关键词:
髓核细胞
细胞退变
细胞凋亡
兔
摘要:
目的通过兔髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)自然传代培养退变模型,观察不同代次NPCs生物学特性。方法取6~8周龄新西兰大白兔(体质量1.5~2.5 kg)胸腰椎节段髓核组织,采用酶消化法获取原代NPCs,计为P0代;胰蛋白酶消化法传代获取第1~3代NPCs,依次计为P1、P2、P3代。倒置相差显微镜观察各代NPCs形态特征;膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶双染流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞荧光染色法和Western blot检测各代NPCs的缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、聚集蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)表达。结果 NPCs形态从P0代的三角形、多角形、多边形逐渐向P3代的梭形变化,细胞体积变大,含特征性空泡细胞逐渐消失,细胞生长倍增时间延长。P0~P3代兔NPCs细胞凋亡率分别为5.47%±0.91%、13.77%±2.42%、33.46%±1.82%、38.76%±1.50%,随着培养代数增加,细胞凋亡率明显增加,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞荧光染色示,随着培养代数的增加,HIF-1α、Ⅱ型胶原和Aggrecan荧光强度逐渐减小,MMP-2荧光强度逐渐增加。Western blot检测示,HIF-1α蛋白相对表达量在P0代较高,P1代有升高趋势,而后逐渐降低,各代次间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Ⅱ型胶原蛋白相对表达量从P0~P3代逐渐降低,各代次间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Aggrecan蛋白相对表达量从P0~P2代逐渐降低,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);P2代与P3代间比较差异无统计学意义(P>0.05)。MMP-2蛋白相对表达量在P3代有明显升高,除P0代与P2代间比较差异无统计意义(P>0.05)外,其余各代次间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论自然传代培养法可成功构建NPCs退变模型,退变时细胞形态变化、凋亡增加,细胞合成代谢减慢,分解代谢加快。