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关键词： 膀胱癌   STK32C   TCGA数据库   免疫组化   细胞生物学功能   mTOR信号通路  

摘要： 目的:膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤,发病率仅次于前列腺癌。虽然膀胱癌的诊治方法在不断改善,但是高复发及进展率仍是影响临床膀胱癌治疗的重要障碍。近些年,多种生物分子被研究证实在膀胱癌的进展中起作用并与患者的预后相关。但是,目前这些分子作为生物靶点的治疗效果及生物标志物的预测作用并不理想。我们的前期实验发现,一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,STK32C的基因在TCGA数据库膀胱癌组织中呈现高表达,并猜测其可能在膀胱癌中起一定的作用。因此,本实验重点探讨了:STK32C蛋白在膀胱癌患者癌组织及癌旁的表达情况。通过体外细胞实验,探讨了STK32C对膀胱癌T24和5637细胞增殖,凋亡,侵袭和转移能力的影响。进一步,初步探究了STK32C在膀胱癌中发挥作用的可能的分子通路。方法:1.首先,收集了TCGA数据库中414例膀胱癌患者的m RNA表达数据及患者的临床信息,通过对数据进行整合分析,对STK32C基因在膀胱癌组织及癌旁的表达量进行比较。2.从临床获得膀胱癌患者术后膀胱癌及癌旁组织16例,通过免疫组化方法对组织样本的STK32C蛋白的表达量进行评定。比较STK32C在患者癌组织及癌旁中表达的差异。3.选用人膀胱癌细胞株T24和5637细胞,慢病毒载体转染,构建STK32C稳定敲低的细胞系,空载体转染作为阴性对照。用q RT-PCR和western blot实验方法从基因转录及翻译水平分别检测STK32C的敲低效率。通过细胞MTT实验、平板克隆实验、划痕实验和Transwell实验等方法,分析STK32C的敲低对膀胱癌细胞增殖、集落形成、迁移及侵袭能力的影响。4.通过String蛋白相互作用在线数据库,寻找与STK32C蛋白可能存在相互关联的蛋白分子。使用western blot方法,检测敲低STK32C蛋白,对膀胱癌细胞m TOR信号通路关键性分子m TOR及p-m TOR蛋白表达量的影响。结果:1.从TCGA数据库414例膀胱癌分析发现,STK32C m RNA在414例膀胱癌组织中表达明显高于癌旁组织(P<0.01)。19例癌及癌旁组织配对病例中发现,STK32C m RNA在癌组织中仍然高表达(P<0.01)。12例肿瘤样本中STK32C m RNA相对于癌旁组织高表达,1例下降,6例无明显变化。2.免疫组化分析临床膀胱癌病例发现,相对于癌旁正常组织,STK32C蛋白在膀胱癌组织中明显高表达(P<0.01)。且有随着肿瘤病理分期恶化,STK32C表达量增高的趋势。3.通过构建膀胱癌T24及5637细胞STK32C稳定敲低及阴性转染对照组,对比两组细胞体外生物学功能。结果发现,与对照组相比,敲低STK32C,膀胱癌细胞的增殖能力、集落形成能力、迁移能力及T24细胞侵袭能力都受到明显的抑制(P<0.05)。4.通过String蛋白相互作用在线预测工具,我们发现了10个与STK32C蛋白可能相关的蛋白分子。分析这些蛋白,我们发现m TOR与STK32C的关联性最大。利用western blot方法,我们发现敲低STK32C,m TOR及p-m TOR蛋白的表达量明显下降。结论:STK32C在膀胱癌中存在高表达,并可能与患者肿瘤的病理分期和分级相关。在体外,敲低STK32C,可显著抑制膀胱癌细胞的增殖、集落形成能、迁移及侵袭能力。同时,敲低STK32C蛋白,可降低m TOR及p-m TOR蛋白的表达。因此,我们认为STK32C通过影响m TOR蛋白的表达及磷酸化,调节m TOR通路的活性,从而参与膀胱癌细胞的生物学功能。这可能为临床膀胱癌患者的靶向治疗或标记物的研究提供了新思路。

