关键词：
牙髓干细胞
低氧
细胞生物学特性
成牙本质向分化
摘要：
研究背景牙髓炎和根尖周炎是目前口腔医学领域在临床上除龋病外较为常见的疾病,牙髓受损后由于其特殊的组织学特征难以自行恢复。目前国际上较为公认的针对这类患牙的治疗方式,是在无菌的前提下对患牙进行根管治疗。患牙失去牙髓组织后由于其血运的丧失和免疫系统的失效,其脆性增强,同时抗折性能也会降低。因此,其更为理想的治疗方式应该包含牙髓重建,即再生性牙髓治疗。人牙髓干细胞(Human dental pulp stem cells,hDPSCs)是一类间充质干细胞的衍生细胞,由于其较强的增殖能力以及易于获得的特性,被认为是用于牙髓再生治疗的一类理想种子细胞。目前为止,大多数学者对于牙髓干细胞的体外培养微环境为21%氧浓度微环境即常氧。然而牙髓干细胞在体内所处的微环境为低氧。氧气浓度直接影响细胞增殖能力、多向分化潜能、凋亡水平以及损伤修复等生物学进程。因此,为进一步研究牙髓干细胞在体内的生物学特性,本研究选用不同低氧浓度于体外培养人牙髓干细胞,并探讨其对人牙髓干细胞生物学特性的影响。材料与方法1人牙髓干细胞的分离、培养和鉴定本实验使用18-22岁来我院就诊的患者需要拔除的健康完整、且不患有牙体牙周疾病的阻生第三磨牙或因正畸拔除的双尖牙,采用改良组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物。对培养的人牙髓干细胞进行成骨、成软骨、成脂诱导14d后,分别使用茜素红S、阿里新兰及油红O染色剂染色,置于倒置显微镜下观察其分化能力。2不同低氧浓度对人牙髓干细胞生物学特性的影响不同低氧浓度微环境下培养人牙髓干细胞,利用细胞免疫荧光技术检测人牙髓干细胞的细胞骨架及细胞核的形态。取第2-5代人牙髓干细胞,使用CCK8方法以进一步检测人牙髓干细胞的细胞增殖能力,计算数据并绘制细胞生长曲线并利用流式细胞仪检测细胞周期。倍比稀释法将人牙髓干细胞接种于培养皿中,利用平板集落形成实验检测细胞单克隆形成情况并计算克隆形成率。同时,利用琼脂糖凝胶电泳法检测细胞DNA凋亡小体形成情况。3不同低氧浓度对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响Trizol法分别提取不同低氧浓度条件下培养对照组和成牙本质诱导组细胞总RNA和全蛋白,NanoDrop ND-1000紫外分光光度计用以检测RNA浓度与纯度后,qRT-PCR检测各组人牙髓干细胞成牙本质向分化相关基因的表达变化,Western Blot检测与成牙本质相关蛋白的表达变化,并在成骨诱导14 d后进行茜素红S及ALP染色检验不同低氧浓度对成牙本质向分化能力的影响。4统计学分析本实验数据采用采用graphpad prism 5统计软件进行数据分析,统计数据均以均数±标准差表示,采用Two-way ANOVA分析,先进行Levene方差齐性检验,方差不齐式用Welch校正;组间多重比较,方差齐性时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett T3检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1人牙髓干细胞的分离、培养、鉴定成功分离培养人牙髓干细胞,流式细胞仪检测显示细胞表达间充质干细胞表面标记物,造血干细胞表面标记物表达呈阴性。经成骨、成软骨及成脂向诱导后可见大量矿化结节、大量蓝染粘多糖聚集和橘红色脂滴聚集。2不同低氧浓度对人牙髓干细胞生物学特性的影响免疫荧光结果显示,三组细胞形态有差异,其中,3%低氧下培养的牙髓干细胞具有更大的细胞核,而5%和21%的细胞核大小无明显差异。CCK8结果显示,三组细胞均有较强的细胞增殖能力。流式细胞仪检测细胞周期结果示,三组细胞周期的S/G/M分期比率较高。利用平板集落形成实验结果为均可形成克隆。其中,3%低氧克隆形成率大于常氧进而大与于5%低氧。脂糖凝胶电泳实验结果显示,不同氧浓度低氧环境下提取的细胞DNA较完整,无明显的DNA破碎片段。3不同低氧浓度对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响相对于常氧微环境,5%低氧微环境可使人牙髓干细胞的成牙本质向分化相关基因及蛋白的表达上调,而3%氧浓度微环境使hDPSCs的成牙本质向分化相关基因及蛋白的表达下调。不同低氧浓度微环境条件下培养的细胞对照组未发现明显的矿化结节形成。而各矿化组可见散在红褐色的矿化结节,其中,3%低氧条件下培养的矿化组矿化结节体积最小且数量最少,5%低氧条件下培养的矿化组矿化结节体积最大且数量最多。结论1人牙髓组织经组织块酶消化法获得的细胞为成纤维样细胞形态、呈长梭形,细胞贴壁生长,同时增殖速度较快。可认为是来源于成人恒牙牙髓组织的一类间充质干细胞,具有多向分化的潜能,可以认为是hDPSCs;2不同氧浓度的微环境条件,对hDPSCs的形态、增殖、细胞周期和克隆形成能力均有较大的影响,而细胞凋亡能力则没有明显的差异;3相对于21%氧浓度微环境,5%氧浓度微环境可促进hDPSCs的成牙本质向分化,而3%氧浓度微环境抑制hDPSCs的成牙本
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