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关键词： 结直肠癌   YTHDC1蛋白   蛋白表达   细胞生物学  

摘要： 目的：　　结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率及死亡率逐年上升，而且逐渐年轻化。由于结肠镜、大便隐血试验及肿瘤标志物筛查等广泛开展，CRC的早期诊断率已经取得一定的改善，但 CRC临床症状出现晚，有些 CRC确诊时已处于中晚期，导致 CRC疗效不佳，因此探索 CRC诊断及治疗的靶点，改善患者预后仍是当前研究热点。研究发现 N6-甲基腺苷（m6A）甲基化修饰是常见的 RNA 修饰方式之一，参与多种肿瘤的发生发展。YTHDC1（YTH domain-containing protein 1）是一种m6A结合蛋白，通过与m6A修饰的RNA结合从而调控基因表达，在 CRC 中的表达及作用尚未完全明确。本课题旨在研究 YTHDC1在 CRC 中的表达，及其对 CRC 细胞生物学行为的影响及作用机制，为探索新的CRC的诊疗靶点提供一定的实验依据。　　方法：　　1.用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）法检测 YTHDC1在 30例CRC 组织及 13 例正常大肠黏膜组织（Normal）中的表达情况，收集 CRC 患者的临床、病理资料，分析 YTHDC1 的表达与各项临床、病理指标之间的相关性。　　2.构建 YTHDC1 敲低慢病毒（sh-YTHDC1），将 sh-YTHDC1及空载体慢病毒（sh-NC，阴性对照组）分别感染 HCT-116 细胞，用嘌呤霉素多次筛选得到成功感染的细胞， qRT-PCR 法检测YTHDC1的敲低效果。　　3.分别用 CCK-8 法、克隆形成实验检测 HCT-116 细胞的增殖情况，流式细胞术检测HCT-116细胞凋亡，划痕实验检测HCT-116细胞迁移情况。　　4.用Western blot 检测 MAPK通路中磷酸化（p）-p38 MAPK、 p38 MAPK蛋白表达情况。　　结果：　　***1 在 CRC 组织中的表达及与 CRC 患者各项临床、病理指标的相关性　　qRT-PCR结果显示，在 CRC组中 YTHDC1 mRNA的表达明显低于Normal组，差异具有统计学意义（P＜0.05）;YTHDC1的低表达与患者年龄、性别、病理分期、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、是否有远处转移等均无明显相关性（P＞0.05）。　　***1对CRC细胞增殖、凋亡、迁移的影响　　与 sh-NC 组相比，sh-YTHDC1 组 HCT-116 细胞的 YTHDC1 mRNA 表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）;细胞增殖和迁移能力增强，凋亡率下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。　　3. YTHDC1对 p38 MAPK信号通路的影响　　与 sh-NC 组相比，sh-YTHDC1 组 HCT-116 细胞 p-p38 MAPK蛋白表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。　　结论：　　***1 在 CRC 组织中表达下调， YTHDC1 的低表达与CRC患者临床病理指标无明显相关性。　　2.敲低 YTHDC1 可促进 CRC 细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡。　　3.敲低YTHDC1可抑制p38 MAPK信号通路。