关键词： 软骨细胞   富血小板浓缩物   白介素-1β  

摘要： [目 的]通过体外培养兔髁突软骨细胞后构建炎症模型,探讨富血小板浓缩物对炎症微环境下兔髁突软骨细胞生物学特性的影响。[方 法]通过酶预消化组织块贴壁法体外培养兔原代髁突软骨细胞。将第三代兔髁突软骨细胞以10ng/ml IL-1β刺激24h后,使用含有10%富血小板浓缩物(PRP和Ⅰ-PRF)的培养液干预培养24h,通过CCK-8检测炎症微环境下富血小板浓缩物对兔髁突软骨细胞增殖的影响、通过RT-PCR检测炎症微环境下富血小板浓缩物对兔髁突软骨细胞生物学特性的影响。[结 果]CCK-8实验结果:(1)PRP和Ⅰ-PRF能明显促进兔髁突软骨细胞的增殖(P<0.05),但两者之间差异并无统计学意义(P>0.05);(2)PRP和Ⅰ-PRF能明显促进炎症微环境下兔髁突软骨细胞的增殖(P<0.05),但两者之间差异并无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR实验结果:(1)PRP和Ⅰ-PRF对兔髁突软骨细胞中IL-1β和MMP-13表达显著抑制(P<0.05),而Aggrecan、Col2al和SOX9表达显著增强(P<0.05),PRP和Ⅰ-PRF之间差异并无统计学意义(P>0.05);(2)PRP和Ⅰ-PRF对炎症微环境下兔髁突软骨细胞中IL-1β和MMP-13表达显著抑制(P<0.05),而 Aggrecan、Col2a1 和 SOX9 表达显著增强(P<0.05),PRP 和 Ⅰ-PRF之间差异并无统计学意义(P>0.05)。[结 论](1)使用IL-1β干预培养髁突软骨细胞能成功建立髁突软骨细胞的体外炎症模型;(2)PRP和Ⅰ-PRF对兔髁突软骨细胞增殖有促进作用;(3)PRP和Ⅰ-PRF对炎症微环境下兔髁突软骨细胞的破坏有抑制作用。(4)PRP与Ⅰ-PRF对软骨细胞增殖的促进作用或对炎症微环境的抑制作用没有明显差异。

