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关键词： 宫颈癌   m6A修饰   METTL3   恶性表型  

摘要： 研究目的: 宫颈癌(cervical cancer,CC)是全球女性肿瘤死亡的主要原因之一。尽管目前通过早期筛查和疫苗接种使得宫颈癌成为最可预防的癌症之一,但复发和转移仍是局部晚期宫颈癌患者面临的重大难题。因此,寻找宫颈癌中更为可靠的诊断和预后的生物标志物迫在眉睫。M6A甲基化修饰被证实是最丰富、最常见的RNA内部修饰,与癌症进展密切相关。本研究旨在分析m6A修饰中关键的甲基转移酶样蛋白3(Methyltransferase Like3,METTL3)在宫颈癌中的差异表达及其与宫颈癌临床预后间的关系,探索METTL3对宫颈癌生物学功能的影响。 研究方法: 本研究首先利用公共数据库在线分析METTL3在宫颈癌中的差异表达及其与患者预后之间的相关性。免疫组织化学方法检测METTL3、VEGFA以及CD31在肿瘤组织中的表达。采用慢病毒转染技术构建稳定过表达METTL3的宫颈癌细胞株(OE-METTL3),通过小干扰RNA转染细胞对METTL3的表达水平进行了敲降。运用qPCR及Western blot技术对METTL3的过表达及敲降效率进行验证。利用CCK-8细胞增殖实验评估METTL3过表达和敲降对宫颈癌细胞增殖能力的影响。克隆形成实验观察METTL3过表达和敲降后集落形成数量变化。Transwell小室实验探究上调和下调METTL3表达后宫颈癌细胞迁移的改变。SRAMP在线网站对VEGFA RNA序列上的m6A结合位点进行了预测。qPCR检测METTL3表达水平增加或下降时VEGFA RNA水平相应的变化情况。体外基质胶2D成管实验观测到宫颈癌细胞在过表达和降低METTL3后,HUVEC细胞成管的能力。放线菌素D实验用以探究METTL3对VEGFA mRNA稳定性的影响。 研究结果: ***3在宫颈癌中高表达 (1)基于TIMER 2.0及GEPIA公共数据库分析发现,METTL3在包括宫颈癌在内的多数癌症中呈现高表达,且高表达METTL3的宫颈癌患者较低表达组无病生存期更短。 (2)qPCR及WB结果显示与正常宫颈组织相比,METTL3在宫颈癌组织标本中表达量增加,并在免疫组化的结果中得到了证实。 ***3对宫颈癌细胞恶性生物学功能的影响 (1)相较于对照组而言,在HeLa和SiHa中下调METTL3的表达后,细胞增殖能力减弱,细胞集落形成数量也相应减少。同时迁移细胞数量呈现下降的趋势。 (2)相反,在使用构建成功的OE稳转株进行功能表型实验时,CCK8和克隆形成实验结果均显示宫颈癌细胞增殖能力提高,细胞迁移能力受到明显的促进作用。 ***3促进宫颈癌进展的可能机制 (1)在线网站预测发现VEGFA序列上存在多个m6A结合位点,提示METTL3可能调节VEGFA的表达促进宫颈癌的发展。 (2)免疫组化显示VEGFA蛋白表达量在宫颈癌组织中升高。并且VEGFA与METTL3呈正相关性,VEGFA mRNA表达水平随METTL3的上调而增加,随METTL3的降低而下降。 (3)METTL3过表达时,观察到HUVEC细胞管腔形成数量增加。METTL3下调时,血管形成数量减少。但HUVEC细胞成管实验结果统计并无显著性差异。 (4)mRNA稳定性实验结果显示,过表达METTL3后延缓了 VEGFA mRNA的衰变。相反,敲降METTL3后,VEGFA mRNA半衰期随METTL3的降低而缩短。 结论: METTL3在宫颈癌中高表达,能够发挥促癌基因的作用正向调控宫颈癌细胞恶性生物学行为。过表达METTL3后,宫颈癌细胞增殖和迁移能力明显增强。并且在一定程度上影响了血管生成的数量。但本研究对于METTL3影响宫颈癌进展的机制探讨并不成熟,血管生成及稳定性实验的研究并未得到完全阐明。这为后续更深入的机制研究奠定了的基础,具有一定的指导意义。

关键词： 细胞生物学   课程思政   立德树人  

摘要： 近年来课程思政建设成为高校育人育才的重要一环，利用课程思政协同育人是高校落实立德树人根本任务的重要手段。细胞生物学课程是生命科学专业的专业必修课程，是一门兼顾基础生命理论知识学习和现实问题解决应用的课程，本文根据课程内容和特点，深入挖掘思想政治教育元素，探索课程思政教学路径，力图实现专业知识教育目标与课程思政教育目标的协同统一。