关键词： 妊娠早期   缝隙连接蛋白43   生理性低氧   滋养细胞   生物学功能   乳酸代谢   糖酵解  

摘要： 目的:　　母胎界面是子宫和胎盘结构协同作用促进胎儿发育的动态部位，滋养细胞是其微环境中的主要细胞类型，滋养细胞功能的任何失调都可能导致妊娠丢失和/或不良妊娠结局。在整个妊娠期间胎盘微环境中的氧水平是动态变化的，而在妊娠早期存在生理性低氧，胎盘组织氧分压不超过20 mmHg（相当于氧浓度2％-3％）。在宫内生理性低氧期间，滋养细胞通过缺氧诱导的一系列适应性反应，维持及调控其生物学行为，包括细胞的自我更新、增殖和分化，以及细胞能量代谢特征的改变，因此需要相邻滋养细胞间建立准确且高效的、能够允许生物信息交换的通讯连接，以保证细胞整体代谢功能和增殖分化协调进行。细胞缝隙连接通讯（Gap junctional intercellular communication,GJIC）是细胞间最重要的通讯方式之一，而缝隙连接蛋白43（Connexin 43,Cx43）是缝隙连接蛋白家族中最普遍、分布最广泛的成员，许多文献表明Cx43参与各种缺血/缺氧疾病的病理生理过程，但关于妊娠早期滋养细胞中Cx43研究并不多。那么Cx43是否参与了妊娠早期生理性低氧（2％O2）环境中滋养细胞的适应性反应？低氧（2％O2）条件下Cx43对滋养细胞的功能有何影响呢？为解决以上科学问题，本研究重点探讨了在生理性低氧条件下Cx43对滋养细胞生物学功能的影响及其可能的机制，为妊娠并发症的防治提供新的靶点和思路。　　方法:　　1.利用三气细胞培养箱模拟妊娠早期生理性低氧（2％O2）微环境，通过CCK-8实验和平板克隆形成实验，检测低氧条件下滋养细胞增殖能力的变化，通过Transwell实验检测低氧条件下滋养细胞迁移、侵袭能力，通过CalceinAM/DiI双染实验检测低氧条件下滋养细胞缝隙连接通讯功能，通过溴化乙锭摄取实验检测低氧条件下滋养细胞半通道开放情况。　　2.收集正常早期妊娠者绒毛和蜕膜组织，通过实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR）和免疫印迹实验（Western Blotting）检测母胎界面 Cx43的表达情况。同时对滋养细胞系进行RT-qPCR和Western Blotting实验检测Cx43的表达水平。　　3.收集低氧条件下滋养细胞mRNA及蛋白，通过RT-qPCR和Western Blotting实验检测滋养细胞中Cx43的水平变化，并通过免疫荧光技术检测滋养细胞内Cx43定位情况。　　4.通过瞬时转染小干扰RNA（short interfering RNA,siRNA）方式构建Cx43敲减细胞模型。　　5.通过CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验评估低氧条件下Cx43对滋养细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术检测低氧条件下Cx43对滋养细胞周期进程及细胞凋亡的影响;通过Calcein AM/DiI双染实验检测低氧条件下Cx43敲减组滋养细胞缝隙连接通讯功能的变化。　　6.收集低氧条件下滋养细胞对照组及Cx43敲减组细胞和培养上清，检测细胞内外乳酸水平。同时收集低氧条件下滋养细胞对照组及Cx43敲减组细胞蛋白，通过Western Blotting实验检测糖酵解通路关键分子表达情况。　　7.低氧条件下乳酸脱氢酶A（Lactate dehydrogenase A,LDHA）抑制剂草氨酸钠处理滋养细胞，减少细胞乳酸生成，收集滋养细胞mRNA及蛋白，通过RT-qPCR和Western Blotting实验检测滋养细胞中Cx43的水平变化，验证Cx43与乳酸之间存在反馈调节。　　8.通过Western Blotting实验检测低氧条件下Cx43调节滋养细胞功能可能的信号通路。　　结果:　　1.生理性低氧（2％O2）条件下，滋养细胞增殖能力上调，迁移、侵袭能力提高，细胞间缝隙连接通讯增强，半通道无异常开放。　　2.正常妊娠早期者绒毛和蜕膜组织中Cx43均有表达。三种滋养细胞系HTR-8/SVneo、JAR、JEG-3 均可表达 Cx43。　　3.低氧促进滋养细胞Cx43表达上调，Cx43细胞内定位呈现更强细胞极性排列,在细胞边缘相互连接处更密集。　　4.低氧条件下，CCK-8、克隆形成、EdU实验结果显示，Cx43减少抑制滋养细胞增殖;流式结果表明，Cx43减少使细胞周期进程受阻，抑制滋养细胞由G0/G1期进入S期，并促进滋养细胞凋亡，同时Western Blotting实验表明Cx43减少使促细胞周期进程分子CDK2和抗凋亡分子BCL2下调，而抑制细胞周期进程分子P27和促凋亡分子BAX上调;Calcein AM/DiI双染实验表明，Cx43减少会减弱滋养细胞间耦联。　　5.低氧条件下，乳酸水平检测表明，Cx43减少抑制滋养细胞乳酸生成与分泌。同时，Western Blotting实验表明Cx43减少可以抑

