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关键词： 髓核间充质干细胞   TNF-α   分化   椎间盘退变   NF-κB信号通路  

摘要： 背景椎间盘退行性疾病(degenerative disc disease，DDD)是临床上常见的一类慢性疾病,椎间盘退行性变是导致这类疾病共同的病理学基础。然而,由于椎间盘退变的具体机制现在仍未完全阐明,目前的治疗手段作用有限。最新的研究理论认为:多因素介导的椎间盘内源性干细胞功能和结构发生紊乱,导致椎间盘内环境稳态无法维持。髓核间充质干细胞(NPMSCs)被认为是最为关键的一类椎间盘内源性间充质干细胞,前期研究发现,NPMSCs在退变椎间盘内功能受到抑制,然而对其具体机制及影响因素了解甚少。炎症是加速椎间盘退变的关键因素之一,在椎间盘退变发生发展过程中起到重要作用。TNF-α(Tumor Necrosis Factor-alpha)是退变椎间盘内含量最为丰富的一种炎性因子,其可以通过多种信号通路对椎间盘内细胞产生负面影响。但是,TNF-α是否参与影响了 NPMSCs的生物学功能及其具体作用机制还未见系统研究。目的本研究即通过不同浓度TNF-α处理大鼠NPMSCs,在体外环境下观察其对于NPMSCs增殖、迁移、分化功能的影响。方法取SD大鼠髓核组织,体外培养,低密度培养法分离NPMSCs,并使用流式鉴定干细胞表型,三系分化能力对分离的干细胞进行鉴定。使用不同浓度TNF-α(0ng/ml,0.1 ng/ml,1 ng/ml,10 ng/ml,50 ng/ml,100ng/ml,200ng/ml)刺激NPMSCs，Annexin V/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡水平,使用CCK-8、EdU及流式检测细胞周期比较各组细胞增殖能力,使用划痕实验及Transwell迁移实验检测各组迁移能力。Pellet法诱导NPMSCs向髓核细胞分化,使用Western-Botting、RT-PCR 及免疫组化检测各组髓核表型 SOX-9,Coll-Ⅱ,Aggrecan,Krt-19,HIF-1α,Shh的表达情况,使用免疫荧光检测NF-κB信号通路激活情况,加入NF-κB信号通路抑制剂Bay11-7082后观察细胞分化能力变化。结果成功分离并鉴定NPMSCs，TNF-α在50-200ng/ml(高浓度)范围可以明显促进NPMSCs发生凋亡,0.1-10ng/ml范围内则无明显促进凋亡作用(P<0.05);TNF-α在0.1-10ng/ml(低浓度)范围时,CCK-8结果显示在第3-10天,随着TNF-α浓度上升,细胞增殖能力升高,细胞周期检测显示有更多的细胞进入S期,更少的细胞滞留在G0/G1期,EdU实验阳性细胞比例升高。划痕实验及Transwell迁移实验结果显示细胞迁移能力也逐渐上升。加入TNF-α后NPMSCs向髓核分化的标志物 SOX-9、Coll-Ⅱ,Krt-19，HIF-1α,Shh 及 Aggrecan 等表达均降低。细胞免疫荧光显示加入TNF-α后NF-κb信号通路激活,加入NF-κB信号通路抑制剂后NPMSCs分化能力得到恢复。结论TNF-α的作用较为复杂,高浓度TNF-α(50-200ng/ml)可以明显促进NPMSCs发生凋亡,而低浓度组(0.1-1Ong/ml)则无明显促进凋亡作用;低浓度TNF-α可以促进NPMSCs增殖、迁移,并且通过NF-κB信号通路抑制NPMSCs分化。本项研究揭示了 NPMSCs的生物学性能在椎间盘退变的过程中的动态变化,为椎间盘退变的生物学治疗提供理论基础。

