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关键词： 肝细胞癌   非编码小分子RNA-152   基因表达   细胞生物学   肺转移  

摘要： 本文从以下几部分进行阐述：　　第一部分：　　目的：以47对配对的肝细胞癌组织和癌旁组织为基础，研究miR-152在肿瘤组织和相配对的癌旁组织中表达量，探讨miR-152在肝细胞癌及其癌旁组织的表达情况，并分析miR-152在肝细胞癌形成和发展的意义。　　方法：连续选取2009年7月至2015年10月间在华中科技大学同济医学院附属同济医院肝脏外科中心手术切除的癌细胞癌组织和匹配的癌旁正常肝组织47例，提取组织RNA后利用定量聚合酶链反应（real time PCR）检测miR-152的表达水平。　　结果：real time PCR检测显示，47对组织中，40对肿瘤组织中miR-152表达量低于癌旁组织。　　结论：miR-152在人肝脏细胞癌组织中表达下调，可能与肝细胞癌的发生和发展相关。　　第二部分：　　目的：本文以具有不同miR-152表达水平的肝癌细胞系为研究工具，通过转染miR-152的模拟物mimics或者miR-152的抑制物inhibitor研究miR-152对肝癌细胞系生物学行为的影响。　　方法：通过瞬时转染将miR-152的模拟物或者抑制物转入肝癌细胞系内，改变细胞系内miR-152的表达水平，并通过试验检测细胞系的生物学行为是否发生改变。比如通过CCK-8实验检测miR-152对细胞系增殖能力是否改变;用Transwell实验检测miR-152对细胞系侵袭或者迁移能力的影响;以慢病毒为工具，构建miR-152稳定过表达的细胞系，用裸鼠构建肿瘤转移模型，探讨miR-152对肝癌细胞系转移能力的影响。　　结果：在低表达miR-152的细胞系中转染mimics，肝癌细胞系的转移能力降低，而在低表达细胞系中转染inhibitor，则对细胞系的转移能力没有影响;在miR-152中等表达量的细胞系中转染mimics降低细胞系的转移能力，转染inhibitor增强细胞系的转移能力;在高表达miR-152的细胞系中，转染mimics对细胞系的转移能力没有影响，而转染inhibitor增强细胞系的转移能力;在三个细胞系中，无论转染mimics还是转染inhibitor对细胞系的增殖能力都没有影响。在小鼠肿瘤转移模型中，稳定过表达miR-152的细胞系肺转移能力增强。　　结论：miR-152能抑制肝癌细胞系的转移能力，而对增殖能力没有影响。　　第三部分：　　目的：探讨miR-152调控肝癌细胞系转移能力的机制。　　方法：用生物信息学数据库预测miR-152可能靶向的基因;构建双荧光素酶报告基因质粒验证miR-152是否能结合靶基因的3`UTR区来抑制靶基因的翻译;RT-PCR检测ITGA5是否为miR-152的靶基因;用Transwell实验验证在敲减miR-152的基础上再敲减ITGA5是否能回复肝癌细胞系的迁移能力。　　结果：结合多个生物信息学数据库预测后取miR-152的可能靶基因的交集，并根据可能靶基因的生物学功能预测ITGA5可能是miR-152发挥抑制肝癌迁移功能的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示miR-152可能结合ITGA5的第二个可能结合区域;RT-PCR检测过表达和敲减miR-152后ITGA5的表达水平也发生了改变。在敲减miR-152的基础上再敲减ITGA5是能回复肝癌细胞系的迁移能力。　　结论：miR-152通过靶向ITGA5抑制肝癌细胞系迁移能力。