关键词： Erbin   人脐静脉内皮细胞   Smad1/5   血管新生  

摘要： 研究背景心血管疾病及其并发症是临床常见病与多发病,尽管预防,诊断和治疗干预在预防心血管疾病的策略方面取得了重大进展,但冠状动脉疾病仍然是全球范围内致死和致残的重要原因。由于并非每个人都有发生未来心血管事件(Cardiovascular Event,CVE)的相同风险,因此心血管医学的一个重要挑战就是如何准确预测发生动脉粥样硬化相关的并发症的高危人群,如急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome,ACS)。动脉粥样硬化是心血管疾病发病的病理基础,但其发病机制并不完全清楚。目前,研究动脉粥样硬化发生发展的机制从而寻找有效的干预靶点是心血管基础与临床研究的热点。国内外研究发现动脉粥样硬化形成的主流机制包括脂质浸润、慢性炎症、内皮损伤、氧化应激损伤及血流剪切力等。近年的研究发现,血管新生也是影响动脉粥样硬化发生发展的重要机制[1-4]。基于血管新生在动脉粥样硬化中的作用,对血管新生的研究也成为一个特殊的研究领域。探讨动脉粥样硬化斑块发生发展过程中血管新生的机制,寻找并干预影响血管新生的新靶点,从而预防甚至避免动脉粥样硬化性疾病的发生,是目前心血管领域的研究热点之一。内皮细胞在血管壁中发挥天然屏障功能,通过平衡释放作用于旁分泌和自分泌水平的细胞和分子成分,防止病原体入侵并维持血管完整性,在炎症、血管生成中起重要作用。血管内皮的完整性对于血液循环系统的平衡是非常重要的,血管功能障碍是动脉粥样硬化疾病的病理生理基础,内皮功能障碍可以被认为是动脉粥样硬化的起始阶段。内皮细胞代谢紊乱促成动脉粥样硬化病变的形成[5]。斑块新生血管由毛细血管网络组成,它来自外膜滋养血管并且延伸到动脉粥样硬化病变和其他类型的血管损伤的内膜层。这些斑块毛细血管的功能被认为是斑块生长和病变不稳定性的重要调节剂。一些分子通路在动脉粥样硬化和癌症的发病机制和进展中具有的类似作用,与这两种疾病有关的共同机制包括氧化应激和由此引起的细胞损伤。血管新生在动脉粥样硬化和其他心血管疾病中的作用目前还是一个尚未完全阐明的问题。目前已有诸多研究表明新血管形成有助于动脉粥样硬化病变的生长,并且是导致斑块破裂、不稳定的关键因素,预防动脉粥样硬化斑块内的血管新生有可能起到稳定易损斑块的重要作用。ErbB2(Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2,成红细胞生长白血病病毒致癌基因同源物2),在人类中也称为Her2,是表皮生长因子受体(EGFR)的重要成员之一。Erbin(ErbB2相互作用蛋白),其氨基末端含有16个富含亮氨酸的重复序列(LRR),而其羧基末端含有PDZ(PSD95/Discslarge/ZO-1)结构域终点,属于新的LAP蛋白家族成员,借PDZ结构域与ErbB2紧密结合,最早报道与ErbB2特异性相互作用[6]。据报道,Erbin在大多数人体组织中表达,特别是在脑,心脏,肾脏,肌肉和胃中表达丰富。Erbin是ErbB2/Her2的相互作用蛋白,Erbin可直接并特异性地与ErbB2/Her2相互作用,并将ErbB2/Her2定位于上皮细胞基底外侧膜。ErbB2已被证明在血管发育中起重要作用,因为ErbB2可增加血管内皮生长因子(VEGF)的合成,导致血管生成增加[7]。然而,ErbB2发挥作用的机制尚不够明确。ErbB2/Her2在细胞增殖和分化,尤其是血管生成过程中发挥极其重要的作用。ErbB2不仅能够促进VEGF的表达,导致内皮侵袭能力增加,更进一步促进血管新生;ErbB2表达于冠状血管内皮,并在冠状血管的发育过程中发挥了无可替代的作用。目前尚存在以下问题亟待探讨和解决:①目前尚不清楚Erbin是否在 管中表达;②如果Erbin在血管中表达,其具体细胞定位如何确定;③Erbin是否影响内皮细胞的生物学功能;④Erbin影响细胞生物学功能的具体信号转导通路。基于以往的研究,我们设计了目前的实验来验证Erbin和血管及内皮细胞的关系,以及Erbin对内皮细胞功能的影响,并进一步探讨其影响细胞功能的分子生物学机制或信号传递途径。研究目的以人脐静脉内皮细胞作为细胞模型,通过转染Erbin干扰慢病毒,抑制内源性Erbin的表达,观察人脐静脉内皮细胞的增殖、凋亡、迁移及成管等现象的变化,进而通过体外实验明确Erbin对人脐静脉内皮细胞作用的相关信号通路,以进一步行体内实验探究Erbin影响血管新生的机制,寻找影响血管新生与动脉粥样硬化的新靶点。研究方法(课题分为两部分):一、以人脐静脉内皮细胞为细胞模型,研究Erbin对内皮细胞增殖、凋亡、迁移和成管等生物学行为的影响1.组织免疫荧光技术检测Erbin在血管中的表达与定位取人脐带进行组织学固定,石蜡包埋后切片,进行组织免疫荧光,观测Erbin在血管中的表达与

关键词： GRK5   非小细胞肺癌   小干扰RNA(siRNA)  