关键词： 新医科   科学素养   医学细胞生物学   医学生  

摘要： “新医科”背景下医学生的培养,医学生不仅需要掌握基本专业知识和临床技能,而且需要具备一定的学术思维、创新能力和科研能力。医学细胞生物学作为一门初级科研课程,在培养医学生的科学素养中起着举足轻重的作用。本文旨在探讨如何改进医学细胞生物学课堂教学方式、教学内容,着力从科研意识、科研能力和科研精神三大要素提升医学生科研素养;以期培养适应当今医学发展即具有扎实的专业知识又具有较高科研素养的高素质医学专业人才,为党育人,为国育才。

关键词： A-PRF   生长因子   炎症因子   高糖   骨形成  

摘要： 目的:比较糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者与健康人改良型富血小板纤维蛋白(Advanced platelet-rich fibrin,A-PRF)中成骨关键生长因子与炎症因子的释放量差异,验证DM体内骨稳态环境的改变,并观察A-PRF对高糖环境下hFOB1.19成骨细胞生物学性能的影响,为临床应用A-PRF提供相应的实验依据。 方法: 实验一DM患者与健康人A-PRF中成骨关键生长因子和炎症因子释放量的比较研究 按纳排标准选取研究对象,抽取静脉血,离心制备A-PRF,于15min,60min,8hrs,1d,3d,10d,14d,21d时收集A-PRF析出液,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)双抗体夹心法检测PDGF-BB、VEGF、TGF-β、EGF、TNF-α和IL-6共6种因子的释放量并分析其释放规律。 实验二A-PRF对高糖环境下hFOB1.19成骨细胞生物学性能的影响 (1)通过制备A-PRFe,以浓度为0.25%、0.5%、1.25%、2.5%的A-PRFe与hFOB1.19成骨细胞共培养1、3、5、7d后CCK-8法检测细胞增殖情况,筛选促细胞增殖的最佳A-PRFe浓度。(2)筛选出最佳浓度为1.25%的A-PRFe加入实验组(正常糖+1.25%健康人A-PRFe组、高糖+1.25%DM患者A-PRFe组、高糖+1.25%健康人A-PRFe组),对照组使用完全培养基,在第7d时,进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色,第21d时,进行茜素红染色检测成骨矿化能力。(3)在第7、14d时,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)测定各组hFOB1.19成骨细胞中Runt相关转录因子-2(Runt-related transcription factor-2,Runx2)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)基因的表达水平。 结果: 实验一:ELISA结果显示(1)DM组A-PRF中PDGF-BB累积释放量始终低于健康人且从第1d开始二者间释放量差异具有统计学意义(P<0.001);(2)DM组A-PRF中VEGF累积释放量在第1d、3d、10d、14d四个时间点里始终低于健康人且差异具有统计学意义(P<0.05);(3)DM组A-PRF中EGF累积释放量在8个时间点里与健康人相比差异无统计学意义(P>0.05);(4)DM组A-PRF中TGF-β累积释放量从第8h开始始终低于健康人,且在第14d、21d时二者间释放量差异具有统计学意义(P<0.001);(5)DM组A-PRF中TNF-α累积释放量从第8h均高于健康人且差异有统计学意义(P<0.01);(6)DM组A-PRF中IL-6累积释放量在第10d之前均高于健康人,且在第15min、60min、1d时两者间差异有统计学意义(P<0.05)。 实验二:(1)使用不同浓度A-PRFe与hFOB1.19成骨细胞共培养1、3、5、7d后检测细胞增殖情况,CCK-8结果显示,随着时间的延长不同浓度的A-PRFe对hFOB1.19成骨细胞增殖作用更明显,而当浓度为1.25%时,促增殖作用最明显。(2)ALP及茜素红染色结果发现,A-PRF能有效促进高糖环境下成骨细胞的分化及矿化能力。(3)RT-q PCR检测结果发现,(1)第7d时,与正常糖组(17.5m M糖浓度)相比,正常糖+1.25%健康人A-PRFe组Runx2、OCN的基因表达升高(P<0.05),高糖组Runx2、OPN、OCN的基因表达均降低(P<0.05、P<0.01);与高糖组相比,高糖+1.25%DM患者A-PRFe组Runx2、OPN的基因表达均升高(P<0.05、P<0.001),高糖+1.25%健康人A-PRFe组Runx2、OPN、OCN的基因表达均升高(P<0.001);高糖+1.25%DM患者A-PRFe组Runx2、OCN的基因表达均低于高糖+1.25%健康人A-PRFe组(P<0.001)。(2)第14d时,与正常糖组相比,正常糖+1.25%健康人A-PRFe组OCN的基因表达升高(P<0.05),高糖组Runx2、OPN、OCN的基因表达均降低(P<0.01、P<0.001);与高糖组相比,高糖+1.25%DM患者A-PRFe组OPN、OCN的基因表达均升高(P<0.05、P<0.01),高糖+1.25%健康人A-PRFe组Runx2、OPN、OCN的基因表达均升高(P<0.05、P<0.001);高糖+1.25%DM患者A-PRFe组OPN、OCN的基因表达均低于高糖+1.25%健康人A-PRFe组

