测基因Y对细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术检测基因Y对细胞的细胞周期分布情况的影响。3.采用裸鼠皮下成瘤实验,检测基因Y对裸鼠皮下瘤体生长情况的影响。结果:1.经qPCR实验及Western Blot实验验证,基因Y在该细胞中的mRNA及蛋白水平均有明显的升高与降低,说明口腔鳞癌的基因Y高表达及敲降稳定转染细胞系建立成功。2.细胞生长实验表明,高表达基因Y能够促进口腔鳞癌细胞生长速度,敲降基因Y能够抑制口腔鳞癌细胞的生长速度。3.克隆形成实验表明,高表达基因Y能够促进口腔鳞癌细胞增殖能力,敲降基因Y能够抑制口腔鳞癌细胞的增殖能力。***实验表明,高表达基因Y能够促进口腔鳞癌细胞迁移、侵袭能力,敲降基因Y能够抑制口腔鳞癌细胞的迁移、侵袭能力。5.流式细胞术结果表明,高表达基因Y能够促进口腔鳞癌细胞有丝分裂活性,影响细胞周期分布;敲降基因Y能够抑制口腔鳞癌细胞有丝分裂活性,影响细胞周期分布。6.裸鼠皮下成瘤实验结果表明,敲降基因Y抑制裸鼠皮下成瘤。结论:1.高表达基因Y影响口腔鳞癌细胞的细胞周期分布情况、增强细胞增殖能力、加快细胞生长速度、促进细胞迁移及侵袭能力。2.敲降基因Y影响口腔鳞癌细胞的细胞周期分布情况、减弱细胞增殖能力、减缓细胞生长速度、抑制细胞迁移及侵袭能力。第二部分基因Y对基因U不同剪切体表达的调控及基因U不同剪切体稳转细胞系的构建目的:通过在口腔鳞癌细胞中实现基因U不同剪切体表达改变,研究基因Y是否调控基因U的不同剪切体表达,以此探究基因Y是否通过调控基因U不同剪切体表达参与肿瘤发生。方法:1.基因U不同剪切体的慢病毒颗粒转染口腔鳞癌细胞,经嘌呤霉素筛选后建立稳转细胞系。2.用qPCR所得产物进行琼脂糖凝胶电泳实验及DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳即DNA-PAGE实验,在紫外灯光观察下找到目的条带,并将其切取下来进行DNA纯化,将纯化回收所得的DNA进行测序、验证。结果:***聚丙烯酰胺凝胶电泳(DNA-PAGE)实验结果表明,基因Y对基因U不同剪切体的表达具有调控作用。2.琼脂糖凝胶电泳实验结果表明,基因U不同剪切体U(15+)、U(15-)及NC对照在scc-25细胞中稳转细胞系建立成功。结论:1.基因Y对基因U不同剪切体的表达具有调控作用,高表达基因Y后,U(15+)表达含量增加,U(15-)表达含量减少;敲降基因Y后,U(15+)表达含量减少,U(15-)表达含量增加。2.基因U不同剪切体稳转细胞系建立成功。