摘要： [背景及目的]肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,非小细胞肺癌(non-small-cell Lung cancer,NSCLC)约占所有病例的80%,是肺癌的主要亚型。由于肺癌易复发和转移,目前放化疗和分子靶向治疗是临床上针对晚期非小细胞肺癌主要治疗方案。其中分子靶向治疗具有毒副反应小、疗效好等优点,在临床治疗中显著提高了患者的生活质量。尽管靶向药物对治疗肿瘤有着突出的优点,但分子靶向治疗只适用于特定基因突变患者,而且容易产生耐药,而对于未发现基因突变的人群,治疗上仍然是个空白区。因此探索新的药物靶点已成为目前肺癌治疗的研究热点。我们课题前期通过对非小细胞肺癌组织样本进行免疫组织化学分析发现,相比癌旁组织,G蛋白偶联受体激酶5(GRK5)在肺癌组织中高表达;与免疫组化结果一致的是,利用qRT-PCR 比较肺癌及癌旁组织GRK5的转录表达水平,以及比较正常肺上皮细胞系BEAS-2B等发现,GRK5在肺癌组织及细胞系中确实高表达;由此推测,GRK5在非小细胞肺癌中起着重要的作用。GRK5已被证明在包括癌症在内的多种病理条件的发展和进展中发挥关键作用。本研究通过检测GRK5在非小细胞肺癌细胞中的表达情况,探讨其生物学意义及相关性;同时,我们将非小细胞肺癌细胞株H1299及SPC-A1作为实验对象,通过在这两株细胞中抑制表达GRK5,观察GRK5对非小细胞肺癌H1299及SPC-A1细胞增殖、迁移、侵袭等生物学影响;探讨其分子表达的机制,以期未来将GRK5作为NSCLC诊断、治疗及预后的新靶点。[方法]1、构建抑制GRK5表达的siRNA(小干扰RNA),并用脂质体法转染H1299及SPC-A1细胞,同时设NC作为阴性对照组。2、通过荧光及qRT-PCR筛选稳定细胞转染株;用Western Blot检测抑制GRK5表达后对H1299、SPC-A1细胞中GRK5蛋白表达的影响。3、用CCK8法检测抑制GRK5表达对H1299、SPC-A1细胞增殖能力的影响。4、用Transwell小室检测抑制GRK5表达对H1299、SPC-A1细胞迁移及侵袭能力的影响。5、用细胞划痕的方法检测抑制GRK5表达对非小细胞肺癌细胞H1299、SPC-A1迁移能力的影响。[结果]1、qRT-PCR检测表明GRK5 siRNA能明显抑制H1299、SPC-A1肺癌细胞株中GRK5表达水平(p<0.05)。2、Western Blot结果表明经GRK5 siRNA转染后,GRK5蛋白表达均降低(p<0.05)。3、CCK8检测表明GRK5 siRNA转染H1299、SPC-A1肺癌细胞后细胞增殖受到显著抑制(p<0.05)。4、细胞划痕实验表明经GRK5 siRNA转染H1299、SPC-A1肺癌细胞后迁移速度明显减慢(p<0.05)。5、细胞迁移、侵袭实验表明经GRK5 siRNA转染H1299、SPC-A1肺癌细胞后迁移速度明显减慢(p<0.05)。[结论]1、GRK5在非小细胞肺癌细胞中高表达。2、抑制GRK5表达可明显抑制肺癌细胞株H1299、SPC-A1的增殖,减低其迁移速度,减弱侵袭能力,进而促进肺癌细胞H1299、SPC-A1的凋亡。3、本实验中探讨了 GRK5与非小细胞肺癌细胞生物学功能的相关性,为非小细胞肺癌治疗的新靶点提供思路。