摘要： 随着信息技术的迅速发展，教学模式正在经历深刻变革。尤其是在医学细胞生物学这门复杂且实践性强的课程中，传统教学模式的局限性越来越明显。如何将线上与线下资源有效结合，为学生提供更灵活高效的学习方式，成为教学改革的重要议题。医学细胞生物学不仅是一门基础课程，还肩负着培养学生实践能力和创新思维的使命。有鉴于此，提出了一套创新性的混合式教学设计方案，通过整合线上线下资源，为学生打造沉浸式学习体验。希望通过文中论述，能为类似研究提供参考。细胞生物学是医学教育中不可或缺的基石，为学生理解生命现象和疾病机制提供了理论框架。

关键词： 外泌体   结肠癌细胞   正常结肠上皮细胞   细胞增殖   迁移和侵袭   细胞干性   SOX2   OCT4  

摘要： 目的: 通过提取、分离及纯化人结肠癌细胞株SW480及人正常结肠上皮细胞株NCM460不同细胞上清的外泌体,初步探讨不同细胞所分泌的外泌体形态及数量的差异。在体外实验中探讨SW480细胞株与NCM460细胞株来源的外泌体对SW480细胞株增殖、迁移、凋亡及细胞干性功能的影响,并在BALB/c裸鼠的体内实验中进一步证实外泌体对肿瘤细胞增殖功能的影响。 方法: 分离提取人结肠癌细胞株SW480及人正常结肠上皮细胞株NCM460上清培养液中的外泌体,通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、纳米颗粒追踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)和蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)对外泌体进行鉴定,BCA总蛋白检测法对两种细胞株来源外泌体蛋白进行定量分析。再构建人结肠癌SW480细胞源性外泌体和正常结肠上皮NCM460细胞源性外泌体分别与SW480细胞株共培养的体外实验模型,通过侵染实验、CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验、细胞凋亡实验、干细胞成球实验、逆转录PCR及Western Blot等实验检测NCM460细胞源性外泌体及SW480细胞源性外泌体对SW480细胞株增殖、迁移、凋亡的影响,并通过检测干性标志蛋白SOX2及OCT4相对表达量验证其对细胞干性的影响,最后通过构建裸鼠异位移植瘤动物模型在体内实验中进行验证。 (1)使用试剂盒提取法初步分离提取人结肠癌细胞株SW480及人正常结肠上皮细胞株NCM460上清培养液中的外泌体,在TEM下观察外泌体的超微结构,NTA检测外泌体粒径大小及分布范围,Western Blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD9、Calnexin及Alix的表达情况,BCA总蛋白检测法对人结肠癌细胞株SW480及人正常结肠上皮细胞株NCM460来源的外泌体蛋白进行定量分析。 (2)使用PKH26荧光染料分别标记SW480细胞源性外泌体与NCM460细胞源性外泌体,在相同培养条件下将两种外泌体加入到SW480细胞株培养基中,并通过荧光显微镜检测外泌体进入细胞的情况。 (3)将不同浓度梯度的SW480细胞源性外泌体和NCM460细胞源性外泌体分别添加到SW480细胞株的无外泌体培养液中,用酶标仪检测在450nm处的OD值,按CCK-8试剂盒说明书计算细胞增殖率,绘制两组细胞增殖曲线。 (4)通过细胞划痕实验与Transwell细胞侵袭实验分别检测经SW480细胞源性外泌体和NCM460细胞源性外泌体干预培养后SW480细胞株的迁移与侵袭能力。 (5)在相同培养条件下,分别将SW480细胞源性外泌体和NCM460细胞源性外泌体加入到处于对数生长期的SW480细胞株中共同孵育,通过Tunel法检测两组细胞的凋亡情况。 (6)取各组对数生长期的SW480细胞株分别经SW480细胞源性外泌体和NCM460细胞源性外泌体处理后用DMEM的干细胞培养基进行悬浮培养,于倒置显微镜下观察细胞生长情况和成球情况。 (7)在分别使用SW480细胞源性外泌体和NCM460细胞源性外泌体干预SW480细胞株后,通过Trizol提取总RNA并利用逆转录试剂盒得到c DNA模板,在逆转录PCR仪上进行PCR扩增循环,循环结束后做相应的溶解曲线,使用相对定量分析的方法来比较各孔SOX2和OCT4基因的m RNA表达水平。提取总蛋白后,在SDS-PAGE胶中上样蛋白进行电泳、转膜、封闭后加一抗、二抗,最后进行显影、定影及拍照,通过Western Blot法分析SOX2和OCT4干性蛋白的表达情况。 (8)使用无特异性病原体BALB/c裸鼠(6周龄)于SPF屏障环境中饲养,适应性喂养1周,待裸鼠适应环境后按体重大小平均分为两组,每组6只裸鼠。造模成功后分别通过尾静脉注射SW480细胞源性外泌体和NCM460细胞源性外泌体的方式处理造模并记录肿瘤重量体积。6周实验完成后用乙醚麻醉后股动脉放血对裸鼠进行处死,分离出裸鼠肿瘤组织分别进行病理染色、免疫组织化学ki-67检测、Tunel法检测细胞凋亡以及免疫组化检测分析SOX2和OCT4蛋白的表达情况。 结果: (1)TEM下观察到SW480细胞株与NCM460细胞株所分泌的外泌体均呈茶托形或类圆形囊状双层膜结构,NTA结果表明外泌体颗粒直径主要分布在50～200nm之间,WB实验结果表明SW480细胞源性外泌体与NCM460细胞源性外泌体的标志蛋白CD63、CD9及Alix蛋白均呈阳性表达,而Calnexin蛋白呈现阴性表达。BCA总蛋白检测法提取外泌体总蛋白后结果显示SW480细胞源性外泌体的总蛋白含量高于NCM460细胞源性外泌体。 (2)使用PKH26