关键词： 三阴性乳腺癌   EVI-1   CRT   miR-1   EMT  

摘要： 目的:乳腺癌是严重威胁全球女性健康的常见恶性肿瘤之一,世界范围内每年大约有167万新发乳腺癌患者,预计到2030年,全球大约有2200万乳腺癌患者。随着治疗手段不断发展进步,乳腺癌患者的预后已有了显著的改善,但仍有30%-40%的患者最终复发转移直至死亡。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)因其恶性程度高、侵袭性强、且无法从内分泌治疗及抗HER-2靶向治疗中获益,治疗手段有限,预后差,已成为乳腺癌治疗领域的一个难题。因此,当务之急是发现新的有效的治疗三阴性乳腺癌的靶点来改善三阴性乳腺癌患者的预后。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织中存在的一部分特殊的肿瘤细胞,这些细胞通过某些机制不断自我更新,分裂增殖,促进肿瘤的复发和转移。2003年,Al-Hajj等首次在乳腺癌中分离鉴定出乳腺癌干细胞。相较于其他类型的乳腺癌,三阴性乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞的占比更高。因此,针对肿瘤干细胞进行靶向治疗可能是未来乳腺肿瘤特别是三阴性乳腺癌治疗最有效的方法之一。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类小分子非编码RNA,主要通过与靶基因的3’UTR端的完全或不完全配对结合,降解靶基因的mRNA水平或抑制其翻译,从而对生物体的发育、分化、增殖、凋亡和免疫调控等活动进行调节。miR-1作为一种肿瘤抑制性因子已经被学术界广泛认可。既往研究发现,miR-1无论是体内实验还是体外实验均可以显著抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖能力。而且,在乳腺癌干细胞的研究中发现有13种miRs的表达是下降的,其中之一便是miR-1。因此,对miR-1的研究可以作为靶向治疗乳腺癌干细胞的一个切入点。本研究旨在观察三阴性乳腺癌组织与癌旁非瘤组织中miR-1的表达情况,探究miR-1对乳腺癌干细胞生物学行为的影响及作用机制,为三阴性乳腺癌的治疗提供新的理论基础。研究方法:1、提取三阴性乳腺癌FFPE组织标本的总RNA,通过实时荧光定量PCR检测miR-1的表达水平。2、采用流式细胞仪分选出乳腺癌干细胞。3、采用Lipofectamine 2000将miR-1 agomir、NC agomir以及亲病毒整合位点1(ecotropic virus integration site-1,EVI-1)过表达载体转染到乳腺癌干细胞。采用微球体形成实验测定乳腺癌细胞自我更新能力。采用CCK-8法检测增殖能力。采用western blotting实验检测凋亡通路相关因子和上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)通路相关因子的蛋白表达变化。4、采用双荧光素酶实验鉴定靶基因。5、构建裸鼠移植瘤模型评估miR-1的表达变化对乳腺癌干细胞成瘤能力的影响。6、Western blotting和免疫组织化学检测移植瘤内EVI-1及钙网蛋白(calreticulin,CRT)的变化。7、构建钙网蛋白不同结构域的表达载体并转染。8、采用微球体形成实验测定钙网蛋白各结构域对肿瘤干细胞自我更新能力的影响。采用流式凋亡分析钙网蛋白各结构域对肿瘤干细胞凋亡能力的影响。采用western blotting实验检测钙网蛋白各结构域对肿瘤干细胞EMT过程相关因子表达的影响。结果:1、通过对三阴性乳腺癌FFPE组织标本的分析,发现miR-1在三阴性乳腺癌中低表达。2、流式细胞术成功分选出乳腺癌干细胞。3、miR-1可以负向调控钙网蛋白的表达水平。4、过表达的miR-1可以抑制乳腺癌干细胞微球体形成及增殖能力,促进凋亡能力,抑制EMT过程的能力。同时过表达的EVI-1可以拮抗miR-1的这种抑瘤能力。5、双荧光素酶实验证实EVI-1是miR-1的靶基因,且miR-1可以负向调控EVI-1的表达。6、生物信息学方法得出钙网蛋白是EVI-1的靶基因,且EVI-1可以正向调控钙网蛋白的表达。7、过表达的miR-1可以抑制裸鼠移植瘤生长,且裸鼠移植瘤内EVI-1与钙网蛋白表达被miR-1显著抑制。8、钙网蛋白N端结构域促进乳腺癌干细胞自我更新的能力要显著强于P端结构域和C端结构域。9、钙网蛋白N端结构域抑制乳腺癌干细胞凋亡的能力要显著强于P端结构域和C端结构域。10、钙网蛋白P端结构域和C端结构域可能具有一定的抑制肿瘤干细胞EMT的能力,而这种能力可以被N端结构域所拮抗。结论:1、miR-1在三阴性乳腺癌组织中低表达。2、miR-1可以抑制乳腺癌干细胞的增殖和EMT的能力,并促进其凋亡能力,EVI-1可以拮抗miR-1的抑癌能力。3、miR-1可能通过直接结合并下调EVI-1进而间接抑制CRT表达,影响乳腺癌干细胞的生物学功能。4、过表达的miR-1可以抑制乳腺癌干细胞裸鼠移植瘤的生长。5、miR-