关键词： 鼻咽癌   CDCA2   增殖   细胞周期   凋亡   周期相关蛋白  

摘要： 目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种起源于鼻咽部粘膜的恶性肿瘤。其起病隐蔽、恶性程度高、易发生转移,严重威胁患者的身心健康。大量研究发现癌基因的过度表达是鼻咽癌发生、发展的重要生物因素。近年来,研究发现细胞分裂周期相关蛋白2(Cell Devision Cycle Associated 2,CDCA2)在多种肿瘤中表达上调,且其表达上调与肿瘤的发生、发展及预后有关,但在鼻咽癌中尚未见有报道。本研究主要探讨CDCA2在鼻咽癌中的表达情况及其对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。方法:1.应用实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)和免疫组织化学(immunohistochemistry)技术检测鼻咽癌组织和鼻咽部粘膜慢性炎组织中CDCA2 mRNA和蛋白质的表达水平,分析CDCA2表达与鼻咽癌临床病理特征的关系。2.应用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测鼻咽癌细胞株HK1、HONE1、5-8F、CNE1、CNE2和CNE2Z细胞中CDCA2蛋白的表达,确定用于后续研究的细胞株。3.利用慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,敲低HK1、HONE1和5-8F细胞株中的CDCA2表达。将载有CDCA2沉默片段的慢病毒分别转染鼻咽癌细胞株HK1,HONE1和5-8F,建立实验组(HK1-shCDCA2,HONE1-shCDCA2,5-8F-shCDCA2)。转染载有空载片段的慢病毒的细胞作为阴性空载组(HK1-shCtrl,HONE1-shCtrl,5-8F-shCtrl),未作处理的细胞为空白对照组(HK1,HONE1,5-8F)。用荧光显微镜观察慢病毒感染效率,用qRT-PCR和WB法分别检测各组细胞CDCA2 mRNA和蛋白的表达情况,以确定沉默效果。4.采用CCK-8实验和细胞平板克隆形成实验来评价沉默CDCA2对HK1、HONE1和5-8F细胞增殖能力的影响。5.应用细胞划痕实验、Transwell迁移和Transwell侵袭实验来检测CDCA2表达抑制对HK1、HONE1和5-8F细胞迁移及侵袭能力的影响。6.用流式细胞技术检测各组细胞的细胞周期和凋亡情况。7.用WB检测CDCA2是否影响细胞周期相关蛋白的表达。结果:1.16例鼻咽癌组织和16例鼻咽部粘膜慢性炎组织中CDCA2mRNA的相对表达量分别为5.319±3.198,1.148±0.759。相对于鼻咽部粘膜慢性炎组织,鼻咽癌组织中CDCA2 mRNA的相对表达量明显增高,差别具有统计学意义(P<0.001)。CDCA2蛋白在鼻咽癌组织中表达的阳性率为60.47%(52/86),明显高于其在鼻咽部粘膜慢性炎组织中表达的阳性率11.76%(6/51),且其表达与肿瘤局部浸润(P=0.033)、淋巴结转移(P=0.034)有关。2.与CNE1、CNE2和CNE2Z相比,HK1、HONE1及5-8F中CDCA2的基础表达相对较高,因此本研究选择此3株细胞用于后续的体外细胞实验。3.实验组和阴性空载组的慢病毒转染效率均大于90%;与阴性空载组和空白对照组相比,CDCA2 mRNA和蛋白在实验组的表达均明显降低(P<0.001),说明成功构建了CDCA2沉默鼻咽癌细胞稳定株。***-8实验显示,敲低CDCA2表达后,HK1、HONE1以及5-8F细胞48h后的增殖能力显著降低(P<0.05)。平板克隆形成实验中,HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的克隆形成率分别为(63.733±3.859)%、(63.467±4.601)%和(41.133±2.344)%;HONE1、HONE1-shCtrl和HONE1-shCDCA2的克隆形成率分别为(44.200±3.143)%、(45.667±2.516)%和(35.200±2.553)%;5-8F、5-8F-shCtrl和5-8F-shCDCA2的克隆形成率分别为(64.667±3.113)%、(65.667±2.516)%和(53.267±2.610)%。据此,CDCA2沉默表达后,鼻咽癌细胞克隆形成能力显著降低(P<0.05)。5.沉默CDCA2表达后,未发现鼻咽癌细胞株HK1、HONE1及5-8F细胞的迁移侵袭能力发生显著变化(P>0.05)。6.用流式细胞仪检测细胞周期,实验结果显示HK1、HK1-shCtrl和HK1-shCDCA2的G0+G1期细胞比例分别为(62.380±2.868)%、(62.723±1.806)%和(69.507±2.607)%;HONE1、HONE1-shCtrl

关键词： 微课   在线教育   混合式教学   雨课堂  

摘要： 本文基于贵州医科大学医学细胞生物学实验课程开展的混合式教学实践,对基于微课视频和雨课堂的混合式教学进行了初步探析。从混合式教学设计、在线学习监督分析、现场教学环节设计、教学效果分析等几个方面进行总结、研究。文章的研究可为高校教师开展混合式教学、翻转课堂教学等提供参考。