关键词： 肾癌   14-3-3σ基因   细胞凋亡   细胞周期  

摘要： 目的:肾癌是泌尿男性生殖系统的常见肿瘤,透明细胞癌是肾癌的主要病理类型。研究发现14-3-3σ基因在肾癌组织中的表达明显低于癌旁组织。目前肾癌的治疗主要依靠外科手术。有研究表明14-3-3σ在肾癌组织中的表达量低于癌旁组织,14-3-3σ基因在肾癌组织与癌旁组织的差异性表达为探索新的肾癌治疗方法指引了方向。本文主要研究14-3-3σ基因在肾癌细胞中的表达及其对细胞生物学特性的影响。研究方法:在786-O、769-P和ACHN三种肾癌细胞系中,通过RT-PCR、Western Blot实验检测14-3-3σ基因的mRNA和蛋白的内源性表达;769-P和ACHN肾癌细胞转染14-3-3σsiRNA后,再通过RT-PCR、Western Blot实验检测769-P、ACHN中14-3-3σ的mRNA和蛋白表达水平,从而可以间接地反映出14-3-3σsi RNA的敲除效率;769-P、ACHN肾癌细胞再次转染14-3-3σsiRNA后检测肾癌细胞功能,包括转移与侵袭、细胞增殖、细胞周期与凋亡功能实验。结果:RT-PCR结果显示769-P肾癌细胞中14-3-3σ基因mRNA表达量显著高于ACHN细胞系,ACHN细胞系中14-3-3σ基因mRNA表达量显著高于786-O细胞系。Western Blot实验结果显示769-P肾癌细胞中14-3-3σ蛋白表达量显著高于ACHN细胞系,ACHN细胞中14-3-3σ蛋白表达量显著高于786-O细胞系。769-P和ACHN肾癌细胞分别转染siRNA,敲除14-3-3σ基因后,RT-PCR实验显示转染过14-3-3σsi RNA的769-P和ACHN肾癌细胞中14-3-3σmRNA的表达量明显低于未转染14-3-3σsiRNA组,Western Blot检测结果显示转染过14-3-3σsiRNA的769-P、ACHN肾癌细胞中14-3-3σ蛋白表达量明显低于未转染过14-3-3σsiRNA的细胞(P<0.05)。转染过14-3-3σsiRNA的769-P和ACHN细胞较对照组的769-P、ACHN细胞转移与侵袭能力显著增强。细胞周期实验结果显示处于细胞周期G1期的细胞百分比对照组显著高于实验组,说明14-3-3σ基因能使细胞周期阻滞在G1期。细胞凋亡实验显示对照组中769-P细胞的凋亡细胞百分比是实验组的3倍,对照组中ACHN细胞的凋亡细胞的凋亡百分比是实验组的2倍,说明敲除14-3-3σ基因后抑制了769-P、ACHN肾癌细胞凋亡。敲除14-3-3σ基因后769-P和ACHN细胞的增殖能力较对照组显著增强。结论:14-3-3σ基因能够在肾癌细胞中表达,14-3-3σ基因能够抑制769-P和ACHN肾癌细胞的转移、侵袭和细胞增殖,促进肾癌细胞凋亡,阻滞细胞周期于细胞间期。