关键词： 钇稳定四方相氧化锆   表面修饰   SDSSD肽   成骨细胞   细胞增殖   早期黏附   组织矿化  

摘要： 目的：旨在研究钇稳定四方相氧化锆（Yttria-tetragonal zirconia polycrystals，Y-TZP）经SDSSD（Ser-Asp-Ser-Ser-Asp）肽修饰后对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）黏附、增殖、矿化的影响。　　方法：将Y-TZP片分为三组：抛光组（Y-TZP）、热碱处理组（Y-TZP-OH），SDSSD肽修饰组（Y-TZP-SDSSD）。通过扫描电镜（SEM）、接触角测定仪、X射线光电子能谱仪（XPS）等方法对各组样品的表面形貌、润湿性、元素组成进行表征。在各样品中加入FITC-SDSSD肽进行物理吸附或化学接枝，并于超声振荡器中震荡2小时，通过荧光显微镜检查震荡前后样品表面荧光强度，进而评价SDSSD肽与样品间的结合强度。将小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1接种于各组样品表面，培养1、3、5天后进行细胞增殖实验（MTT实验），使用酶标仪在490nm波长下检测吸光度值（OD值），检测细胞的增殖水平。在各组样品表面接种MC3T3-E1细胞，培养30、120分钟后对MC3T3-E1细胞的细胞核进行染色，通过镜下拍照、计算细胞核数目的方法来检测MC3T3-E1细胞于各组样品表面的早期黏附数量。将MC3T3-E1细胞在各组样品表面培养2天后，通过免疫荧光染色观察细胞形貌和细胞骨架。将MC3T3-E1细胞接种在各组样品表面进行成骨诱导14天后，通过体视显微镜观察氧化锆样品表面的矿化结节颜色、数量和大小，并进一步使用酶标仪在540nm波长下检测OD值，以评估成骨细胞的矿化水平。　　结果：SEM结果显示，各组样品电镜下形貌相似，可见微米级别不规则突起及沟纹结构。Y-TZP-SDSSD组样本水接触角值（61.60±5.20°）明显（P＜0.05）低于Y-TZP组（78.15±1.78°）和Y-TZP-OH组（69.85±1.85°）。XPS分析结果显示，SDSSD肽被成功接枝于氧化锆样品表面。进一步免疫荧光检测表明，SDSSD肽与氧化锆间化学键结合强度较高，经过2小时超声震荡后样品表面仍有SDSSD存在。MTT实验结果表明，第1、3天时各组样品表面的MC3T3-E1细胞均可实现明显增殖，组间无统计学差异存在，但第5天时Y-TZP-OH组细胞活性明显低于Y-TZP组（P＜0.05）;第5天时，Y-TZP-SDSSD组细胞活性也低于Y-TZP组，但差异无统计学意义。细胞早期黏附能力实验结果表明，Y-TZP-SDSSD组表面细胞核的数量明显高于Y-TZP和Y-TZP-OH组（P＜0.05）。免疫荧光染色观察细胞形貌可见，MC3T3-E1细胞在Y-TZP-SDSSD表面铺展面积最大，肌动蛋白丝明显，细胞与细胞间的接触较多。另外，体视显微镜观察表面，Y-TZP-SDSSD组样本表面的茜素红染色颜色最深、钙结节最多;酶标仪定量检测结果显示，Y-TZP-SDSSD组样品表面成骨细胞产生的矿化基质明显高于其它两组（P＜0.05）。　　结论：利用热碱反应和硅烷偶联剂对Y-TZP进行表面改性，进一步通过接枝反应成功地把SDSSD肽修饰于Y-TZP表面。体外细胞实验证实，Y-TZP表面经SDSSD肽修饰后，其表面润湿性更好，可显著地促进MC3T3-E1细胞早期黏附、铺展，且可一定程度地促进细胞矿化。