关键词： 肝癌   SMMC-7721细胞   CXCL2   过表达   功能研究  

摘要： 背景与目的:肝癌在我国是最常见的恶性肿瘤之一,在全国癌症死亡病因中排在第二位;肿瘤的发生发展与其炎症微环境密切相关。随着分子生物学和生物信息学的发展,相同或不同的研究学者发现,肿瘤细胞在与微环境共同进化的过程中可促进肿瘤炎症微环境的形成。研究肿瘤微环境中高表达的促炎因子与炎症-癌症信号通路关系已成为目前肿瘤微环境研究重点。C-X-C结构趋化因子配体2(CXCL2)是一类主要趋化中性粒细胞的趋化因子,与其特异性受体C-X-C结构趋化因子受体2(CXCR2)结合后可促进中性粒细胞的趋化和部分肿瘤细胞的生长和迁移。我们的前期研究在选择性活化的巨噬细胞(M2型)与肝癌细胞共培养体系中验证出了差异分泌蛋白CXCL2,中和共培养体系中的CXCL2后肝癌细胞的迁移和侵袭能力降低,提示了CXCL2可能对肝癌细胞生物学功能产生影响。目前关于CXCL2与肝癌发生发展间关系的报导还比较少,本研究将进一步验证CXCL2过表达在肝癌细胞上会对肝癌细胞的生物学功能产生什么样的影响,为肝癌的早断、寻求新的治疗方案、改善患者预后提供依据。方法:将过表达CXCL2基因的慢病毒载体感染SMMC-7721肝癌细胞,即设为慢病毒感染组;空白对照组为不做任何感染处理的SMMC-7721肝癌细胞。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫印迹法(Western-blot)分别检测CXCL2基因mRNA和CXCL2蛋白的表达情况;用CCK-8法检测细胞活力来验证细胞的增殖能力;利用Transwell法细胞侵袭实验和细胞划痕实验来评估肝癌细胞的侵袭和迁移能力;运用细胞粘附实验检测细胞粘附力;使用流式细胞仪检测细胞周期。运用SPSS23.0统计软件对实验数据进行统计学分析。结果:稳定过表达CXCL2的SMMC-7721肝癌细胞株构建成功,慢病毒感染组CXCL2基因mRNA和CXCL2蛋白的表达均高于空白对照组;CCK-8法检测细胞增殖能力实验发现,慢病毒感染组细胞增殖相对较多(P<0.05);Transwell法细胞侵袭实验发现,慢病毒感染组穿过基质膜的细胞数比空白对照组多且差异具有统计学意义(P<0.05);通过细胞划痕实验观察在划痕后0h、8h、24h三个时间点细胞的迁移情况并计算迁移率,结果显示慢病毒感染组从8h开始其细胞的迁移率较高(8h时P=0.01,24h时P=0.035);细胞粘附实验发现慢病毒感染组粘附细胞的数量较少(P<0.05);两组细胞周期检测结果为,慢病毒感染组细胞G1期所占比例较高(P=0.034),S期所占比例较低(P=0.017),G2/M期无明显改变。结论:通过慢病毒感染,CXCL2基因在SMMC-7721肝癌细胞株上稳定过表达,CXCL2可促进SMMC-7721细胞的增殖、增强细胞迁移和侵袭能力,抑制细胞的粘附;根据两组细胞的细胞周期结果,推断细胞周期可能被阻滞在G1期。

关键词： 医学细胞生物学   网络资源   医学教育  

摘要： 以新疆医科大学的课程中心网络资源配置为例,目前的基础医学课程教学中已注入多媒体技术、数字化技术和网路技术等元素,使教学手段更加多元化,使课程内容更加直观化、形象化,显著提高了教学效率和质量,以网络为基础的各种知识学习逐渐成为世界教学发展的一种趋势。