关键词： 肺腺癌   ACSM5   预后   生物标志物   生物信息学  

摘要： 背景:肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)的最常见的亚型,约占NSCIC的50%。由于肺癌总体预后较差,寻找LUAD新的早期诊断指标或治疗靶点具有重要的临床意义。 近年来,脂肪酸代谢在肿瘤发生进展中的作用逐渐受到关注。其中,酰基辅酶A合成酶中链家族成员5(Acyl-Co A synthetase mediumchain family member 5,ACSM5)是脂肪酸活化重要的代谢酶,主要分布在肝脏、肾脏、肺等全身多种组织中。目前的研究发现ACSM5的表达与乳腺癌(Breast Invasive Carcinoma,BRCA)、肝细胞癌(Liver Hepatocellular Carcinoma,LIHC)、前列腺癌(Prostate Adenocarcinoma,PRAD)和甲状腺癌(Thyroid Carcinoma,THCA)的发生有关,但其在LUAD中的表达和功能尚待深入研究。 目的:本研究拟分析ACSM5在LUAD中表达,并探讨其基因表达与临床病理特征的相关性以及对肺腺癌细胞生物学特性的影响,为肺腺癌的治疗提供新的靶点以及新思路。 方法: 一、ACSM5在LUAD肿瘤组织中的表达及其临床意义 1.通过生物信息学,挖掘癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中包括肺腺癌在内的33种癌症的基因表达谱数据和临床资料,重点分析ACSM5基因在LUAD肿瘤组织和正常组织的差异表达水平及临床诊断意义。 2.通过GEPIA在线网站和人类蛋白质图谱数据库(Human Protein Graphics Database,HPA)验证ACSM5在LUAD癌组织和正常组织中的基因和蛋白中的表达水平。 3.临床病理特征相关性分析:分析ACSM5表达与LUAD患者临床病理特征的相关性,如患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分期、TNM分期等。 4.预后分析:使用R软件绘制Kaplan-Meier生存曲线,探究ACSM5基因表达水平与LUAD患者总生存期(Overall Survival,OS)和疾病特异生存期(Disease Specific Survival,DSS)的相关性;利用SPSS软件进行单因素和多因素Cox分析,观察LUAD患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤分期、TNM分期和目标基因ACSM5表达量与预后的关系。 5.功能分析:通过基因集富集(Gene set enrichment analysis,GSEA)分析在LUAD中与ACSM5相关通路,并通过CIBERSORT算法计算进一步确定ACSM5与22种肿瘤浸润免疫细胞之间的相关性。 二、ACSM5表达对肺腺癌细胞的生物学特性的影响 1.采用RT-qPCR技术检测ACSM5 mRNA在人正常肺支气管上皮细胞株(BES-2B)和3个LUAD细胞株中的表达水平。 2.构建过表达ACSM5的细胞株,采用RT-qPCR和Western blotting方法检测过表达ACSM5的LUAD细胞株的过表达效率。采用CCK8、平板克隆和划痕实验检测,过表达ACSM5的LUAD细胞株增殖、克隆形成和迁移能力的改变。 3.转录组测序,分析A549细胞过表达ACSM5前后基因表达差异。 结果: 一、ACSM5在LUAD中低表达,且低表达与患者不良预后相关 ***数据库分析结果表明,ACSM5基因表达量在大部分癌症组织中降低;其中,ACSM5在LUAD表达显著低于正常组织。 ***5的诊断曲线下面积为0.844,95%的置信区间(95%CI)为0.809-0.881,灵敏度0.6962,特异性0.9137,可以作为肺癌临床诊断标记物。 ***5表达水平高低与患者年龄(P=0.011)、是否吸烟(P=0.001)及T分期(P=0.016)显著相关,差异有统计学意义;而与患者性别、肿瘤分期、N分期和M分期均无显著的统计学差异(P>0.05)。 ***5高表达组的患者OS和DSS均比低表达组长,差异有统计学意义(P<0.01);单因素Cox回归分析结果显示病理分期、T分期、N分期和ACSM5表达水平都能影响LUAD患者OS(P值均<0.05);多因素Cox回归分析结果显示ACSM5表达水平(HR=0.773,P<0.05)和病理分期是影响LUAD患者OS的独立预后指标。 ***分析结果显示,ACSM5高表达能够激活异体排斥、IL6/JAK/STAT3信号通路、γ-干扰素反应、补体和炎症反应通路;抑制MYC靶标V2、MYC靶标V1、糖酵解、E2F靶点和G2M检查点