关键词： 胶质瘤   慢病毒载体   E2F-1基因   U251细胞  

摘要： 目的:探究转录因子E2F-1对胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响。脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,占颅内原发肿瘤的50%以上,发病人群跨越不同年龄段。手术切除为主,辅助放化疗为其主要治疗方案。胶质瘤呈高浸润性生长,术后容易复发,严重威胁着患者的生存期。准确发现胶质瘤的微卫星灶,利用载体携带治疗药物或基因靶向作用于胶质瘤部位,成为近年来探索胶质瘤治疗的新方向,有望能为胶质瘤的治疗探索出更有效和精确的方法。E2F-1是转录因子E2F家族成员之一,它和异源性蛋DP1/2结合后,成为细胞周期素依赖的蛋白激酶(CDKs),是下游调控细胞周期和凋亡的重要因子。E2F-1在多种恶性肿瘤中表达异常,为肿瘤发生发展中的一个重要致病因素,但对E2F-1与脑胶质瘤的研究相对较少。本实验利用RNAi技术,敲低胶质瘤U251细胞中E2F-1基因的表达,通过MTT、Transwell实验观察U251细胞增殖能力及侵袭能力的改变。从而为E2F-1对U251细胞生物学特征的影响作用机制,以及为探索脑胶质瘤治疗新途径奠定基础。材料和方法:本研究通过对人胶质瘤U251细胞进行培养,以人胶质瘤U251细胞为研究对象,以制备完成的慢病毒介导沉默E2F-1基因使细胞低表达E2F-1蛋白,从而构建低表达E2F-1基因的胶质瘤U251细胞模型E2F-1-shRNA组、对照慢病毒参与构建阴性对照NC-shRNA组及正常培养的U251细胞作为空白对照组。通过嘌呤霉素筛选,荧光显微镜下观察转染后细胞生长状态、荧光细胞数比例,进而获得稳定转染的细胞系。通过Real-time PCR法、Western blot方法检测稳定转染表达绿色荧光的U251细胞中E2F-1 mRNA及蛋白表达量,鉴定慢病毒对E2F-1基因的敲低效果。通过MTT、Transwell实验观察低表达E2F-1基因的胶质瘤U251细胞较阴性对照组及空白对照组细胞增殖、侵袭能力的改变。本研究采用SPSS 18.0和GraphPad Prism7软件对数据进行统计分析,P<0.05表示实验所得数据具有统计学意义。结果:慢病毒转染U251细胞经嘌呤霉素筛选,在荧光显微镜下观察可发现,绿色荧光细胞可占白光视野下细胞90%以上,表明慢病毒稳定转染的细胞系构建成功。Real-time PCR、Western blot方法检测结果表明E2F-1-shRNA组的E2F-1的mRNA及蛋白表达量较NC-shRNA组和空白组明显降低(P<0.05),NC-shRNA组和空白组的mRNA及蛋白表达量无明显差异(P>0.05),表明通过RNAi技术成功构建了低表达E2F-1基因的胶质瘤U251细胞模型。MTT实验检测并绘制各组U251细胞生长曲线,发现E2F-1-shRNA组U251细胞较NC-shRNA组和空白组增殖能力显著降低(P<0.05),NC-shRNA组和空白组间无明显差异(P>0.05);Transwell实验表明E2F-1-shRNA组较NC-shRNA组和空白组细胞穿过纤维素膜孔的肿瘤细胞个数显著减少(P<0.05),NC-shRNA组和空白组细胞穿过纤维素膜孔的细胞个数无明显差异(P>0.05)。结论:靶向沉默E2F-1基因能够显著抑制胶质瘤U251细胞的体外增殖、侵袭能力。为探究转录因子E2F-1在脑胶质瘤中的作用机制以及寻找胶质瘤治疗新途径奠定基础。

关键词： 姜黄素   HepG2细胞   细胞凋亡   肝癌  

摘要： 【目的】　　本实验采用姜黄素药液作用于人肝癌HepG2细胞，探讨姜黄素抑制人肝癌HepG2细胞增殖的作用机制，从而为姜黄素在临床治疗肝癌方面提供理论依据。　　【方法】　　采用不同浓度的姜黄素药液作用于人肝癌HepG2细胞，并设纯DMEM培养HepG2细胞作为空白对照组。　　（1）应用MTT法检测细胞抑制率，并且绘制曲线图，筛选姜黄素最佳的作用浓度及时间;（2）用流式细胞仪检测姜黄素各浓度组对HepG2细胞凋亡的影响;（3）采用流式细胞仪检测姜黄素各浓度组对HepG2细胞周期的影响;（4）通过细胞划痕实验检测姜黄素对HepG2细胞迁移能力的影响;（5）采用免疫细胞化学SABC法检测相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3的表达，相关周期蛋白Cyclin-A1、Cyclin-B1的表达，以及VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白表达。　　【结果】　　（1）MTT结果表明，姜黄素可以有效地抑制人肝癌HepG2细胞增殖，并呈药物浓度依赖性，空白对照组，20，40，60μmol/L的姜黄素药液组48h的抑制率分别是：0、42.90%、55.68%、66.76%，姜黄素药液组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05）。　　（2）细胞凋亡结果表明：姜黄素对人肝癌HepG2细胞具有明显的诱导凋亡作用，空白对照组，20，40，60μmol/L的姜黄素药液组48h的凋亡率分别是：0.3%、18.0%、24.7%、86.9%，姜黄素药液组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05）。免疫细胞化学结果显示：空白对照组Bcl-2呈强阳性表达，而Bax、Caspase-3低表达，随着姜黄素药液浓度的增加，HepG2细胞内Bcl-2蛋白表达减少，Bax、Caspase-3蛋白的表达增多，提示姜黄素可能通过下调Bcl-2，上调Bax、Caspase-3的表达进而诱导HepG2细胞凋亡;（3）细胞周期结果表明：姜黄素药液处理的HepG2细胞在S期阻滞，空白对照组，20μmol/L的姜黄素药液组，其S期的百分比分别为24.11%、32.68%，姜黄素组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05）。免疫细胞化学结果显示：20μmol/L的姜黄素组HepG2细胞内Cyclin-A1蛋白的表达与空白对照组相比明显减少，而Cyclin-B1的表达在姜黄素药液作用前后无明显变化，提示姜黄素可能通过下调Cyclin-A1的表达阻滞HepG2细胞在S期，进而抑制HepG2细胞增殖;（4）细胞划痕实验结果表明：姜黄素药液可以有效的抑制人肝癌HepG2细胞迁移，随着药液浓度的增高，划痕愈合率逐渐降低，而空白对照组愈合的最为明显，姜黄素组与空白对照组比较有明显差异（p＜0.05），说明姜黄素药液可以抑制HepG2细胞的迁移;（5）免疫细胞化学SABC法检测蛋白VEGF、HIF-1α及STAT3的表达表明：随着姜黄素药液浓度的增加，HepG2细胞内VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白的表达与空白对照组相比均显著减少，说明姜黄素可能通过下调VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白的表达抑制HepG2细胞的增殖。　　【结论】　　（1）姜黄素对人肝癌HepG2细胞具有明显的抑制增殖作用;（2）姜黄素通过下调Bcl-2，上调Bax、Caspase-3蛋白的表达诱导HepG2细胞凋亡;（3）姜黄素通过下调CyclinA1蛋白的表达使HepG2细胞周期阻滞于S期;（4）姜黄素可以抑制HepG2细胞的迁移;（5）姜黄素通过下调VEGF、HIF-1α及STAT3蛋白的表达，发挥抑制HepG2细胞增殖作用。