关键词： 溃疡性结肠炎   骨髓间充质干细胞   参苓白术散   痛泻要方   CD29   CD45   CD105  

摘要： 目的:1.观察TNBS/乙醇诱导UC模型大鼠结肠黏膜炎性反应损伤时,骨髓来源BMSCs是否动员进入外周血液,进入外周血来源的BMSCs与骨髓来源的BMSCs,其生长增殖、迁移黏附的生物学特性有何不同,为探讨BMSCs归巢修复结肠黏膜奠定基础。2.探讨参苓白术散与痛泻要方促进TNBS/乙醇诱导UC模型骨髓中BMSCs动员及其对外周血来源的BMSCs与骨髓来源BMSCs的生长增殖、迁移黏附有何不同干预效应。同时,以“方证相应”理论为指导,通过二方的不同干预效应评价TNBS/乙醇诱导UC大鼠模型的中医证候特征。方法:1.180～220g健康SPF级SD雄性大鼠20只,常规饲养1周左右后,随机抽取6只作为空白组,剩余全部以三硝基苯磺酸(TNBS)/50%乙醇造成UC模型,5周后取结肠组织,采用HE染色进行模型成功的评价。2.依据参苓白术散与痛泻要方原方组成与剂量比例,采用传统的中药煎煮方法制备灌胃用药,从模型中随机选取2组给予参苓白术散与痛泻要方灌胃治疗,其他组给予等剂量生理盐水灌胃,28天后,麻醉大鼠,采集血液,分离股骨,收集空白组血清及参苓白术散组与痛泻要方组含药血清。提取外周血与骨髓中各组BMSCs进行原代培养,用倒置显微镜观察BMSCs形态,免疫荧光鉴定外周血与骨髓来源的BMSCs,流式细胞技术检测骨髓与外周血来源的BMSCs含量、生长、增殖。3.180-220g健康SPF级SD雄性大鼠20只,常规饲养1周后随机分2组,实验前禁食12-24h,各组大鼠给予参苓白术散与痛泻要方灌胃,第3次给药后2h在无菌的条件下腹主动脉采血、静置、离心、分离血清,混匀药物血清,水浴中灭活,冰箱保存(-20℃)备用。4.取各组外周血的BMSCs,用0.25%胰酶消化,按照1:2传代,取第三代BMSCs作为后续实验,RTCA检测各组来源的BMSCs的黏附能力、迁移及参苓白术散与痛泻要方含药血清的干预作用,用免疫组化法检测外周血来源的各组VCAM-1表达,QPCR检测外周血来源的各组VCAM-1表达,流式细胞技术检测外周血来源的各组VLA-4的表达。结果:1.骨髓及外周血来源的BMSCs动员检测。骨髓来源的各组阳性细胞百分数示:与空白组比较,模型组的阳性细胞百分数下降(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组的阳性细胞百分数升高,痛泻要方组优于参苓白术散组(P<0.05),差异具有统计学意义;外周血来源的各组阳性细胞百分数示:与空白组比较,模型组的阳性细胞百分数升高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组阳性细胞百分数下降,痛泻要方组优于参苓白术散组(P<0.05),差异具有统计学意义。***的形态观察。细胞形态在刚刚接种时,主要表现为椭圆形、圆形不等的细胞。在培养液中,细胞密集地悬浮,细胞折光性比较强,培养3天后,部分细胞呈现类圆形或纺锤形,仍有大量未贴壁的细胞悬浮于培养液中。第一代细胞表现为:细胞贴壁生长,形态呈纺锤形、不规则形、三角形或多边形等多形态,细胞融合范围为80-90%,有较少的杂质悬浮于培养液中。***检测骨髓与外周血来源的BMSCs的周期。骨髓来源的各组BMSCs细胞周期示:与空白组比较,模型组的S期细胞比例增高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组的S期细胞比例增高,痛泻要方组增高更显著(P<0.05),差异具有统计学意义;外周血来源的各组BMSCs细胞周期示:与空白组比较,模型组的S期细胞比例增高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组的S期细胞比例增高,痛泻要方组增高更显著(P<0.05),差异具有统计学意义。***检测骨髓与外周血来源的BMSCs的增殖能力。骨髓来源的各组BMSCs,与空白组比较,模型组细胞活性增高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散与痛泻要方组的细胞活性要高于模型组(P<0.05),差异具有统计学意义;而参苓白术散与痛泻要方组的细胞活性表现相当(P>0.05)。外周血来源的各组BMSCs,与空白组比较,模型组的细胞活性降低(P<0.05),模型组的细胞活性在四组中最低;与模型组比较,参苓白术散组与痛泻要方组的细胞活性高于模型组,痛泻要方组的细胞活性最高(P<0.05),差异具有统计学意义。***检测外周血来源的BMSCs的黏附特性。与空白组比较,模型组细胞指数接近0(P>0.05);与模型组比较,随着时间的迁延,痛泻要方组发生黏附的细胞越来越多(P<0.05),差异具有统计学意义,而与参苓白术散组的关系比较弱(P>0.05)。***、免疫组化检测外周血来源的各组VCAM-1的表达。与空白组比较,模型组的VCA