关键词： 骨髓间充质干细胞   髓系肿瘤   细胞增殖   细胞衰老   造血支持   遗传学  

摘要： 目的:通过研究急性髓系白血病（acute myeloblastic leukemia,AML）、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes,MDS）和慢性髓细胞白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）等髓系肿瘤骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）的生物学和遗传学特性的改变,探讨髓系肿瘤骨髓微环境（bone marrow microenvironment,BMM）的变化。方法:（1）MSC的分离和鉴定:首先采用Ficoll淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞（mononuclear cells,MNC）,然后采用贴壁法去除悬浮细胞,留下贴壁细胞。采用流式细胞术、诱导分化实验和集落形成实验对分离的MSC进行鉴定;（2）MSC生物学特性分析:CCK8法、集落形成实验检测MSC的增殖能力,衰老β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色法检测MSC的衰老细胞比例,长期共培养起始细胞（long-term culture-initiating cell,LTC-IC）实验检测MSC的造血支持能力;（3）MSC遗传学分析:应用常规核型分析（conventional cytogenetic analysis,CCA）和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术检测骨髓造血细胞（hematopoietic cells,HC）和MSC的细胞遗传学,MDS患者骨髓FISH检测采用MDS组套探针,CML患者采用bcr-abl双色双融合探针;NGS技术检测AML患者与MDS患者骨髓HC和MSC的热点基因突变。结果:***的分离与鉴定:取第3代分离的贴壁细胞进行鉴定。（1）经流式细胞术检测,该贴壁细胞不表达HC的标志抗原,如CD45和CD34;表达CD44、CD73、CD90和CD105。（2）诱导分化实验表明贴壁细胞可向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化,说明该贴壁细胞具有多向分化的潜能。（3）集落形成实验表明,单个贴壁细胞能够增殖形成经染色后肉眼可见的克隆单位,说明该贴壁细胞具有自我更新的干细胞特性。上述鉴定结果均符合国际治疗学会（international Society for Cellular Therapy,ISCT）制定的鉴定MSC的最低标准,因此可以认为所分离纯化的贴壁细胞为MSC。***的生物学特性:髓系肿瘤组（AML、MDS或CML患者）与健康供者（healthy donor,HD）对照组骨髓MSC在增殖能力、衰老细胞比例以及造血支持能力等三方面存在的差异。CCK8法检测结果显示:从第3-4d开始,髓系肿瘤组的增殖速度显著低于对照组;但髓系肿瘤组内无明显差异。同样,集落形成实验也表明,较HD组,髓系肿瘤组的增殖能力显著降低,但各肿瘤组内无明显差异。HD、AML、MDS和CML的集落形成个数分别为:13.55±2.73、9.73±2.53、7.75±1.91与7.60±3.06。SA-β-Gal染色实验结果为:第8代AML、MDS和CML骨髓MSC的衰老细胞占比分别为56.38±6.23%、53.75±14.66%和60.17±6.52%,显著高于HD组的衰老细胞占比（23.14±4.18%）。可见,髓系肿瘤骨髓MSC较HD-MSC更容易衰老。将骨髓MSC与HD骨髓CD34+HSC长期共培养,通过计数起始细胞数来评估MSC的造血支持能力。相比于对照组,与髓系肿瘤组MSC长期共培养后的HD骨髓CD34+HSC所形成的集落个数明显减少。髓系肿瘤组的起始细胞数（CFU-GM、CFU-E和BFU-E集落个数总和）约为HD组的1/3,说明髓系肿瘤组MSC造血支持能力受损,但组内无明显差异。***的遗传学特征:分析AML、MDS和CML患者骨髓MSC和HC的细胞遗传学及热点基因的突变情况以探究髓系肿瘤MSC与HC遗传学特性及其关系。行CCA检测29例AML患者骨髓HC和MSC的细胞核型,其中骨髓HC检出异常核型的患者有16例,但在骨髓MSC中均未检出细胞遗传学异常。联合CCA和FISH检测37例MDS患者和15例CML患者骨髓MSC与HC的特异性位点的染色体异常。34例MDS患者骨髓HC培养成功、有分裂相,其中16例检出核型异常;但骨髓MSC的细胞核型均未检出异常;10例MDS患者骨髓HC经FISH检出5q-、7q-和+8等位点的改变,但其骨髓MSC的检测结果也均为阴性。CML患者骨髓HC均检出费城染色体和bcr-abl融合基因,但骨髓MSC均未检出。采用二代测序（next-generation sequencing,NGS）技术进一步检测AML和MDS骨髓HC和MSC热点基因,发现送检标本的HC均

关键词： 结肠癌   CRISPR/Cas9   超级增强子   EphA2  

摘要： 超级增强子(Super Enhancers,SEs)是增强子大型集群,在个体生长发育、免疫调节、新陈代谢及癌症致病机理研究中具有重要的作用。近几年来,SEs与癌症的关系备受关注,进一步研究结肠癌中SEs功能,对于了解结肠癌的发生、发展,以及后期的临床治疗具有重要意义。本研究选择位于人类chr1:16498296-16509788的EphA2相关的肿瘤普遍性超级增强子(EphA2-SE)为实验对象。通过双荧光素酶报告系统发现,EphA2-SE活性主要由组分增强子E1驱动。利用CRISPR/Cas9技术,在HCT-116中建立EphA2-SE敲除纯合子和杂合子细胞系,通过q RT-PCR检测发现,敲除细胞系中靶基因EphA2 m RNA表达水平显著下调,且敲除纯合子比杂合子下调更为显著。通过MTT、克隆形成实验和细胞划痕愈合实验发现,敲除EphA2-SE后,细胞增殖、克隆形成能力和迁移能力均受到抑制,且皆为敲除纯合子的抑制趋势更明显。结果表明,EphA2-SE活性主要由E1组分增强子驱动,EphA2-SE可以通过调控靶基因EphA2表达而影响HCT-116细胞生物学特性。