关键词： 急性髓细胞白血病   ADP核糖基化因子6   造血干细胞   增殖   耐药   迁移  

摘要： 背景和目的:MLL-AF9急性髓细胞白血病恶性程度高、化疗效果差、预后不良,且具有独特的基因表达谱。阐明MLL-AF9急性髓细胞白血病发病机制,寻找特异和有效的靶向治疗方法,是目前研究的热点。ADP核糖基化因子6(ARF6)是一种分子量小的GTP结合蛋白,在非造血细胞肌动蛋白骨架形成及细胞膜内吞中发挥重要作用。其在造血干细胞内发挥的作用尚不清楚,本研究以此为出发点初步探讨了ARF6对造血干细胞(HSCs)的调控及其对MLL-AF9诱导的急性髓细胞白血病(AML)细胞生物学功能的影响。方法:1.构建突变活化型ARF6小鼠模型(ARF6-Q67L),流式细胞仪分析野生型(WT)小鼠和ARF6-Q67L小鼠骨髓和脾脏的LSK的比例。2.包装MLL-AF9(MA)逆转录病毒侵染ARF6-Q67L小鼠造血干细胞,建立MLL-AF9诱导的ARF6-Q67L小鼠AML细胞系。3.骨髓移植实验观察ARF6活化后MLL-AF9白血病细胞对小鼠生存期的影响。4.在体外通过克隆形成实验、吉姆萨染色实验、Transwell实验和AnnexinⅤ检测,探究ARF6活化后对MLL-AF9AML细胞生物学功能的影响。5.通过Western Blot检测ARF6活化后对ERK和AKT信号传导的影响,RT-PCR检测p19的mRNA表达水平。结果:1.在稳态下,ARF6活化后不影响小鼠骨髓HSCs和各分化阶段细胞的比例,在应激条件下,5-FU注射14天后,ARF6-Q67L小鼠骨髓中HSCs的数量明显受损,脾脏中HSCs的数量明显升高。***6活化后,缩短了白血病小鼠生存时间。***结果显示MA-ARF6-Q67L实验组克隆数量少于MA-WT对照组。4.吉姆萨染色结果显示MA-ARF6-Q67L实验组与MA-WT对照组相比没有出现细胞核分化。5.体外迁移实验结果显示MA-ARF6-Q67L实验组细胞迁移数量是MA-WT对照组的2.8倍。***-ARF6-Q67L实验组显示较强的Ara-c耐药性。*** Blot检测显示MA-ARF6-Q67L实验组细胞内ERK、AKT磷酸化水平与对照组相比明显升高。***-PCR检测结果显示MA-ARF6-Q67L实验组p19的mRNA表达量增多。结论:综上所述,本研究提出ARF6活化后参与了小鼠造血系统损伤后的恢复,并成功建立了MLL-AF9诱导的小鼠白血病细胞系,为以后研究靶向治疗白血病提供了新的方向,主要结论如下:1.在稳态下,ARF6并不影响骨髓造血干细胞的增殖与分化,但在骨髓损伤修复过程中,ARF6通过负调控骨髓造血干细胞的增殖,正调控脾脏造血干细胞的增殖参与应激下骨髓抑制后造血系统的恢复。2.体内实验证实ARF6加速MLL-AF9 AML的发展,体外实验证实ARF6抑制MLL-AF9 AML细胞的克隆形成能力,促进MLL-AF9 AML细胞的迁移和耐药。