关键词： 甲状腺乳头状癌   LAMB3基因   淋巴结转移   分子标记物   细胞生物学  

摘要： 背景和目的：　　甲状腺癌（thyroid cancer，TC）是全世界范围内发病率最高的内分泌恶性肿瘤。根据最新的美国肿瘤统计年报，全美2017年甲状腺癌新发病例46000余例，其中75%为女性患者，其新发病例在女性所有恶性肿瘤中排名第五，仅次于乳腺癌、肺癌、结直肠癌和子宫体癌。根据2015年的中国肿瘤统计年报，在小于30岁女性人群中，甲状腺癌是最常见的恶性肿瘤;在30-59岁女性人群中，甲状腺癌发病率仅次于乳腺癌。　　因此，为了能够解决当前在甲状腺癌诊疗过程中碰到的各种难题，迫切要求我们从分子水平全面系统、探索甲状腺癌的具体发生及进展机制和复杂的基因调控作用。一方面，为临床实践中的具体诊疗方案提供充实的理论依据，另一方面，为发现甲状腺癌预后相关的分子标记物及提供个体化治疗奠定基础。　　方法：　　我们用RNA-seq技术对20对甲状腺癌组织及其对应的正常甲状腺组织进行转录组测序。通过原始数据过滤和质量控制之后，对符合条件的数据进行分析。利用生物信息学技术，筛选出在甲状腺癌组织和正常甲状腺组织中所有显著差异表达的基因，对甲状癌的转录组信息进行全面系统探索。对筛选出的差异基因，我们利用基因本底论分析和信号通路分析，研究分析所有差异基因在肿瘤发生中涉及的生物学进程、分子机制、细胞组分和信号通路多方面中的作用。我们进一步确定最显著差异的基因之一，LAMB3作为最终的研究对象。我们通过收集56对甲状腺癌及相应的正常甲状腺组织和33对甲状腺腺瘤及相应正常甲状腺组织，利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实验，检验 LAMB3 基因在以上组织标本中mRNA水平表达情况，通过分析The Cancer GenomeAtlas（TCGA）公共数据库，验证LAMB3在甲状腺癌中的表达。利用ROC曲线分析方法，检验LAMB3作为分子标记物鉴别肿瘤与正常组织的效率。结合验证组和TCGA数据库的临床病理特征资料，我们对LAMB3表达水平与相应的临床病理特征进行统计学分析。我们运用基因下调技术（siRNA干扰技术）验证LAMB3在细胞株（TPC1，BCPAP和KTC-1）中的生物学功能。我们通过细胞增殖实验和细胞克隆形成实验检验LAMB3在细胞株中对细胞增殖能力的影响。通过细胞迁移实验和细胞侵袭实验，来检测LAMB3在细胞株中对细胞迁移和侵袭能力的影响。　　结果：　　对测序的数据进行过滤和质量控制之后，我们得到了符合条件的clean data，我们利用算法绘制 20 例测序样本的 HeatMap，结果表明，甲状腺乳头状癌和其对应的正常组织的基因表达情况有很明显的不同。我们用EB-Seq算法，筛选差异基因，一共得到17702个差异基因。于是我们选择在20对样本中均有显著差异表达的801个基因，作进一步分析和筛选。结合基因本底论分析、信号通路分析和文献调研，确定LAMB3基因作为最终研究基因。我们选取TCGA数据库中有正常组织的59例标本数据。同样发现LAMB3在PTC组织标本的表达也高于对应的正常组织（P＜0.001）。在组织标本（56对PTC，33对甲状腺腺瘤）中LAMB3基因的表达进行检测。实验发现，在PTC组织标本中的LAMB3表达显著高于其对应的正常组织（P＜0.001）。而在甲状腺腺瘤组织中的LAMB3的表达相对于正常组织却没有差异（P＞0.1）。我们选取了TCGA数据（507例PTC及59例正常甲状腺组织），计算并绘制ROC曲线，发现LAMB3作为鉴别甲状腺癌组织和正常组织的敏感度是83.1%，特异性为91.5%，曲线下面积为90.1%。同样地，我们用验证组数据进行计算，发现敏感度为94.6%，特异性为98.2%，而曲线下面积达97.3%。通过临床病理资料分析，我们发现在 TCGA 数据库中，LAMB3 高表达与淋巴结转移(P＜0.001)和病理组织学类型(P＜0.001)具有密切联系。在我们验证组分析证明，LAMB3高表达与淋巴结转移(P=0.018)和肿瘤大小(P＜0.001)具有相关性。为了进一步比较LAMB3表达在所有影响因素中的作用大小，我们采用多因素Logistic回归分析，结果显示LAMB3表达水平（OR 2.28,95%CI1.465-3.549，P＜0.001），年龄（OR 0.671，95%CI 0.433-1.04，P=0.074），性别（OR 0.476,95CI% 0.284-0.796，P=0.005），肿瘤大小（OR 2.043, 95%CI 0.911-4.584，P=0.083）和组织学类型（OR 0.444，95%CI 0.274-0.721，P=0.001）与甲状腺乳头状癌的淋巴结转移具有密切联系。我们将特异性的siRNA通过细胞转染转移入甲状腺癌细胞株（TPC1，BCPAP和KTC-1）中，LAMB

关键词： Metabolism   Pulmonary artery   Pulmonary hypertension   Stem cell biology   Vascular  