关键词： 诱导性多能干细胞   神经分化   转录因子   Wnt/β-catenin信号通路  

摘要： 目的研究iPS细胞分化来源NSCs的生物学特性,探讨iPS细胞成神经分化过程中,Wnt/β-catenin信号通路对转录因子TCF1、LEF1、Ngn1、Ngn 2的影响。方法(1)下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs体外增殖和迁移能力影响的研究:(1)饲养层细胞(MEF)的制备;(2)体外培养小鼠iPS细胞,N2B27联合RA法诱导其向NSCs分化,并对其进行免疫荧光鉴定;(3)在iPS细胞向NSCs分化过程中,将细胞分为正常组和DKK-1组,下调Wnt/β-catenin信号通路;(4)采用CCK-8法检测iPS-NSCs的生长曲线,研究下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs增殖的影响;(5)采用Transwell法检测iPS-NSCs迁移能力,研究下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs迁移能力的影响。(2)下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs的体外分化能力影响的研究:(1)iPS-NSC的体外培养,诱导iPS-NSCs向神经细胞分化;(2)免疫荧光检测iPS-NSCs向神经元、星形胶质细胞分化的能力;(3)流式细胞术检测下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs凋亡的影响。(3)下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS细胞向NSCs分化过程中转录因子TCF1、LEF1、Ngn1、Ngn2和通路蛋白GSK3β表达影响的研究:(1)采用Western-blot、q RT-PCR分别检测iPS细胞向NSCs分化过程中,Wnt/β-catenin信号通路中转录因子TCF1、LEF1、Ngn1、Ngn2和通路蛋白GSK3β的表达情况;(2)采用小分子抑制剂DKK-1下调Wnt/β-catenin信号通路,Western-blot、q RT-PCR分别检测iPS细胞向NSCs分化过程中,Wnt/β-catenin信号通路中转录因子TCF1、LEF1、Ngn1、Ngn2和通路蛋白GSK3β的表达情况。结果(1)下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs体外增殖和迁移能力影响的研究:(1)MEF呈纤维状、梭形生长,易贴壁,生长较快;(2)iPS细胞呈圆形或椭圆形克隆样生长,形成具有三胚层结构的拟胚体;iPS-NSCs阳性表达Nestin和Sox2;(3)iPS-NSCs生长曲线呈“S”形,下调Wnt/β-catenin信号通路后iPS-NSCs的生长曲线无显著性变化(P>0.05);(4)iPS-NSCs具有体外迁移能力,下调Wnt/β-catenin信号通路,iPS-NSCs迁移能力下降(P<0.05)。(2)下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs的体外分化能力影响的研究:(1)免疫荧光检测结果显示部分细胞早期神经元特异性标志物βIII-tubulin表达阳性,星形胶质细胞表面特异性标志物GFAP表达呈阳性;下调Wnt/β-catenin信号通路后,免疫荧光检测结果显示DKK-1组βIII-tubulin阳性细胞(P<0.05)及GFAP阳性细胞增加(P<0.01);(2)iPS-NSCs向神经细胞分化过程中,细胞会出现凋亡情况,下调Wnt/β-catenin信号通路后,iPS-NSCs向神经分化过程中细胞凋亡率降低(P<0.05)。(3)下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS细胞向NSCs分化过程中转录因子TCF1、LEF1、Ngn1、Ngn2和通路蛋白GSK3β表达的阴性录因子TCF1、LEF1的蛋白和m RNA表达整体呈先下降后上升(P<0.05),下调Wnt/β-catenin信号通路后,TCF1、LEF1的蛋白和m RNA表达均较正常组增加(P<0.05);(2)转录因子Ngn1、Ngn2的蛋白和m RNA表达均在NSC-D6表达增加(P<0.05);下调Wnt/β-catenin信号通路后,Ngn1、Ngn2的蛋白和m RNA表达均较正常组增加(P<0.05);(3)iPS细胞向NSCs分化过程中,Wnt/β-catenin信号通路GSK3β的蛋白和m RNA表达水平降低(P<0.05),下调Wnt/β-catenin信号通路后GSK3β的表达水平在神经分化后期会升高(P<0.05)。结论(1)体外培养的iPS-NSCs具有增殖、迁移和分化为神经元细胞、星形胶质细胞能力。(2)下调Wnt/β-catenin信号通路对iPS-NSCs的增殖能力未见影响,可降低迁移能力,促进向神经元细胞、星形胶质细胞分化,降低分化时的细胞凋亡率。(3)iPS细胞向神经细胞分化过程中,下调Wnt/β-catenin信号通路可促进转录因子TCF1、LEF1、Ngn1、Ngn2和通路蛋白GSK3β的表达,提示Wnt

关键词： 教研室   细胞生物学   本科生   中国医科大学  

摘要： 中国医科大学细胞生物学教研室成立于1985年,为医学细胞生物学教育部重点实验室暨国家卫计委细胞生物学重点实验室组成之一。本学科从1981年起成为国家第一批硕士学位授权学科,1990年成为我国高等医药院校第一个细胞生物学专业博士点,1995年成为基础医学博士后流动站(1999年成为生物学博士后流动站),1997年成为辽宁省重点学科,2011年被评为辽