关键词： 成骨细胞   外泌体   前列腺癌   miR-223   APC  

摘要： 研究背景与目的: 90%以上的前列腺癌初发远处转移部位为骨,前列腺癌骨转移具体机制不明,在接受一段时间的姑息性治疗如内分泌治疗、化疗、放疗等传统方式的治疗后均会发生进展。因此前列腺癌骨转移是目前亟待解决的临床难题。近年来,外泌体介导的细胞间通讯引起了关注,在肿瘤转移及耐药领域,外泌体已经被证实发挥了确切的作用。本研究旨在揭示前列腺癌骨转移发生和进展的过程中,转移灶局部微环境中成骨细胞分泌的外泌体对前列腺癌细胞生物学特性的影响,并初步探索了其中涉及的机制。 材料和方法: 通过诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的方式获得成骨细胞并提取外泌体。用外泌体处理前列腺癌细胞C4-2B和LNCa P,通过克隆形成等实验来评估细胞的增殖能力,利用流式细胞术检测细胞的抗凋亡水平,同时借助Transwell实验观察细胞的迁移和侵袭能力。PCR芯片分析外泌体处理后前列腺癌细胞中表达变化的microRNA(miRNA)。荧光标记实验验证成骨细胞和肿瘤细胞间是否存在mi RNA传递。在细胞和动物水平研究关键mi RNA对前列腺癌细胞生物学特性的影响。生信分析并实验验证关键mi RNA的靶基因。 结果: 我们利用商业化的诱导培养基成功诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,采用超速离心法成功地提取了这些成骨细胞分泌的外泌体,并对其进行了观察和鉴定。膜交换实验显示成骨细胞与前列腺癌细胞间存在外泌体介导的膜交换,克隆形成实验证明了成骨细胞外泌体可以通过携带的RNA分子促进前列腺癌细胞的增殖能力。我们通过PCR芯片筛选发现mi R-223可能是外泌体中的关键分子,提取成骨细胞、外泌体处理后的C4-2B和LNCa P细胞以及未经处理的C4-2B和LNCa P细胞中的mi RNA进行了相对定量检测,并通过FAM标记mi RNA示踪实验,证明了成骨细胞可以通过分泌外泌体将mi R-223成熟体传递至前列腺癌细胞。过表达mi R-223在体外能够增强前列腺癌细胞的增殖、抗凋亡和迁移侵袭能力;在小鼠体内可以促进前列腺癌细胞的生长。通过生信分析预测了mi R-223是通过靶向APC(Adenomatous Polyposis Coli,结肠腺瘤样息肉易感基因)调控WNT通路影响了前列腺癌细胞的恶性表型,并对这一推论进行了验证:过表达mi R-223能够降低前列腺癌细胞中APC蛋白的表达;Rescue实验表明过表达APC能够逆转mi R-223对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的促进作用。 结论: 成骨细胞分泌的外泌体可以促进前列腺癌细胞的生长、增殖和迁移。外泌体中mi R-223是本研究发现的其中起关键作用的分子,其通过影响细胞中APC的表达发挥促癌作用。研究结果对前列腺癌骨转移发生和进展的进一步研究提出了新的可能性,对于探索转移性前列腺癌的新型治疗策略,改进治疗效果并改善患者预后具有较大的科学价值。