摘要： Introduction: Pulmonary hypertension (PH) is a multi-cellular disease with a high mortality rate. Some studies have incriminated and other studies have exonerated stem cells in the remodeling of pulmonary arteries in various types of PH. Thus, the role of stem cells in the genesis of PH is yet unsettled. Hypothesis and Objective: Our one objective was to determine whether: 1) hematopoietic stem cells (HSCs) are increased in peripheral blood of patients with pulmonary arterial hypertension (PAH); and 2) bone marrow-derived HSCs contribute to the remodeling of pulmonary arteries in mice with hypoxia-induced PH, and another objective was to determine the mechanism of HSC production and differentiation to inflammatory cell-types in hypoxic mice. Methods and Results: Our results demonstrated that pluripotent CD34+ and CD117+ HSCs are increased (>3-fold) in the peripheral circulation, and CD117+ and CD133+ HSCs are increased in the plexiform lesions of patients with pulmonary arterial hypertension as compared normal individuals. Consequently, in experimental model of hypoxia-induced PH, we showed that pluripotent HSCs (CD34+, CD117+, and CD133+) and HSCs-derived macrophages (F4/80+CD11b+) are increased in the bone marrow and peripheral blood of hypoxic mice in a time-dependent manner that coincides with a sudden rise in large artery and ventricle stiffness, and heart failure. Also, CD133+cells in the PA wall and HSCs-derived CD41+platelets in lungs of hypoxic mice are increased. Intriguingly, we discovered that loss of cytochrome P450 2C44 (CYP2C44), eicosanoid producing enzyme, exacerbated and inhibition or knockdown/deficiency of glucose-6-phosphate dehydrogenase significantly alleviated increase of HSCs and immunogenic cells in bone marrow, blood, and lungs of mice established hypoxia-induced PH. Finally, inhibition of G6PD reduced HSCs (CD117+) and HSCs-derived macrophages (F4/80+and CD11b+) by concomitantly up-regulating Bmpr1a and down-regulating Csf2 and Cxcl12 , t

关键词： 肝细胞癌   AGTR1   洛沙坦   JAK2  

摘要： 近年来,基因组测序技术的快速发展,加深了人们对肿瘤异质性的认识,含有大量肿瘤临床样本多组学数据库的TCGA及Oncomine分析平台为肿瘤个体差异的基因分型、治疗与生存期的整合研究提供了大样本数据库,受到国内外学者的广泛关注,并越来越多地运用到肿瘤的个体化精准治疗的研究中来。肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤之一,现已成为我国第二世界第三位的癌症死亡原因。我国为肝癌高发病率国家,手术切除被认为是可能治愈初诊HCC患者的疗法,但只有约10%20%的患者肿瘤可切除,且手术病人面临肿瘤复发的可能,最近的统计发现2000年至2014年间我国肝癌患者5年生存率仅为14.1%。近年来针对肝癌靶向治疗药物的研发逐渐成为热点,但由于大量不同癌基因以及抑癌基因的突变参与了肝细胞癌的发生发展,而其精确的分子机制尚不完全清楚,导致靶向制剂对肿瘤患者个体的治疗效果差异大,药物靶向性较低。目前,作为首个美国FDA批准上市,用于晚期HCC靶向治疗的多激酶抑制剂索拉菲尼,其有效率也仅为25%。1995年Lever在The Lancet杂志发表一项大型开创性回顾研究,发现服用血管紧张素酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEIs）和血管紧张素受体抑制剂（angotensin recepter blockers,ARBs）的病人比未服用该类药物的病人患乳腺癌和肺癌的风险更低。随后另一部分的学者进行相关研究却未得到类似结果。这个不同的研究结果引起众多学者的关注,在这些研究中除了入选患者种族、人群及服药周期等不同因素外,由于受到基因测序技术的限制,大部分的患者未做个体基因表达谱测定,导致患者个体基因差异未做考虑。在后续的研究中发现,在肾素血管紧张素系统中一个关键受体AT1R（type-1 angiotensin II）其编码的基因AGTR1在多个肿瘤中发生异质性表达,并且高表达该基因会引起多种肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等的不良预后,但是AGTR1基因在肝细胞癌中的表达及对肝癌的影响却少有报道。我们对TCGA数据库中全部3个肝细胞癌的临床374例RNA芯片数据的AGTR1基因表达与临床生存期的相关性进行分析,提示AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用的基础上,进行了AGTR1在肝细胞癌中的表达及其对肝癌影响的研究。第一部分AGTR1差异表达对肝细胞癌发展的影响选用Oncomine数据库中全部3个肝细胞癌的临床347例RNA芯片数据,发现AGTR1基因在这3个数据集中均位于过表达基因前5%,并在部分肝细胞癌患者中出现高表达。同时在TCGA数据库中我们对全部374例的肝细胞癌临床样本进行差异分析,发现AGTR1表达前80位和后80位的样本AGTR1的相对表达具有显著差异,进一步结合数据库中肝细胞癌样本预后数据,采用Kaplan-Meier生存分析,发现低表达组患者的生存期较高表达组显著延长。以上结果说明,AGTR1在部分肝细胞癌患者中呈高表达,且这种高表达与患者的生存期相关,由此初步推断AGTR1在肝细胞癌的发生发展中可能具有重要作用。为了证明AGTR1基因在肝细胞癌发生、发展及转移中的作用,我们筛选低表达AGTR1的SMMC-7721和BEL-7404细胞,对它们进行过表达AGTR1的改造,同时选择高表达AGTR1的MHCC-97H细胞进行干扰表达的改造,体内外研究AGTR1对肝细胞癌的作用。结果发现AGTR1在体外实验中具有促进肿瘤细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭及迁移的作用,而在体内试验中能加速裸鼠皮下成瘤试验的肿瘤形成及生长。此外,采用含有luciferine片段的载体构建sh-AGTR1和sh-nc,稳筛低表达AGTR1的MHCC-97H细胞,采用小动物活体成像系统,在体观察不同AGTR1表达量的MHCC-97H细胞在脾脏肝转移模型中的转移情况,发现抑制AGTR1可以降低MHCC-97H肿瘤细胞的脾脏肝转移能力。第二部分:AGTR1差异表达影响肝细胞癌生长的作用机制研究为了探讨AGTR1促进HCC细胞生长、转移作用机制,我们采用Westen Blot方法检测过表达和干扰表达AGTR1对HCC细胞信号通路的影响,发现过表达HCC细胞中的AGTR1可以促进JAK2、STAT3、ERK的磷酸化,抑制AGTR1则可以降低相应分子的磷酸化。且JAK2特异性抑制剂AG490可以抑制AGTR1介导的HCC细胞的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力。此外,我们先用TCGA数据库中374例肝细胞癌患者的mRNA芯片数据,对VEGF与AGTR1进行相关性分析,发现随着AGTR1的表达量的上升,VEGF与AGTR1表达相关性也随之上升。对低表达AGTR1的SMMC