关键词： Co-SLD   舌鳞癌细胞   抗肿瘤活性   线粒体功能障碍   斑马鱼胚胎毒性  

摘要： 研究目的:研究了新型化合物含羰基钴的舒林酸衍生物对舌鳞癌细胞生物学行为的影响,并探讨其潜在机制。进一步为临床上口腔舌鳞癌的预防和治疗提供新思路和可能性。实验方法:1)体内动物实验:配置不同浓度化合物Co-SLD溶液(0,DMSO,5,10,20umol/L)分别用于处理受精后4h(4hpf)的正常斑马鱼胚胎,培育至144hpf(每24h更换培养溶液),在不同时间点记录斑马鱼的孵化率、死亡率、畸形率、心率及幼鱼的游泳距离,使用吖啶橙(AO)染色法对48hpf的斑马幼鱼体内凋亡进行检测。2)体外细胞实验:采用梯度浓度Co-SLD(0,DMSO,5,10,20umol/L)处理口腔舌鳞癌细胞CAL27,通过COX-2Elisa试剂盒检测Co-SLD作用CAL27细胞中COX-2的含量;采用生长曲线、克隆形成实验和Ki67的表达检测Co-SLD作用对CAL27细胞增殖影响;采用划痕实验检测Co-SLD对CAL27细胞迁移能力的影响;采用流式细胞术检测Co-SLD对CAL27细胞凋亡和周期的影响;并进行相关机制的探讨。结果:1)Co-SLD安全性评估:斑马鱼胚胎早期发育期间,Co-SLD在低浓度(5和10μM)时没有明显的毒性,而浓度为20uM时对斑马鱼具有显著毒性。在24hpf测定的胚胎死亡率随着Co-SLD浓度的增加而上升,浓度在20μM时胚胎死亡率大约为9.8%;在48hpf测定胚胎孵化率,Co-SLD浓度为20uM时,孵化率降低至68.3%;72hpf畸形率的增加也证明了高浓度(20μM)对斑马鱼显著的毒性。高浓度(20μM)的Co-SLD还引发心肌细胞凋亡和心率降低,并抑制幼鱼的运动行为。2)Co-SLD有效性评估:COX-2在CAL27细胞中高表达,Co-SLD作用24h后,浓度为10μM和20μM的Co-SLD作用于舌鳞癌细胞中COX-2表达明显下降,并抑制细胞增殖(与对照组相比减少39.8%),同时细胞的迁移能力也显著降低;细胞凋亡呈浓度依赖性,与对照组凋亡细胞0.63%相比,浓度为10μM或20μM时,凋亡细胞的比例高达6.96%或32.8%;细胞周期实验结果来看,阻滞主要发生在G1期,抑制DNA合成,导致细胞增殖受阻。随着化合物浓度增加,Co-SLD触发的线粒体功能障碍的特征表现为线粒体膜电位破坏,相比于对照组,10μM和20μM的Co-SLD处理组细胞的膜电位下降大约为26%和40%;同时高ROS的积累以及能量消耗,也呈浓度依赖性,并杀伤CAL27细胞。结论:Co-SLD对舌鳞癌细胞存在很好的抗癌活性,且筛选出最佳浓度为10uM,不仅避免胚胎发育毒性,还通过破坏线粒体功能来增强对癌细胞的杀伤。综上,Co-SLD在口腔舌鳞癌的治疗中具有潜在的可行性。