关键词： 神经干细胞   脑老化   D-半乳糖   SOX2   BMI-1  

摘要： 目的建立D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型,人参皂苷干预老化神经干细胞以后,量化神经干细胞内维持生物学特性的两个内源转录因子SOX2和BMI-1的表达变化,探讨人参皂苷维持和增强老化神经干细胞生物学特性的作用。方法1选取孕15-17天大鼠,采用机械分离胚鼠海马NSCs的方法获得原代NSCs,之后传代培养。对NSCs进行特异性标志物Nestin鉴定,使用免疫荧光染色的方法。2CCK-8法筛选D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度和最佳时间。设置6个不同时间点(6h、12h、24h、48h、60h、72h),种6板,在每个板内设Dmem组、对照组以及不同剂量组(5、10、15、20、25、30、35、40mg/ml),之后加CCK-8,1-4h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度,整理数据,绘制标准曲线。3使用课题组前期用MTS法检测NSCs细胞增殖能力筛选出的人参皂苷最佳剂量(lug/ml)及最佳作用时间(24h),采用CCk-8法检测人参皂苷对D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型中老化神经干细胞的影响。4使用Western Blot法检测人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内SOX2和BMI-1蛋白的表达情况,实验分为正常组、老化组和老化加人参皂苷组。首先对三组NSCs细胞提取蛋白,按照蛋白提取试剂盒操作指示进行操作,制备蛋白样品,SDS-PAGE电泳,敷一抗二抗,最后使用凝胶成像仪检测目标蛋白,使用Image Pro Plus7.0软件对条带结果进行分析统计。5免疫荧光及细胞核染色检测正常神经干细胞,老化神经干细胞及人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内特异性标志物Nestin,以及SOX2和BMI-1的表达情况。实验分为正常组、老化组、老化加人参皂苷组,在细胞培养、造模、加人参皂苷并进行前期的免疫荧光常规实验操作以后,加入相应的Nestin、BMI-1、SOX2一抗二抗,加DAPI染色,封片后,在激光共聚焦显微镜下观察荧光标记的细胞并拍照并通过Image Pro Plus7.0图像分析软件分析其阳性细胞数、面密度和光密度。结果1成功分离培养胚鼠海马NSCs,并经免疫荧光证明其表达NSCs特异性标记物Nestin,可进行原代培养和传代培养,纯度为95%以上NSCs。2 D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度剂量是35mg/ml,D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳时间是24h。3采用CCk-8法检测人参皂苷对D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型中老化神经干细胞的影响与正常组相比,老化组吸光值明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。同老化组相比,人参皂苷组吸光值明显上升,差异具有统计学意义(P<0.01)。4Western Blot法检测人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内SOX2和BMI-1蛋白的表达情况神经干细胞正常组、老化组和人参皂苷组内的SOX2和BMI-1蛋白均阳性表达。神经干细胞老化组与正常组相比,SOX2表达明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),神经干细胞人参皂苷组与老化组相比,SOX2表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。神经干细胞老化组与正常组相比,BMI-1表达明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),神经干细胞老化加人参皂苷组与老化组相比,BMI-1表达明显升高,差异具有统计学意义(p<0.01)。5免疫荧光及细胞核染色检测正常神经干细胞,老化神经干细胞及人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内特异性标志物Nestin,以及SOX2基因和BMI-1基因的表达情况NSCs正常组、NSCs老化组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、SOX2、BMI-1阳性表达。与NSCs正常组相比,NSCs老化组的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和阳性细胞数均显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01);与NSCs老化组相比,NSCs人参皂苷组的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和阳性细胞数均增加,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)结论D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度剂量是35mg/ml,最佳时间是24h。人参皂苷可以促进老化NSCs中SOX2和BMI-1表达增加,证明人参皂苷能维持和增强衰老神经干细胞生物学特性,与人参延缓脑老化的临床作用密切相关。