关键词： 间充质干细胞   miR-99a-5p   miR-425-5p   增殖   分化   细胞因子  

摘要： 背景和目的:间充质干细胞(MSCs)是一种具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞,其来源广泛,可在多种组织和器官中获取。Toll样受体(TLRs)是一类天然免疫受体,在固有免疫和获得性免疫过程中发挥重要的作用。研究发现TLRs能够参与调节MSCs迁移、分化及细胞因子分泌等多种生物学功能。micro RNA(mi RNA)是一类长约19～23个核苷酸的微小RNA,通过与靶基因结合,导致靶基因降解或翻译抑制,对靶基因进行负向调控。micro RNA参与调节MSCs的多种生物学特性,如增殖、迁移、分化、调亡等结果。目前已在多种细胞类型中证实TLRs可调节mi RNA的表达,反之mi RNA又可作为重要的调节分子调控TLR信号。因此,我们相信TLRs相关mi RNA更有可能调控MSCs的生物学特性。本课题组前期证实了BM-MSCs表达TLR2和TLR4,且利用TLR2激动剂(Pam3CSK4)或TLR4激动剂(LPS)刺激BM-MSCs能够影响后者的迁移、分化、细胞因子分泌及造血支持等生物学特性,并采用Illumine高通量测序检测了Pam3CSK4或LPS刺激前后BM-MSCs胞内micro RNA表达谱的变化。根据检测结果,我们选取了刺激后明显上调的mi R-99a-5p和明显下调的mi R-425-5p,并探讨这两种mi RNA对BM-MSCs生物学特性的影响。方法:分离培养健康志愿者的BM-MSCs,用mi R-99a-5p、mi R-425-5p类似物或抑制物转染细胞,q RT-PCR(定量实时聚合酶链式反应)检测转染效率。通过增殖实验、分化实验、酶联免疫吸附法(ELISA)检测mi R-99a-5p、mi R-425-5p对BM-MSCs增殖、分化、细胞因子分化能力的影响。结果:与对照组相比,转染mi R-99a-5p、mi R-425-5p类似物后,相应的mi RNA表达量能显著上调(P<0.0001),反之转染mi R-99a-5p、mi R-425-5p抑制物后,相应的mi RNA表达下调(P<0.0001)。在成骨分化实验中,成骨诱导结束后茜素红染色镜下观察结果提示:过表达mi R-99a-5p能促进BM-MSCs成骨分化;低表达mi R-99a-5p抑制其成骨分化。后氯化十六烷基吡啶溶解茜素红染料,酶标仪检测562 nm处吸光度值,得到与镜下观察相同的结果。而在成脂分化试验中,转染mi R-99a-5p类似物或抑制物对BM-MSCs成脂分化无明显影响。另外,过表达或低表达mi R-425-5p对BM-MSCs成脂和成骨分化均无明显影响。EILSA检测结果提示BM-MSCs分泌TGF-β1浓度值明显高于IL-1β、GM-CSF。过表达mi R-99a-5p促进BM-MSCs分泌TGF-β1(P<0.05),低表达mi R-99a-5p对BM-MSCs分泌TGF-β1无明显影响。过表达mi R-425-5p可抑制GM-CSF分泌(P<0.05),而低表达mi R-425-5p对GM-CSF无明显影响。结论:*** R-99a-5p、mi R-425-5p对BM-MSCs增殖能力无明显影响。2.过表达mi R-99a-5p促进BM-MSCs成骨分化,而对成脂分化无明显影响。3过表达mi R-99a-5p促进BM-MSCs分泌TGF-β1,过表达mi R-425-5p抑制BM-MSCs分泌GM-CSF,说明mi R-99a-5p、mi R-425-5p对BM-MSCs细胞因子分泌有一定影响。***2/4相关mi RNA影响BM-MSCs生物学特性。