关键词： circTPCN   宫颈癌   Hela   生物学行为   miR-634   mTOR  

摘要： 目的:宫颈癌（Cervical cancer,CC）是世界范围内最常见的妇科肿瘤之一,高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus,HR-HPV）持续感染已被证实是其组织发生和进展的重要致病因素。近年来,随着HPV预防疫苗的广泛应用,CC的一级预防取得了一定的成效,其发病率和死亡率在许多发达国家得到了有效控制。然而,较高的HPV感染率和较低的CC发病率,这不仅使CC筛查和初级预防成为卫生经济学的沉重经济负担,也提示个体遗传和免疫状态差异等重要因素是CC进展的重要因素。因此,探索CC发生的分子机制,寻找潜在的治疗靶点是十分必要的。研究证实,人类基因组只有不到2%的核苷酸序列编码蛋白质,而其余的大多数基因被转录成非编码RNA。近年来,随着RNA测序技术和生物信息学的发展,环状RNA（Circular RNA,circRNA）成为继微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）之后的又一疾病研究的热点。与传统的线性结构的miRNA和lncRNA不同,circRNA是一个共价键闭合的连续环。circRNA由于缺少3’、5’端和多聚A尾,可以避免外切酶和RNase R的降解作用。与线性RNA相比,circRNA保守稳定,具有细胞特异性、组织特异性和阶段特异性。目前,对circRNA生物学功能的研究还处于探索阶段。研究者已经证实circRNA作为竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNAs,ceRNAs）,即miRNA海绵,调控靶基因的表达。它们也可以作为转录调节剂或蛋白结合RNA,甚至可以在特定情况下直接翻译成蛋白质。许多潜在的circRNA分子标记物及其通路作为miRNA海绵已经在许多肿瘤中被发现,包括食管鳞癌、胃癌、胰腺导管腺癌、肝癌、结肠直肠癌、早期肺腺癌、胶质瘤和卵巢癌。然而,circRNA的表达谱及circRNA在宫颈癌发生中的作用仍不清楚。课题组前期工作明确了circRNA在宫颈癌中的表达谱,并证实了circRNA circTPCN在宫颈癌组织中高表达。本项目在前期工作的基础上,研究circTPCN对宫颈癌细胞系Hela细胞生物学行为的影响及其作用机制。研究方法:利用生物信息学检索方法预测circTPCN的干扰序列,化学合成sicircTPCN（1）、sicircTPCN（2）、无关序列si_nc以及带有FAM荧光的无关序列si_ncFAM。利用转染试剂将上述序列瞬时转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。转染后,荧光性显微镜下观察转染si_ncFAM干扰序列的转染效率。转染48小时后,TRIzol法提取总RNA,检测RNA浓度及纯度后,逆转录为cDNA。逆转录PCR条件为:退火:25℃,5min;延伸:42℃,60min;70℃,15min;4℃保存。用circTPCN的特异引物及SYBR Green I荧光染料进行定量PCR检测,所用内参为18S。用miR-634、miR-195-5p、miR-455-3p的特异引物及SYBR Green I荧光染料进行定量PCR检测,所用内参为U6。荧光定量PCR反应条件为:95℃5 min;95℃15s;60℃60 s,共45个循环。CircRNA相对定量采用2-ΔΔCt法。2-ΔΔCt=2-（ΔCt siRNA-ΔCt si_nc）,ΔCt siRNA=siRNA组Ct值的均值-对应内参18S或U6的Ct值的均值,ΔCt si_nc=si_nc组Ct值的均值-对应内参18S或U6的Ct值的均值,并将si_nc组的相对表达量定为1,计算环状RNA的表达差异;转染后24小时,收取细胞,用细胞计数板计数转染干扰序列后的细胞数,进行增殖能力检测实验Hela细胞的增殖情况;转染后24小时,向转染体系中加入MTS试剂,孵育后利用酶标仪检测Hela细胞的增殖能力变化;转染后48小时,收集细胞,用Annexin V/FITC和PI试剂对各组细胞进行染色,孵育后,用流式细胞仪检测各组Hela细胞的凋亡情况。转染24小时后,进行细胞划痕实验。对孔板内转染后Hela细胞进行多条划痕并去除上清,用PBS清洗三遍,加入无血清培养基培养,在不同时间点对划痕变化进行观察;转染24小时后,收集细胞接种至Transwell小室内,上室为无血清培养体系,下室为高血清培养体系,培养24小时后,镜下计数各组穿膜细胞数,检测细胞的侵袭能力变化。结果:瞬时转染转染效率为27.5pmol组:87.5%;55pmol组:91.3%;110pmol组:93.5%。干扰序列物质的量确定为12孔板中55pmol/孔。MTS检测结果与细胞计数结果显示sicircTPCN（1）组Hela细胞的生长能力低于si_n