关键词： 小胶质细胞   激活   SAHA   乙酰化  

摘要： 目的:传统上,组蛋白的乙酰化修饰被认为是一种重要的表观遗传调节方式,在基因表达调控中发挥重要作用。近来研究发现超过4000种蛋白可以被乙酰化修饰,蛋白质的乙酰化修饰可以影响蛋白的稳定性,酶的活性,蛋白之间的相互作用,参与调节多种生物学过程。小胶质细胞活化引起的炎症反应在多种神经退行性疾病过程中发挥重要作用。既往研究显示去乙酰化酶抑制剂可降低小胶质细胞的活化。本课题将通过系统生物学的方法检测去乙酰化酶被抑制对小胶质细胞蛋白乙酰化修饰谱,基因表达谱和蛋白表达谱的影响,并探讨蛋白乙酰化修饰作用的分子机制,为脑缺血损伤和神经退行性疾病的研究及治疗提供实验基础。方法:MTT法检测辛二酰苯胺异羟肟酸(Suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对小胶质细胞系BV2活性的影响。显微镜观察SAHA对小胶质细胞BV2形态的影响。Western bloting检测SAHA对BV2细胞蛋白质乙酰化水平的影响。分别采用5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridin,EdU)标记法和吞噬Annexin V-EGFP重组大肠杆菌BL21的方法对BV2细胞增殖和吞噬的影响。二代测序分析SAHA处理对BV2细胞转录组的影响。采用基于细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记法(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)标记的定量蛋白质组学方法分析SAHA处理对BV2细胞蛋白表达谱和乙酰化蛋白谱图的影响。通过IPA等生物信息学软件和方法分析这三个层面的差异表达基因和蛋白的生物学功能及相互之间的联系。结果:1、SAHA呈剂量依赖性抑制BV2细胞的活性,IC50=9.85。2、随着SAHA处理时间的增加,BV2细胞由椭圆形逐渐变成多触角的扁平状。3、SAHA的处理3小时后显著增加BV2细胞组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平,处理12小时蛋白乙酰化增加最多,之后呈下降趋势。4、乙酰化蛋白表达谱分析检测到26,307条乙酰化肽段,占全部肽段的28.85%,包含3,092乙酰化位点,其中乙酰化修饰增加的位点807个,下调109个。在所对应的1,215个乙酰化蛋白中,乙酰化修饰上调的蛋白388个,下调蛋白71个,既有上调也有下调的蛋白20个,占总数的36.13%。这些乙酰化水平差异表达的蛋白涉及到细胞骨架的形成、线粒体能量代谢、基因表达和蛋白合成降解等多种生物过程。5、在RNA测序检测到的12,123个基因中,在SAHA处理后,有444个基因差异表达(3.66%),其中上调272个,下调172个。上调基因主要与免疫防御相关,下调基因主要结合作用。6、蛋白表达谱分析结果显示,在检测到5827种蛋白中,差异表达的297种(5.10%),其中上调151种,下调的146个。上调的蛋白和下调的蛋白主要功能是免疫防御。7、差异表达的蛋白与差异表达基因的交集只有14个。乙酰化水平差异表达蛋白与差异表达基因的相同的只有10个,与差异表达的蛋白只有13个。8、SAHA处理对BV2细胞功能的影响:EdU检测结果显示SAHA处理6小时抑制BV2细胞的增殖。吞噬的检测结果显示随着SAHA处理时间的增加,BV2细胞的吞噬能力先增强、后减弱。结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA的作用并不仅限小胶质细胞BV2的组蛋白,还调节参与多种非组蛋白的乙酰化。SAHA短时间作用对蛋白表达量的影响并非通过改变其基因转录从而改变蛋白量。蛋白乙酰化水平的变化为细胞的形态、生物功能,小胶质细胞的分型和基因表达的变化提供分子基础。

ISBN: (纸本)9787030592835

关键词： 教学内容   医学细胞生物学   教学方法  

摘要： 细胞生物学(cell biology)是运用近代物理学和化学的技术成就以及分子生物学的概念与方法,从显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次上研究细胞的结构、功能及各种生命活动规律的科学,是一门集基础性、前沿性和实践性于一体的学科。在我国基础科学发展规划中,细胞生物学被列为生命科学的四大基础学科之一。随着现代医学研究理论的不断深入,对当代医学生来说,其学习过程中所接触的教学教