关键词： 胶质瘤   长链非编码RNA   Wnt/β-catenin信号通路   增殖   侵袭  

摘要： 研究背景与目的:胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,呈浸润性生长,其增殖性和侵袭性随肿瘤恶性程度的提高而增加,导致目前难以从组织学层面将肿瘤全切,胶质瘤术后复发率也居高不下。近年来,胶质瘤的全基因组检测取得了重大突破,基因芯片已证实在不同类型、不同级别胶质瘤中LncRNA出现差异性表达,并与胶质瘤的恶性程度及生物学行为密切相关。这为揭示胶质瘤发生发展的内在机制以及后续的基因治疗提供了新的思路。LncRNA-CCAT2参与恶性肿瘤的基因调控过程,如结直肠癌中发现其可通过上调MYC、miR–17–5p及miR–20a来促进肿瘤的生长及转移[2];食道癌组织、乳腺癌组织、胃癌组织中也发现LncRNA-CCAT2表达量较正常组织明显增高。但是在胶质瘤中是否也存在LncRNA-CCAT2的表达变化,它是否参与调控胶质瘤的生物学特征,值得深入探究。Wnt/β-catenin信号通路已被证实参与调控胶质瘤,激活后促进β-catenin核内转位,可促进胶质瘤细胞的增殖及后续的肿瘤形成。LncRNA-CCAT2是否通过调节Wnt/β-catenin信号通路而影响胶质瘤的发生发展也需要进一步探讨。因此,本研究旨在通过临床大样本的数据分析胶质瘤中LncRNA-CCAT2与Wnt/β-catenin信号通路的相关性,并验证其是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路而影响胶质瘤的生物学功能。通过本项研究,以期确定LncRNA-CCAT2/Wnt/β-catenin轴在调控胶质瘤中发挥的作用,并为胶质瘤的治疗提供新策略,为新药的开发及胶质瘤的分子靶向治疗提供新的理论依据。研究内容和方法:本研究中所有胶质瘤组织及其邻近正常组织均来源于南昌大学第二附属医院神经外科;人脑胶质母细胞瘤细胞系U87-MG和U251均购自中科院上海细胞库。***-CCAT2与Wnt/β-catenin通路蛋白在脑胶质瘤中差异性表达1.1 qRT-PCR技术检测胶质瘤组织及其对应的瘤旁正常组织中LncRNA-CCAT2的表达水平,结合胶质瘤的WHO病理级别确定LncRNA-CCAT2与胶质瘤恶性程度的关系。1.2 Western blot检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、c-Myc、MMP-7、CyclinD1在胶质瘤组织及其对应的瘤旁正常组织中的表达水平,结合胶质瘤的WHO病理级别确定Wnt/β-catenin通路与胶质瘤恶性程度的关系。***-CCAT2对胶质瘤细胞增殖、迁移及体内成瘤的实验研究2.1建立慢病毒转染稳定敲低LncRNA-CCAT2的U87-MG和U251胶质瘤细胞。2.2 CCK8实验检测胶质瘤细胞增殖功能的变化;平板克隆实验检测胶质瘤细胞的克隆形成能力;流式细胞术检测胶质瘤细胞的细胞周期分布,计算细胞的增殖指数;Transwell迁移实验检测胶质瘤细胞的迁移能力。2.3裸鼠皮下成瘤实验检测胶质瘤细胞的体内肿瘤形成能力。***-CCAT2调控Wnt/β-catenin信号通路影响胶质瘤生长的实验研究3.1双重荧光素酶报告基因检测LncRNA-CCAT2对胶质瘤细胞LEF/TCF启动子的调控作用。3.2 Western blot检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、c-Myc、MMP-7、CyclinD1在胶质瘤细胞中的表达水平。结果:***-CCAT2与Wnt/β-catenin通路蛋白在脑胶质瘤中差异性表达1.1 qRT-PCR结果显示LncRNA-CCAT2表达水平与胶质瘤有着密切关系,胶质瘤中存在LncRNA-CCAT2明显上调的现象。进一步分析患者的临床数据（年龄、性别、肿瘤大小）及胶质瘤WHO级别与LncRNA-CCAT2表达水平的关系发现LncRNA-CCAT2与胶质瘤级别密切相关。qRT-PCR结果也显示LncRNA-CCAT2在高级别胶质瘤中的表达水平明显高于低级别胶质瘤与正常脑组织,且LncRNA-CCAT2在低级别胶质瘤中的表达水平同样明显高于正常脑组织。1.2 Western blot结果显示高级别胶质瘤、低级别胶质瘤与正常脑组织中总β-catenin表达量无明显差异,而细胞核内β-catenin的表达量在高级别胶质瘤中明显高于低级别胶质瘤与正常脑组织,低级别胶质瘤细胞核内β-catenin表达量也高于正常脑组织。c-Myc蛋白表达量在高级别胶质瘤中明显高于低级别胶质瘤与正常脑组织,低级别胶质瘤中c-Myc蛋白表达量也高于正常脑组织。MMP-7蛋白表达量在高级别胶质瘤中与低级别胶质瘤无明显差异,但在高级别胶质瘤与低级别胶质瘤均明显高于正常脑组织。CyclinD1蛋白表达量在高级别胶质瘤中明显高于低级别胶质瘤与正常脑组织,低级别胶质瘤中Cycli