关键词： 膀胱癌   STK32C   TCGA数据库   免疫组化   细胞生物学功能   mTOR信号通路  

摘要： 目的:膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤,发病率仅次于前列腺癌。虽然膀胱癌的诊治方法在不断改善,但是高复发及进展率仍是影响临床膀胱癌治疗的重要障碍。近些年,多种生物分子被研究证实在膀胱癌的进展中起作用并与患者的预后相关。但是,目前这些分子作为生物靶点的治疗效果及生物标志物的预测作用并不理想。我们的前期实验发现,一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,STK32C的基因在TCGA数据库膀胱癌组织中呈现高表达,并猜测其可能在膀胱癌中起一定的作用。因此,本实验重点探讨了:STK32C蛋白在膀胱癌患者癌组织及癌旁的表达情况。通过体外细胞实验,探讨了STK32C对膀胱癌T24和5637细胞增殖,凋亡,侵袭和转移能力的影响。进一步,初步探究了STK32C在膀胱癌中发挥作用的可能的分子通路。方法:1.首先,收集了TCGA数据库中414例膀胱癌患者的m RNA表达数据及患者的临床信息,通过对数据进行整合分析,对STK32C基因在膀胱癌组织及癌旁的表达量进行比较。2.从临床获得膀胱癌患者术后膀胱癌及癌旁组织16例,通过免疫组化方法对组织样本的STK32C蛋白的表达量进行评定。比较STK32C在患者癌组织及癌旁中表达的差异。3.选用人膀胱癌细胞株T24和5637细胞,慢病毒载体转染,构建STK32C稳定敲低的细胞系,空载体转染作为阴性对照。用q RT-PCR和western blot实验方法从基因转录及翻译水平分别检测STK32C的敲低效率。通过细胞MTT实验、平板克隆实验、划痕实验和Transwell实验等方法,分析STK32C的敲低对膀胱癌细胞增殖、集落形成、迁移及侵袭能力的影响。4.通过String蛋白相互作用在线数据库,寻找与STK32C蛋白可能存在相互关联的蛋白分子。使用western blot方法,检测敲低STK32C蛋白,对膀胱癌细胞m TOR信号通路关键性分子m TOR及p-m TOR蛋白表达量的影响。结果:1.从TCGA数据库414例膀胱癌分析发现,STK32C m RNA在414例膀胱癌组织中表达明显高于癌旁组织(P<0.01)。19例癌及癌旁组织配对病例中发现,STK32C m RNA在癌组织中仍然高表达(P<0.01)。12例肿瘤样本中STK32C m RNA相对于癌旁组织高表达,1例下降,6例无明显变化。2.免疫组化分析临床膀胱癌病例发现,相对于癌旁正常组织,STK32C蛋白在膀胱癌组织中明显高表达(P<0.01)。且有随着肿瘤病理分期恶化,STK32C表达量增高的趋势。3.通过构建膀胱癌T24及5637细胞STK32C稳定敲低及阴性转染对照组,对比两组细胞体外生物学功能。结果发现,与对照组相比,敲低STK32C,膀胱癌细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移能力及T24细胞侵袭能力都受到明显的抑制(P<0.05)。4.通过String蛋白相互作用在线预测工具,我们发现了10个与STK32C蛋白可能相关的蛋白分子。分析这些蛋白,我们发现m TOR与STK32C的关联性最大。利用western blot方法,我们发现敲低STK32C,m TOR及p-m TOR蛋白的表达量明显下降。结论:STK32C在膀胱癌中存在高表达,并可能与患者肿瘤的病理分期和分级相关。在体外,敲低STK32C,可显著抑制膀胱癌细胞的增殖、集落形成能、迁移及侵袭能力。同时,敲低STK32C蛋白,可降低m TOR及p-m TOR蛋白的表达。因此,我们认为STK32C通过影响m TOR蛋白的表达及磷酸化,调节m TOR通路的活性,从而参与膀胱癌细胞的生物学功能。这可能为临床膀胱癌患者的靶向治疗或标记物的研究提供了新思路。

关键词： 软骨细胞   富血小板浓缩物   白介素-1β  

摘要： [目 的]通过体外培养兔髁突软骨细胞后构建炎症模型,探讨富血小板浓缩物对炎症微环境下兔髁突软骨细胞生物学特性的影响。[方 法]通过酶预消化组织块贴壁法体外培养兔原代髁突软骨细胞。将第三代兔髁突软骨细胞以10ng/ml IL-1β刺激24h后,使用含有10%富血小板浓缩物(PRP和Ⅰ-PRF)的培养液干预培养24h,通过CCK-8检测炎症微环境下富血小板浓缩物对兔髁突软骨细胞增殖的影响、通过RT-PCR检测炎症微环境下富血小板浓缩物对兔髁突软骨细胞生物学特性的影响。[结 果]CCK-8实验结果:(1)PRP和Ⅰ-PRF能明显促进兔髁突软骨细胞的增殖(P<0.05),但两者之间差异并无统计学意义(P>0.05);(2)PRP和Ⅰ-PRF能明显促进炎症微环境下兔髁突软骨细胞的增殖(P<0.05),但两者之间差异并无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR实验结果:(1)PRP和Ⅰ-PRF对兔髁突软骨细胞中IL-1β和MMP-13表达显著抑制(P<0.05),而Aggrecan、Col2al和SOX9表达显著增强(P<0.05),PRP和Ⅰ-PRF之间差异并无统计学意义(P>0.05);(2)PRP和Ⅰ-PRF对炎症微环境下兔髁突软骨细胞中IL-1β和MMP-13表达显著抑制(P<0.05),而 Aggrecan、Col2a1 和 SOX9 表达显著增强(P<0.05),PRP 和 Ⅰ-PRF之间差异并无统计学意义(P>0.05)。[结 论](1)使用IL-1β干预培养髁突软骨细胞能成功建立髁突软骨细胞的体外炎症模型;(2)PRP和Ⅰ-PRF对兔髁突软骨细胞增殖有促进作用;(3)PRP和Ⅰ-PRF对炎症微环境下兔髁突软骨细胞的破坏有抑制作用。(4)PRP与Ⅰ-PRF对软骨细胞增殖的促进作用或对炎症微环境的抑制作用没有明显差异。

关键词： 大肠癌   NDRG1   Caco2   体外  

摘要： [目 的]探讨NDRG1对大肠癌细胞系Caco2体外生物学特性的影响。[方 法]采用慢病毒感染的方法建立NDRG1稳定过表达Caco2细胞株,CRISPR/Cas9建立NDRG1敲除Caco2细胞株;通过qPCR法比较NDRG1过表达及敲除后Caco2细胞株NDRG1mRNA水平的表达,Western Blot 比较NDRG1过表达及敲除后Caco2细胞株NDRG1蛋白水平的表达;利用CCK8法测定细胞增殖速度,流式细胞术检测细胞周期、凋亡,24-Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力。[结 果]qPCR结果显示NDRG1过表达后,mRNA的相对表达水平(3.218±0.6756)与其空质粒组比较(1±0)上升了 3倍左右,且差异有统计学意义(P=0.0006),而NDRG1基因敲除后,mRNA的相对表达水平(0.07102 ±0.001901)与其空质粒组比较(1±0)出现明显的下降,且差异有统计学意义(P<0.0001);WB结果显示NDRG1过表达后,蛋白表达水平上升了 2倍左右(过表达组均数:1.92±0.06285;空质粒组均数:0.9279±0.03871),且差异有统计学意义(P<0.0001),NDRG1基因敲除后,蛋白表达水平明显下降(敲除组均数:0.3743±0.05146;空质粒组均数:1.108±0.05031),且差异有统计学意义(P<0.0001);CCK8结果显示NDRG1过表达后,除24h时间点外其余各时间点Caco2细胞的增殖速度均降低,差异具有统计学意义(P<0.01);而NDRG1基因敲除后,各时间点Caco2细胞的增殖速度均增快,差异具有统计学意义(P<0.01);利用流式细胞术检测细胞周期,结果显示NDRG1过表达后,G1期的细胞明显增多(P<0.0001),S和G2期细胞减少,表明细胞周期被阻滞在G1/S期;NDRG1基因敲除后,G1期细胞所占比例相比较无差异(P=0.8837),而S期细胞减少,G2期细胞明显增多(P<0.0001),说明增殖状态的细胞比例增高,细胞生长活跃;流式细胞术检测结果显示NDRG1过表达后Caco2细胞的早期凋亡率(P=0.0002)及总凋亡率(P=0.0004)均降低,晚期凋亡率没有差异(P=0.9296),而NDRG1基因敲除后,Caco2细胞的早期凋亡率(P=0.0013)及总凋亡率(P=0.0002)均升高,但晚期凋亡率无差异(P=0.3330),说明NDRG1对细胞的凋亡起到了抑制作用。24-Transwell法检测细胞的侵袭与迁移能力,发现NDRG1过表达后,在48h时间点,Caco2细胞的侵袭与迁移能力均减弱,而NDRG1基因敲除后,细胞的侵袭与迁移能力均增强。[结 论]***1抑制Caco2细胞增殖和细胞周期阻滞与G1/S期有关;***1可促进Caco2细胞的凋亡;***1可抑制Caco2细胞的侵袭和迁移。