关键词： 肝癌   肾素血管紧张素系统   Mas受体   细胞增殖   G蛋白  

摘要： 目的：本文主要探讨过表达G蛋白偶联受体Mas和敲除G蛋白偶联受体Mas对人肝癌细胞生物学作用的影响，揭示Mas受体在肝癌发生和进展中的作用机制，旨在进一步探究Mas为预防和治疗肝癌提供新思路。　　方法：通过慢病毒转染构建过表达Mas受体的肝癌细胞株，运用实时荧光定量PCR实验在RNA水平鉴定过表达Mas细胞株，运用蛋白质免疫印迹实验在蛋白水平鉴定过表达Mas细胞株;通过CRISPR-Cas9技术构建敲除Mas受体的肝癌细胞株，运用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹实验鉴定敲除Mas细胞株;通过CCK8实验分析Mas基因对肝癌细胞在增殖能力方面的变化;通过Transwell侵袭迁移实验、细胞划痕愈合实验分析其对肝癌细胞侵袭、迁移的影响;通过软琼脂集落形成实验检测其对肝癌细胞克隆形成的影响;运用流式细胞仪检测其对肝癌细胞周期、凋亡的影响。　　结果：（1）成功构建过表达Mas肝癌细胞株，实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹分析表明，Mas在RNA和蛋白质水平上的表达明显增强。（2）成功构建敲除Mas肝癌细胞株，实时荧光定量pcr和蛋白质免疫印迹法显示，在RNA和蛋白质水平上，Mas的表达受到抑制。（3）CCK8实验结果显示，Mas基因过表达抑制肝癌细胞的增殖能力（P＜0.05）;敲除Mas的肝癌细胞增殖能力无明显变化（P＞0.05）;（4）Transwell侵袭、迁移实验结果提示，过表达Mas的肝癌细胞侵袭能力减弱（P＜0.05），迁移能力减弱（P＜0.05）;敲除Mas的肝癌细胞侵袭、迁移能力无明显改变（P＞0.05）;（5）流式细胞仪检测细胞周期结果显示，过表达Mas肝癌细胞与正常肝癌细胞相比，G1期明显减少（P＜0.05），S期明显增多（P＜0.05），G2/M期变化不明显（P＞0.05），结合CCK8增殖结果提示，过表达Mas肝癌细胞周期被阻滞在S期;（6）软琼脂集落形成实验结果表明，Mas基因过表达抑制肝癌细胞克隆形成能力（P＜0.05）;敲除Mas基因肝癌细胞克隆能力无明显改变（P＞0.05）;（7）细胞划痕愈合实验提示，Mas基因过表达抑制肝癌细胞迁移能力（P＜0.05）;敲除Mas基因肝癌细胞迁移能力无明显改变（P＞0.05）;结论：过表达Mas对肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移、克隆形成能力均有抑制作用，对细胞凋亡能力有促进作用;敲除Mas对肝癌细胞影响和改变不明显。