关键词： 小分子化合物   转分化   山羊乳腺上皮细胞   生物学特性   转录组测序  

摘要： 乳腺上皮细胞具有很强的分泌功能,是研究乳腺生物反应器的重要靶细胞,是乳腺中唯一具有泌乳功能的细胞,可以用其来研究乳腺的生长、发育、泌乳过程中的细胞生物学和分子生物学的机制变化。由于目前获得的大多数乳腺上皮细胞会出现细胞活力低,传代效率低以及分泌功能低等问题,不利于后续进行乳腺生物反应器以及泌乳机制等相关研究,因此需要一种新的方法来获得具有传代效率高、泌乳功能强的乳腺上皮细胞。近年来转分化技术的发展为乳腺上皮细胞的获得提供了可能。因此本研究主要采用小分子化合物诱导的方法将山羊耳缘成纤维细胞(GEF)转分化为山羊乳腺上皮细胞(CiMEC)。通过对转分化山羊乳腺上皮细胞(CiMEC)与乳汁分离培养获得的乳腺上皮细胞(GMEC)进行形态学观察、特异性标志基因、特异性抗原表达的比较以及转录组测序分析基因表达水平的差异比较,初步确定了CiMEC具有与自然获得的乳腺上皮细胞(GMEC)类似的生物学特性,为乳腺上皮细胞发育分化等机制的研究奠定基础,也为乳腺上皮细胞获得以及乳腺生物反应器的制备开辟新的途径。 1小分子化合物诱导山羊乳腺上皮细胞(CiMEC)的获得以及生物学特性鉴定 本研究利用完全小分子化合物体系对山羊耳缘成纤维细胞(GEF)进行诱导,转分化获得了山羊的乳腺上皮细胞(CiMEC),同时我们从山羊乳汁中分离培养获得山羊的乳腺上皮细胞(GMEC)。本研究分别从细胞的形态变化、特异性抗原免疫荧光染色、饱和油红O染色、核型分析、生长曲线的测定以及相关基因表达的检测等对转分化获得的山羊乳腺上皮细胞(CiMEC)进行生物学特性的研究。免疫荧光染色结果表明CiMEC和GMEC都可以表达CK5、CK8、CK14、CK18、ER、Ep CAM、CD49F等乳腺上皮细胞的相关特异性抗原。油红O染色的结果显示CiMEC和GMEC均有大小不等被染上红色的脂滴弥散分布在细胞质内,表明该细胞具有分泌乳脂的功能。核型分析结果显示染色体数目均为60条,染色体核型数目正常率达到99%以上,表明转分化得到的CiMEC是具有正常核型的细胞。另外PCR检测结果显示,CiMEC和GMEC均表达乳腺上皮细胞的特异性标记基因KRT-18、CSN2、PRLR、B4GALT3、ACACA、Ep CAM、LTF等,同时定量PCR结果显示CiMEC的上述相关基因的表达量均显著高于对照组GMEC,其中PRLR和Ep CAM为极显著升高。 2转分化山羊乳腺上皮细胞(CiMEC)与乳腺上皮细胞(GMEC)的转录组测序分析 为了进一步比较CiMEC和GMEC的转录水平的差异,我们将CiMEC和GMEC进行转录组学的测序分析。结果显示转分化得到的山羊乳腺上皮细胞(CiMEC)与山羊乳腺上皮细胞(GMEC)相关性非常高(均大于0.97)。对转录组数据中乳腺特异基因进行分析,结果显示在CiMEC中CSN3、CSN2、LTF、ELF5等基因表达水平呈现上升的变化规律,在GMEC中检测不到CSN2、LTF表达。差异基因GO富集结果显示,与乳腺有关的GO富集只在乳腺导管末端芽生长富集显著,其它富集均不显著。对差异基因进行KEGG富集分析,结果显示差异基因富集共涉及311个信号通路,其中包括与乳腺发育和泌乳相关的信号通路PI3K-Akt信号通路、催乳素信号通路、雌激素信号等通路。上述结果证明了CiMEC与GMEC转录表达模式非常相似,属于同一类型的细胞,但是它们可能处于不同的发育阶段。目前的结果显示CiMEC类似于早期乳腺发育早期阶段的乳腺上皮细胞,而GMEC是处于乳腺发育晚期的乳腺上皮细胞(例如干乳期)。 综上所述,我们已经建立利用小分子化合物诱导转分化获得山羊乳腺上皮细胞(CiMEC)的技术体系,同时获得的CiMEC具有与乳腺上皮细胞(GMEC)非常类似的生物学特性,为体外乳腺上皮细胞命运决定、发育分化以及泌乳调控等研究奠定了坚实的理论基础。